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【中图分类号】R446.5【文献标识码】B【文章编号】1632-5281（2015）5
【摘要】目的：探讨头孢西丁耐药葡萄球菌（MRS）的检测方法及其耐药性特点。方法：收集临床分离出的葡萄球菌株207株，采用PCR法检测其mecA基因，判断是否为MRS，并按照CLSI/NCCLS标准对头孢西丁以及苯唑西林采用K-B法进行检测，并检测MRS对于临床常用抗生素的耐药性特征。结果：本组207株葡萄球菌中，132株为金黄色葡萄球菌，75株为凝固酶阴性葡萄球菌，检测mecA基因显示，MRSA占56.82%（75/132），MRCNS占62.67%（47/75）；头孢西丁以K-B法检测MRSA的特异性与敏感性均为100%，对MRCNS的特异性与敏感性分别为100.00%、97.87%；MRS对万古霉素与方新诺明不耐药，对其余抗生素的耐药率均显著高于MSS（P<0.05）。结论：头孢西丁K-B法检测MRS操作简便且结果可靠，临床应用价值较高。同时MRS具有较高的感染风险与耐药性，对于多种抗生素村咋多重耐药，加强临床耐药性检测非常必要。
【关键词】头孢西丁；葡萄球菌；mecA基因；耐药性
葡萄球菌是一种常见医院感染病原菌，近年来，其检出率呈上升趋势，是医院感染防控工作的重点内容[1]。耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）是最为重要的葡萄球菌之一，具有多重耐药性，容易引起医院感染暴发流行，增加患者的病死率[2]。正确掌握MRA的鉴定和耐药性分析技术，对于临床用药具有重要意义。本研究采用头孢西丁以及苯唑西林纸片扩散法（K-B）对我院207株葡萄球菌进行药敏试验，并分析了其对于10种临床常用抗生素所具有的耐药性，现报道如下：
1材料与方法
1.1菌株来源
收集2014年1月至6月，我院临床分离所得葡萄球菌207株，均剔除了统一患者相同部位获得的重复性菌株，包括132株金黄色葡萄球菌，31株表皮葡萄球菌，24株腐生葡萄球菌，20株溶血葡萄球菌。
1.2仪器与主要试剂
检测仪器为Bio-Rad icycler荧光定量PCR系统，PCR扩增所用试剂均由上海生工工程公司生产；葡萄球菌凝集试剂以及鉴定试条均由法国生物梅里埃公司提供；抗生素药敏纸片均由Oxoid公司生产；药敏试验培养基（MH）由天津金章生物技术公司生产；抗生素药物包括头孢唑啉（CZO）、头孢西丁（FOX）、苯唑西林（OX）、氨苄西林（AMP）、万古霉素（VA）、红霉素（ERY）、克林霉素（CLI）、阿米卡星（AMK）、复方新诺明（SXT）、利福平（RA）、左氧氟沙星（LVX）以及环丙沙星（CIP）。
1.3方法
1.3.1药敏试验
参照CLSI/NCCLS标准提出的操作规程进行药敏试验，测定各菌株对于10种抗生素药敏纸片的敏感性，标准菌株为ATCC25923金黄色葡萄球菌。参照CLSI/NCCLS标准进行药敏结果判定。
1.3.2 mecA基因检测
常规进行细菌培养，选择经2次纯化以后的新鲜单个菌落1-2个，采用置于100μl双蒸水中充分混匀，采用上海生工细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取，以此作为PCR模板。采用PCR技术进行mecA基因扩增，即将1μl DNA模板加入20μl反应体系（含有2.5μl 10×PCR buffer，2.5μl 25mmol/L Mg2+、0.5μl 10mmol/L dNTP，5μl DNA模板、12μl无菌双蒸水）中，热循环参数设置：于95℃下进行预变性5min，改为94℃反应30s，然后降低为55℃下反应1min，再升高温度至72℃下反应1min，循环30次以后，于72℃下延伸处理10min，以ATCC25923作为扩增阴性对照。取PCR产物10μl点入含有EB的20g/L的琼脂糖凝胶之中，电泳缓冲液选择0.5×TBE，常规电泳处理4min，然后在凝胶成像系统中进行结果观察和成像。
1.4统计学分析
葡萄球菌对于抗生素的耐药率分析采用WHO NET5软件进行统计，统计学处理采用SPSS18.0软件进行分析，经χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 mecA基因检测结果
本组207株葡萄球菌经mecA基因检测显示，75株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），占56.82%（75/132）；47株为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS），占62.67%。
2.2 K-B检测MRS与MecA基因检测结果比较
132株金黄色葡萄球菌中，75株为mecA阳性，经苯唑西林K-B法检出74株阳性，阳性率为98.67%，假阴性率为1.33%；应用头孢西丁K-B法检测75株阳性，阳性率为100%，假阴性率为0.00%，敏感性和特异性均为100%。
75株凝固酶阴性葡萄球菌中，47株mecA基因阳性，经苯唑西林K-B法检出45株阳性，阳性率为95.74%，假阴性率为4.26%，1例为假阳性；应用头孢西丁K-B法检测46株阳性，阳性率为97.87%，假阴性率为2.13%，无假阳性病例，特异性为100%。
2.3耐药性分布
将207株葡萄球菌根据mecA阳性情况，122株阳性为MRS，85株阴性为MSS，统计菌株对于10种抗生素的耐药性显示，所有葡萄球菌均对万古霉素敏感，其中，MRS对于其他9种抗生素的耐药率均>50%，而MSS除红霉素以及氨苄西林以外，对于其他抗生素的耐药率均<50%。除万古霉素以及复方新诺明以外，MRS与MSS对于其余8种抗生素所具有的耐药率差异显著（P<0.05），见表1。
3讨论
MRS是诱发医院感染、加重病情的主要原因，早期检测并积极采取干预措施非常重要。目前，mecA基因PCR扩增检验是临床评价MRS的金标准，但临床实践表明，该技术的操作时间较长、难度较大、成本较高，难以在实验室广泛开展。近年来，CLSI/NCCL提出采用头孢西丁K-B法能够快速有效地检测MRS，并且较传统苯唑西林K-B法更具优势。本研究结果显示，苯唑西林K-B法对于MRSA的特异性为100%，敏感性为98.67%，应用头孢西丁的特异性与敏感性均为100%。两种方法对MRSA的检测效能相当，表明了头孢西丁K-B法具有良好的应用价值。此外，研究结果还显示，头孢西丁K-B法对于MRCNS的敏感性达97.87%，特异性达100%，均较苯唑西林K-B法的95.74%和96.55%提高，且与mecA基因检测具有较高的一致性（99.18%），证实了头孢西丁K-B法对于MRSA和MRCNS均具有较高的检出率。分析207株葡萄球菌的耐药性特点发现，所有菌株均对万古霉素敏感，MRS均表现出多重耐药性的特点，其对于氨苄西林以及头孢唑啉均不敏感，而对其余各抗生素的耐药率均>50%，耐药情况较为严重。而MSS仅对红霉素以及氨苄西林表现出较高的耐药性，对其余药物的耐药性均<50%，MRS对于万古霉素以及复方新诺明以外的8种抗生素耐药率均显著高于MSS，这对于临床检测与用药具有重要指导意义。
参考文献
[1]田月如，王艳艳等.纸片法头孢西丁敏感的青霉素耐药葡萄球菌分析[J].中华检验医学杂志，2010，33（12）：1150-1154.
[2]吴李培，吴蓉等.头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林葡萄球菌[J].实用医学杂志，2009，25（16）：2771-2772.
【摘要】目的：探讨头孢西丁耐药葡萄球菌（MRS）的检测方法及其耐药性特点。方法：收集临床分离出的葡萄球菌株207株，采用PCR法检测其mecA基因，判断是否为MRS，并按照CLSI/NCCLS标准对头孢西丁以及苯唑西林采用K-B法进行检测，并检测MRS对于临床常用抗生素的耐药性特征。结果：本组207株葡萄球菌中，132株为金黄色葡萄球菌，75株为凝固酶阴性葡萄球菌，检测mecA基因显示，MRSA占56.82%（75/132），MRCNS占62.67%（47/75）；头孢西丁以K-B法检测MRSA的特异性与敏感性均为100%，对MRCNS的特异性与敏感性分别为100.00%、97.87%；MRS对万古霉素与方新诺明不耐药，对其余抗生素的耐药率均显著高于MSS（P<0.05）。结论：头孢西丁K-B法检测MRS操作简便且结果可靠，临床应用价值较高。同时MRS具有较高的感染风险与耐药性，对于多种抗生素村咋多重耐药，加强临床耐药性检测非常必要。
【关键词】头孢西丁；葡萄球菌；mecA基因；耐药性
葡萄球菌是一种常见医院感染病原菌，近年来，其检出率呈上升趋势，是医院感染防控工作的重点内容[1]。耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）是最为重要的葡萄球菌之一，具有多重耐药性，容易引起医院感染暴发流行，增加患者的病死率[2]。正确掌握MRA的鉴定和耐药性分析技术，对于临床用药具有重要意义。本研究采用头孢西丁以及苯唑西林纸片扩散法（K-B）对我院207株葡萄球菌进行药敏试验，并分析了其对于10种临床常用抗生素所具有的耐药性，现报道如下：
1材料与方法
1.1菌株来源
收集2014年1月至6月，我院临床分离所得葡萄球菌207株，均剔除了统一患者相同部位获得的重复性菌株，包括132株金黄色葡萄球菌，31株表皮葡萄球菌，24株腐生葡萄球菌，20株溶血葡萄球菌。
1.2仪器与主要试剂
检测仪器为Bio-Rad icycler荧光定量PCR系统，PCR扩增所用试剂均由上海生工工程公司生产；葡萄球菌凝集试剂以及鉴定试条均由法国生物梅里埃公司提供；抗生素药敏纸片均由Oxoid公司生产；药敏试验培养基（MH）由天津金章生物技术公司生产；抗生素药物包括头孢唑啉（CZO）、头孢西丁（FOX）、苯唑西林（OX）、氨苄西林（AMP）、万古霉素（VA）、红霉素（ERY）、克林霉素（CLI）、阿米卡星（AMK）、复方新诺明（SXT）、利福平（RA）、左氧氟沙星（LVX）以及环丙沙星（CIP）。
1.3方法
1.3.1药敏试验
参照CLSI/NCCLS标准提出的操作规程进行药敏试验，测定各菌株对于10种抗生素药敏纸片的敏感性，标准菌株为ATCC25923金黄色葡萄球菌。参照CLSI/NCCLS标准进行药敏结果判定。
1.3.2 mecA基因检测
常规进行细菌培养，选择经2次纯化以后的新鲜单个菌落1-2个，采用置于100μl双蒸水中充分混匀，采用上海生工细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取，以此作为PCR模板。采用PCR技术进行mecA基因扩增，即将1μl DNA模板加入20μl反应体系（含有2.5μl 10×PCR buffer，2.5μl 25mmol/L Mg2+、0.5μl 10mmol/L dNTP，5μl DNA模板、12μl无菌双蒸水）中，热循环参数设置：于95℃下进行预变性5min，改为94℃反应30s，然后降低为55℃下反应1min，再升高温度至72℃下反应1min，循环30次以后，于72℃下延伸处理10min，以ATCC25923作为扩增阴性对照。取PCR产物10μl点入含有EB的20g/L的琼脂糖凝胶之中，电泳缓冲液选择0.5×TBE，常规电泳处理4min，然后在凝胶成像系统中进行结果观察和成像。
1.4统计学分析
葡萄球菌对于抗生素的耐药率分析采用WHO NET5软件进行统计，统计学处理采用SPSS18.0软件进行分析，经χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 mecA基因检测结果
本组207株葡萄球菌经mecA基因检测显示，75株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），占56.82%（75/132）；47株为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS），占62.67%。
2.2 K-B检测MRS与MecA基因检测结果比较
132株金黄色葡萄球菌中，75株为mecA阳性，经苯唑西林K-B法检出74株阳性，阳性率为98.67%，假阴性率为1.33%；应用头孢西丁K-B法检测75株阳性，阳性率为100%，假阴性率为0.00%，敏感性和特异性均为100%。
75株凝固酶阴性葡萄球菌中，47株mecA基因阳性，经苯唑西林K-B法检出45株阳性，阳性率为95.74%，假阴性率为4.26%，1例为假阳性；应用头孢西丁K-B法检测46株阳性，阳性率为97.87%，假阴性率为2.13%，无假阳性病例，特异性为100%。
2.3耐药性分布
将207株葡萄球菌根据mecA阳性情况，122株阳性为MRS，85株阴性为MSS，统计菌株对于10种抗生素的耐药性显示，所有葡萄球菌均对万古霉素敏感，其中，MRS对于其他9种抗生素的耐药率均>50%，而MSS除红霉素以及氨苄西林以外，对于其他抗生素的耐药率均<50%。除万古霉素以及复方新诺明以外，MRS与MSS对于其余8种抗生素所具有的耐药率差异显著（P<0.05），见表1。
3讨论
MRS是诱发医院感染、加重病情的主要原因，早期检测并积极采取干预措施非常重要。目前，mecA基因PCR扩增检验是临床评价MRS的金标准，但临床实践表明，该技术的操作时间较长、难度较大、成本较高，难以在实验室广泛开展。近年来，CLSI/NCCL提出采用头孢西丁K-B法能够快速有效地检测MRS，并且较传统苯唑西林K-B法更具优势。本研究结果显示，苯唑西林K-B法对于MRSA的特异性为100%，敏感性为98.67%，应用头孢西丁的特异性与敏感性均为100%。两种方法对MRSA的检测效能相当，表明了头孢西丁K-B法具有良好的应用价值。此外，研究结果还显示，头孢西丁K-B法对于MRCNS的敏感性达97.87%，特异性达100%，均较苯唑西林K-B法的95.74%和96.55%提高，且与mecA基因检测具有较高的一致性（99.18%），证实了头孢西丁K-B法对于MRSA和MRCNS均具有较高的检出率。分析207株葡萄球菌的耐药性特点发现，所有菌株均对万古霉素敏感，MRS均表现出多重耐药性的特点，其对于氨苄西林以及头孢唑啉均不敏感，而对其余各抗生素的耐药率均>50%，耐药情况较为严重。而MSS仅对红霉素以及氨苄西林表现出较高的耐药性，对其余药物的耐药性均<50%，MRS对于万古霉素以及复方新诺明以外的8种抗生素耐药率均显著高于MSS，这对于临床检测与用药具有重要指导意义。
参考文献
[1]田月如，王艳艳等.纸片法头孢西丁敏感的青霉素耐药葡萄球菌分析[J].中华检验医学杂志，2010，33（12）：1150-1154.
[2]吴李培，吴蓉等.头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林葡萄球菌[J].实用医学杂志，2009，25（16）：2771-2772.