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中图分类号 R944.9 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）09-1074-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.10
摘 要 目的：制备欧前胡素柔性脂质体凝胶（IMP-UDLs-Gel），并对其进行质量评价。方法：在单因素考察的基础上，以12 h累积透过量（Q12 h）为评价指标，采用正交试验法对IMP-UDLs-Gel处方中的卡波姆940比例、甘油比例和丙二醇比例进行考察，筛选最优处方，并对最优处方所制备的IMP-UDLs-Gel进行质量评价。结果：IMP-UDLs-Gel最优处方为卡波姆940比例1%、甘油比例15%、丙二醇比例10%。所制得的IMP-UDLs-Gel的Q12 h为（11.543±0.241） μg/cm2;外觀为乳白色、半透明状;粒径为（93.13±1.68） nm，多分散系数为0.268±0.012，Zeta电位为（-24.96±1.99） mV;pH为7.32±0.03;黏度为（45.37±1.27） g·s;稳态流量为（0.727±0.002） μg·h/cm2，滞后时间为（4.358±0.175） h，表观渗透系数为1.392×10-3 cm/h，且具有良好的物理稳定性和光稳定性。结论：建立的制备方法稳定可行，所制备的IMP-UDLs-Gel具有良好的黏附性、稳定性和透皮性。
关键词 欧前胡素;柔性脂质体;凝胶;处方优化;制备;质量评价;透皮性
Preparation and Quality Evaluation of Imperatorin Ultradeformable Liposomes Gel
CUI Xuehui1，2，CHEN Shihong1，2，QIU Jindi1，2，BAN Junfeng1，2，YANG Nannan1，2，NI Qingchun3，PAN Zhaoyan4，XIE Qingchun1，2，CHEN Yanzhong1，2，LYU Zhufen1，2（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery Systems/New Drug R&D Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China;2.R&D Innovation Team for Controlled-release Microparticle Drug Delivery System/Guangdong Provincial Engineering Center of Topical Precision Drug Delivery System， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China;3.Guangzhou General Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China;4.Xinhua College of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510520， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Imperatorin ultradeformable liposomes gel （IMP-UDLs-Gel）， and to evaluate its quality. METHODS： Based on single factor test， using 12 h accumulative penetration amount （Q12 h） as evaluation index， the proportion of carbomer 940， glycerol and propyl glycol in formulation of IMP-UDLs-Gel were investigated by orthogonal test. The optimal formulation was screened. The quality of IMP-UDLs-Gel prepared with the optimal formulation was evaluated. RESULTS： The optimal formulation of IMP-UDLs-Gel included carbomer 940 proportion of 1%， glycerol proportion of 15% and propyl glycol proportion of 10%. Q12 h of IMP-UDLs-Gel was （11.543±0.241） μg/cm2; the appearance was milky white and translucent; the particle size was （93.13±1.68） nm， PDI was 0.268±0.012， Zeta potential was （-24.96±1.99） mV; pH was 7.32±0.03; viscosity was （45.37±1.27） g·s; steady flow was （0.727±0.002） μg·h/cm2， lag time was （4.358±0.175） h， apparent permeability coefficient was 1.392×10-3 cm/h， and it has good physical and optical stability. CONCLUSIONS： The preparation method is stable and feasible， and the prepared IMP-UDLs-Gel has good adhesion， stability and transdermal property. KEYWORDS Imperatorin; Ultradeformable liposomes; Gel; Formulation optimization; Preparation; Quality evaluation; Transdermal characteristics
脂质体自被开发以来，广泛应用于医药、化妆品及食品等领域。Cevc G等[1]首次提出具有变形性的柔性脂质体，更容易透过皮肤。虽然脂质体在经皮给药系统中具有显著优势，但在外界环境如pH、温度等发生变化时，会产生聚集、药物泄露、磷脂氧化水解等问题[2]。将脂质体分散在凝胶基质中制成脂质体凝胶给药系统，可同时发挥二者特性：脂质体对药物起到缓控释作用，避免突释效应，减小毒副作用;凝胶骨架可以保护脂质体的完整性，提高其稳定性[3-4]。
欧前胡素（Imperatorin，IMP）是一种线性呋喃香豆素类化合物，主要存在于白芷等伞形科植物中[5]，具有抗炎镇痛[6-7]、抗菌[8]、抗癫痫[9]、抗肿瘤[10]及保护心血管[11]等药理作用。但IMP水溶性较差，口服吸收率低且易代谢，生物利用度低[12]，难以达到治疗浓度，限制了其在临床上的应用。本研究前期将IMP制备成柔性脂质体，增加了药物的透皮吸收，但混悬液状态在经皮给药中存在不便，故拟将IMP柔性脂质体（IMP-UDLs）溶液凝胶化以方便给药。基于此，笔者现对IMP柔性脂质体凝胶（IMP-UDLs-Gel）的制备工艺及其质量进行研究，为开发IMP透皮给药系统提供试验基础。
1 材料
1.1 仪器
e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）;CP225D型十万分之一电子分子天平（德国Sartorius公司）;L-100XPRE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;SHZ-D型循环真空泵（巩义市裕华仪器有限公司）;JY88-LIN型超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）;SK7200LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;JEM-2100型透射电子显微镜（日本电子株式会社）;Delso Nano C型纳米粒度/Zeta电位分析仪（美国Beckman Coulter公司）;TA.XT Plus型物性测试仪（英国Stable Micro Systems公司）;TK-12B型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）;THZ-84型水浴恒温振荡器（金坛市宏华仪器厂）;FE28型pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;LS3000型光照试验仪（北京天星科仪科技有限公司）。
1.2 药品与试剂
IMP对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110826-201616，纯度：98%）;IMP原料药（上海历鼎生物技术有限公司，批号：160118，纯度：97%）;大豆卵磷脂（江苏曼氏生物科技股份有限公司，批号：150919）;吐温20（批號：20180301）、吐温80（批号：20190915）均购自天津市大茂化学试剂厂;卡波姆940（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10112074）;甘油（批号：20181101）、丙二醇（批号：20161110）均购自天津市致远化学试剂有限公司;胆固醇（批号：D160508）、三乙醇胺（批号：B1511023）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;常用有机试剂为分析纯，液相色谱法所用试剂均为色谱纯，水为蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 IMP的含量测定方法
2.1.1 色谱条件 参考相关文献方法[13]设置条件：色谱柱为YMC C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇-水（70 ∶ 30，V/V）;流速为1.0 mL/min;检测波长为297 nm;柱温为30 ℃;进样量为20 μL。
2.1.2 溶液的制备 （1）IMP对照品溶液的制备：精密称取IMP对照品10.23 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得质量浓度为0.102 3 mg/mL对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：精密称取IMP-UDLs-Gel样品100 mg于10 mL量瓶中，加入适量甲醇后超声（频率：53 kHz，功率：350 W）使溶解，冷却至室温后用甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。（3）空白UDLs-Gel溶液的制备：精密称取空白UDLs-Gel样品100 mg于10 mL量瓶中，按“2.1.2（2）”项下方法制备。
2.1.3 专属性考察 取空白UDLs-Gel溶液、IMP对照品溶液及供试品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果，IMP的保留时间为9.3 min左右，峰形对称性良好，且溶剂与辅料对其色谱峰无干扰，表明方法专属性较好。色谱图见图1。
2.1.4 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下IMP对照品溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度为0.102 3、0.511 5、1.023、5.115、10.23、20.46 μg/mL的系列对照品线性溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以IMP峰面积（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，得回归方程为y=48 929x-260.2（R2=0.999 9）。结果表明，IMP质量浓度在0.102 3～20.46 μg/mL范围内线性关系良好。
2.1.5 定量限与检测限考察 取“2.1.2”项下IMP对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以信噪比10 ∶ 1和3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果显示，IMP的定量限为0.10 μg/mL，检测限为0.025 μg/mL。
2.1.6 精密度考察 取“2.1.2”项下IMP对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示，IMP峰面积的RSD为0.38%（n=6），表明仪器精密度良好。 2.1.7 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，IMP峰面积的RSD为1.27%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
2.1.8 重复性试验 取IMP-UDLs-Gel适量，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，IMP峰面积的RSD为0.48%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率试验 称取已知IMP含量的IMP-UDLs-Gel，共9份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液后，分别加入相当于IMP-UDLs-Gel中IMP含量的80%、100%、120%的IMP对照品，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算加样回收率。结果，IMP的平均加样回收率为97.33%～101.03%，RSD为0.06%～0.59%（n=9），详见表1。
2.2 IMP-UDLs-Gel的制备
2.2.1 IMP-UDLs的制备 采用薄膜分散法[13]制备IMP-UDLs。称取IMP 15 mg和适量大豆卵磷脂（与药物质量比为1 ∶ 65）、胆固醇（与药物质量比为1 ∶ 6），溶于适量10 mg/mL吐温20乙醇溶液中，使用旋转蒸发仪以55 ℃水浴减压挥去乙醇，以磷酸盐缓冲液（PBS，pH为7.4）水化30 min，然后冰浴条件下超声（频率：70 kHz，功率：350 W）10 min，灭菌，即得。
2.2.2 空白UDLs的制备 除不加入IMP外，其余同“2.2.1”项下方法操作，制备空白UDLs。
2.2.3 IMP-UDLs-Gel的制备 参考文献方法[14]，称取处方量的卡波姆940、甘油、丙二醇及水于烧杯中，搅拌均匀，放置过夜使其充分溶胀，然后加三乙醇胺调pH至6.8～7.0得初始凝胶。将初始凝胶与“2.2.1”项下IMP-UDLs按1 ∶ 1（m/m）混合，搅拌均匀，即得。
2.2.4 空白UDLs-Gel 除用“2.2.2”项下空白UDLs代替IMP-UDLs外，其余同“2.2.3”项下方法操作，制备空白UDLs-Gel。
2.3 单因素考察
参考相关文献[15]发现，凝胶基质、促渗剂和保湿剂的种类及比例对IMP-UDLs-Gel的制备有一定影响，因此选择这几个因素进行单因素试验。
2.3.1 凝胶基质的筛选 考察以卡波姆940、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和羟丙甲纤维素（HPMC）为基质对IMP-UDLs-Gel的影响，分别配制1%的卡波姆940、CMC-Na和HPMC水溶液，放置过夜使其充分溶胀。其中，卡波姆940溶液用三乙醇胺调pH至7.0左右。以颜色、成形性和涂展性為指标，确定最优基质。结果，卡波姆940成形性好、易涂抹，因此初步确定其作为凝胶基质。凝胶基质的筛选结果见表2。
2.3.2 卡波姆940浓度的筛选 选取不同比例（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的卡波姆940作为凝胶基质，加入10%甘油、10%丙二醇，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel。以IMP在离体皮肤12 h的累积透过量（Q12 h）[13，16]为指标，筛选卡波姆比例范围。Qn计算公式为：Qn=（CnV0+[∑][i=1][n-1]CiVs）/A[式中，Qn表示单位累积透过量 （μg/ cm2）;Cn表示各个取样时间点的药物浓度（μg/mL）;Ci表示取样时间点的前一时间点的药物浓度（μg/mL）;V0表示接收池体积（mL）;Vs表示接收液取样体积（mL），A表示扩散池的有效透过面积（cm2）]。结果，当卡波姆940比例为0.5%时，凝胶难以成形;随卡波姆940比例增加，IMP在离体皮肤上的Q12 h降低;当卡波姆940比例为1.5%时，IMP在离体皮肤上的Q12 h明显降低，故选取卡波姆940比例为0.75%、1%和1.25%进行下一步研究。卡波姆940比例筛选结果见图2。
2.3.3 促渗剂种类的筛选 选取常用促渗剂氮酮、丙二醇和薄荷醇进行考察。固定卡波姆940比例为1%，甘油比例为10%，分别加入3%的氮酮、丙二醇和薄荷醇，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel。以IMP在离体皮肤的Q12 h为评价指标，筛选促渗剂种类。结果，丙二醇与薄荷醇促渗效果相当，薄荷醇在水凝胶中的溶解度较低，因此选择丙二醇作为凝胶的促渗剂。促渗剂种类筛选结果见图3。
2.3.4 丙二醇比例的筛选 固定卡波姆940比例为1%、甘油比例为10%，加入不同比例（1%、2%、5%、10%）的丙二醇，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs- Gel。以IMP在离体皮肤的Q12 h为评价指标，筛选促渗剂浓度。结果，随促渗剂浓度的增加，促渗效果增强，但当促渗剂比例达到5%时促渗效果增加缓慢，故选取丙二醇比例为5%、7.5%、10%进行下一步研究。丙二醇比例筛选结果见图4。
2.3.5 保湿剂种类及其比例的筛选 选取甘油和聚乙二醇-400（PEG-400）这2种保湿剂进行比较。固定卡波姆940比例为1%、丙二醇比例为10%，分别加入不同比例（5%、10%、15%）的甘油和PEG-400，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel，以失水率（S）为评价指标，筛选保湿剂种类及其比例。参考文献方法[17-18]测定S：称定空白量瓶质量M0，然后加入一定质量的IMP-UDLs-Gel，称定总质量M，再将量瓶放入55 ℃烘箱中干燥，每隔1 h取出称定质量，记为Mi。S计算公式为：S=（M-Mi）/（M-M0）×100%。以时间（t）为横坐标、S为纵坐标，绘制S-t曲线，并计算终点失水率。不同保湿剂种类及其比例的S-t曲线见图5。 结果显示，甘油的终点失水率大于PEG-400，说明甘油的保湿效果比PEG-400好。随甘油用量的增加，失水率减小;当甘油比例为10%～15%时，其保湿效果较好，故选取甘油比例为10%、12.5%、15%进行下一步研究。
2.4 处方优化试验
2.4.1 正交试验 根据单因素考察结果，选取卡波姆940比例（A）、甘油比例（B）和丙二醇比例（C）为正交试验考察因素，每个因素选取3个水平，采用L9（33）正交表设计试验，以IMP在离体皮肤上的Q12 h为评价指标确定最优处方。因素与水平表见表3，正交试验设计及结果见表4，方差分析结果见表5。
2.4.2 结果分析 由表4和表5结果可知，各因素对IMP-UDLs-Gel的影响程度为C>B>A。由方差分析结果可知，因素C对Q12 h有显著影响（P<0.1），因此确定最优处方为A2B3C3，即卡波姆940比例为1%，甘油比例为15%，丙二醇比例为10%。
2.4.3 验证试验 根据优化的处方比例，取适量卡波姆940、甘油、丙二醇和水置于烧杯中，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel，平行制备3批，测定并计算IMP在离体皮肤上的Q12 h。结果，3批IMP-UDLs-Gel在离体皮肤上IMP的Q12 h为（11.543±0.241） μg/cm2，RSD为2.09%（n=3），表明优化后的处方稳定可行。
2.5 IMP-UDLs-Gel的质量评价
2.5.1 外观及性状观察 取“2.4.3”项下最优处方制备的IMP-UDLs-Gel适量，于黑色背景下观察。结果，IMP-UDLs-Gel为乳白色、半透明、均匀细腻的半固体制剂，详见图6。
2.5.2 粒径分布及Zeta电位 取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel适量，加水稀释，摇匀，采用纳米粒度/Zeta电位分析仪测定其粒径和Zeta电位，平行测定3次。结果，IMP-UDLs-Gel的粒徑为（93.13±1.68） nm，多分散系数（PDI）为0.268±0.012，Zeta电位为（-24.96±1.99） mV。
2.5.3 透射电镜观察 取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel适量，加水稀释后，用2%磷钨酸溶液负染，滴于铜网上，自然晾干，在透射电镜下观察。结果，IMP-UDLs-Gel中IMP脂质体呈均匀球形，详见图7。
2.5.4 pH值 取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs- Gel于烧杯中，加50 mL水稀释，测定其pH值。平行3份操作。结果，IMP-UDLs-Gel的pH为7.32±0.03。
2.5.5 凝胶的质构特性 参考相关文献方法[19]，分别取10 g“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel和按同法制备的空白UDLs-Gel于测试杯底，并保持表面平整，选择质构仪中的单次下压分析模式，使用P/0.5圆柱型探头，设置预测速度为1.5 mm/s、测试及测后速度均为1.0 mm/s、压缩距离为15 mm、触发力为5 g，测定胶凝强度、硬度和黏性。将皮肤组织粘合在P/10圆柱形探头上，设置预测速度为0.5 mm/s、测试及测后速度为0.1 mm/s、触发力为3 g、测定停留时间为10 min、返回距离为10 mm，测定生物黏附力和黏附功。结果，与空白UDLs-Gel比较，IMP-UDLs-Gel的胶凝强度与硬度较低，黏附功和黏度较高，说明IMP-UDLs-Gel具有良好的黏附性。IMP- UDLs-Gel的质构特性见表6。
2.5.6 稳定性试验 （1）离心稳定性。取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel于EP管中，平行3份，以3 000 r/min离心30 min，观察其分层情况。（2）光稳定性。取适量“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel密封于透明西林瓶中，于4 500 lx、25 ℃条件下放置0、5、10 d观察其外观，并测定IMP含量。（3）温度稳定性。取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel于西林瓶中，遮光密封，分别于4、25、60 ℃下放置0、5、10 d后观察其外观，并测定IMP含量。结果，3批样品均无分层现象，具有良好的物理稳定性;光照10 d后IMP-UDLs-Gel中IMP的含量下降不超过5%;在4 ℃和25 ℃条件下放置不同时间后，IMP-UDLs- Gel中IMP的含量下降均未超过5%;在60 ℃条件下放置不同时间后，IMP-UDLs-Gel颜色逐渐由乳白色变为黄色，IMP含量下降超过5%。由此可知，IMP-UDLs- Gel具有良好物理稳定性和光稳定性，详见表7。
2.5.7 IMP-UDLs-Gel的透皮性能考察 取适量“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel，进行离体皮肤透过试验。平行3份操作。以Qn为纵坐标、时间（t）为横坐标绘制Qn-t曲线，并进行拟合，拟合方程的斜率为稳态流量，截距为滞后时间。然后根据公式[表观渗透系数=稳态流量/C0，C0为IMP在IMP-UDLs-Gel中的含量（μg/g）]计算表观渗透系数。结果，IMP-UDLs-Gel的Q12 h为（11.632±0.271） μg/cm2，拟合方程为y=0.727x+3.168，稳态流量为（0.727±0.002） μg·h/cm2，滞后时间为（4.358±0.175） h，表观渗透系数为1.392×10-3 cm/h，表明IMP-UDLs- Gel的透皮性能良好。IMP-UDLs-Gel的Qn-t曲线见图8。
3 讨论
IMP是水不溶性药物，在肠胃中不易吸收且易代谢，生物利用度很低，因此考虑将其制成经皮给药制剂，但限于其不易透过角质层，故直接经皮给药也不易吸收。脂质体制剂具有较好的生物相容性，更容易透过皮肤角质层。基于此，本课题拟将药物包裹在类脂结构载体中，再将其制成凝胶，弥补单一制剂方法的不足，并对所得IMP-UDLs-Gel的质量及透皮特性进行研究。 凝胶基质、保湿剂及促渗剂的含量对凝胶的透皮性能均有影响。由单因素试验和正交试验可知，IMP- UDLs-Gel的最优处方为卡波姆940比例1%、甘油比例15%、丙二醇比例10%。验证试验所制得的IMP-UDLs- Gel的Q12 h为（11.543±0.241） μg/cm2。质量评价结果显示，其外观为乳白色、半透明状，粒径为（93.13±1.68） nm，PDI为0.268±0.012，Zeta电位为（-24.96±1.99）mV，pH为7.32±0.03（接近于人体皮肤的pH），且其黏附性较好。稳定性试验结果表明，IMP-UDLs-Gel在常温或低温状态下稳定性较好，而温度较高时会加快药物降解，降低药物含量。透皮性能考察结果表明，IMP- UDLs-Gel具有良好的透皮性。
综上，本研究成功优化处方并制备了IMP-UDLs- Gel;该制剂具有良好的黏附性、稳定性和透皮性，可为后续IMP-UDLs-Gel的开发应用提供参考。
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（收稿日期：2019-11-24 修回日期：2020-03-13）
（编辑：唐晓莲）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.10
摘 要 目的：制备欧前胡素柔性脂质体凝胶（IMP-UDLs-Gel），并对其进行质量评价。方法：在单因素考察的基础上，以12 h累积透过量（Q12 h）为评价指标，采用正交试验法对IMP-UDLs-Gel处方中的卡波姆940比例、甘油比例和丙二醇比例进行考察，筛选最优处方，并对最优处方所制备的IMP-UDLs-Gel进行质量评价。结果：IMP-UDLs-Gel最优处方为卡波姆940比例1%、甘油比例15%、丙二醇比例10%。所制得的IMP-UDLs-Gel的Q12 h为（11.543±0.241） μg/cm2;外觀为乳白色、半透明状;粒径为（93.13±1.68） nm，多分散系数为0.268±0.012，Zeta电位为（-24.96±1.99） mV;pH为7.32±0.03;黏度为（45.37±1.27） g·s;稳态流量为（0.727±0.002） μg·h/cm2，滞后时间为（4.358±0.175） h，表观渗透系数为1.392×10-3 cm/h，且具有良好的物理稳定性和光稳定性。结论：建立的制备方法稳定可行，所制备的IMP-UDLs-Gel具有良好的黏附性、稳定性和透皮性。
关键词 欧前胡素;柔性脂质体;凝胶;处方优化;制备;质量评价;透皮性
Preparation and Quality Evaluation of Imperatorin Ultradeformable Liposomes Gel
CUI Xuehui1，2，CHEN Shihong1，2，QIU Jindi1，2，BAN Junfeng1，2，YANG Nannan1，2，NI Qingchun3，PAN Zhaoyan4，XIE Qingchun1，2，CHEN Yanzhong1，2，LYU Zhufen1，2（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery Systems/New Drug R&D Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China;2.R&D Innovation Team for Controlled-release Microparticle Drug Delivery System/Guangdong Provincial Engineering Center of Topical Precision Drug Delivery System， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China;3.Guangzhou General Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China;4.Xinhua College of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510520， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Imperatorin ultradeformable liposomes gel （IMP-UDLs-Gel）， and to evaluate its quality. METHODS： Based on single factor test， using 12 h accumulative penetration amount （Q12 h） as evaluation index， the proportion of carbomer 940， glycerol and propyl glycol in formulation of IMP-UDLs-Gel were investigated by orthogonal test. The optimal formulation was screened. The quality of IMP-UDLs-Gel prepared with the optimal formulation was evaluated. RESULTS： The optimal formulation of IMP-UDLs-Gel included carbomer 940 proportion of 1%， glycerol proportion of 15% and propyl glycol proportion of 10%. Q12 h of IMP-UDLs-Gel was （11.543±0.241） μg/cm2; the appearance was milky white and translucent; the particle size was （93.13±1.68） nm， PDI was 0.268±0.012， Zeta potential was （-24.96±1.99） mV; pH was 7.32±0.03; viscosity was （45.37±1.27） g·s; steady flow was （0.727±0.002） μg·h/cm2， lag time was （4.358±0.175） h， apparent permeability coefficient was 1.392×10-3 cm/h， and it has good physical and optical stability. CONCLUSIONS： The preparation method is stable and feasible， and the prepared IMP-UDLs-Gel has good adhesion， stability and transdermal property. KEYWORDS Imperatorin; Ultradeformable liposomes; Gel; Formulation optimization; Preparation; Quality evaluation; Transdermal characteristics
脂质体自被开发以来，广泛应用于医药、化妆品及食品等领域。Cevc G等[1]首次提出具有变形性的柔性脂质体，更容易透过皮肤。虽然脂质体在经皮给药系统中具有显著优势，但在外界环境如pH、温度等发生变化时，会产生聚集、药物泄露、磷脂氧化水解等问题[2]。将脂质体分散在凝胶基质中制成脂质体凝胶给药系统，可同时发挥二者特性：脂质体对药物起到缓控释作用，避免突释效应，减小毒副作用;凝胶骨架可以保护脂质体的完整性，提高其稳定性[3-4]。
欧前胡素（Imperatorin，IMP）是一种线性呋喃香豆素类化合物，主要存在于白芷等伞形科植物中[5]，具有抗炎镇痛[6-7]、抗菌[8]、抗癫痫[9]、抗肿瘤[10]及保护心血管[11]等药理作用。但IMP水溶性较差，口服吸收率低且易代谢，生物利用度低[12]，难以达到治疗浓度，限制了其在临床上的应用。本研究前期将IMP制备成柔性脂质体，增加了药物的透皮吸收，但混悬液状态在经皮给药中存在不便，故拟将IMP柔性脂质体（IMP-UDLs）溶液凝胶化以方便给药。基于此，笔者现对IMP柔性脂质体凝胶（IMP-UDLs-Gel）的制备工艺及其质量进行研究，为开发IMP透皮给药系统提供试验基础。
1 材料
1.1 仪器
e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）;CP225D型十万分之一电子分子天平（德国Sartorius公司）;L-100XPRE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;SHZ-D型循环真空泵（巩义市裕华仪器有限公司）;JY88-LIN型超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）;SK7200LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;JEM-2100型透射电子显微镜（日本电子株式会社）;Delso Nano C型纳米粒度/Zeta电位分析仪（美国Beckman Coulter公司）;TA.XT Plus型物性测试仪（英国Stable Micro Systems公司）;TK-12B型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）;THZ-84型水浴恒温振荡器（金坛市宏华仪器厂）;FE28型pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;LS3000型光照试验仪（北京天星科仪科技有限公司）。
1.2 药品与试剂
IMP对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110826-201616，纯度：98%）;IMP原料药（上海历鼎生物技术有限公司，批号：160118，纯度：97%）;大豆卵磷脂（江苏曼氏生物科技股份有限公司，批号：150919）;吐温20（批號：20180301）、吐温80（批号：20190915）均购自天津市大茂化学试剂厂;卡波姆940（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10112074）;甘油（批号：20181101）、丙二醇（批号：20161110）均购自天津市致远化学试剂有限公司;胆固醇（批号：D160508）、三乙醇胺（批号：B1511023）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;常用有机试剂为分析纯，液相色谱法所用试剂均为色谱纯，水为蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 IMP的含量测定方法
2.1.1 色谱条件 参考相关文献方法[13]设置条件：色谱柱为YMC C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇-水（70 ∶ 30，V/V）;流速为1.0 mL/min;检测波长为297 nm;柱温为30 ℃;进样量为20 μL。
2.1.2 溶液的制备 （1）IMP对照品溶液的制备：精密称取IMP对照品10.23 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得质量浓度为0.102 3 mg/mL对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：精密称取IMP-UDLs-Gel样品100 mg于10 mL量瓶中，加入适量甲醇后超声（频率：53 kHz，功率：350 W）使溶解，冷却至室温后用甲醇定容，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。（3）空白UDLs-Gel溶液的制备：精密称取空白UDLs-Gel样品100 mg于10 mL量瓶中，按“2.1.2（2）”项下方法制备。
2.1.3 专属性考察 取空白UDLs-Gel溶液、IMP对照品溶液及供试品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。结果，IMP的保留时间为9.3 min左右，峰形对称性良好，且溶剂与辅料对其色谱峰无干扰，表明方法专属性较好。色谱图见图1。
2.1.4 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下IMP对照品溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度为0.102 3、0.511 5、1.023、5.115、10.23、20.46 μg/mL的系列对照品线性溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以IMP峰面积（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，得回归方程为y=48 929x-260.2（R2=0.999 9）。结果表明，IMP质量浓度在0.102 3～20.46 μg/mL范围内线性关系良好。
2.1.5 定量限与检测限考察 取“2.1.2”项下IMP对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以信噪比10 ∶ 1和3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果显示，IMP的定量限为0.10 μg/mL，检测限为0.025 μg/mL。
2.1.6 精密度考察 取“2.1.2”项下IMP对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示，IMP峰面积的RSD为0.38%（n=6），表明仪器精密度良好。 2.1.7 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、12、24 h时，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，IMP峰面积的RSD为1.27%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
2.1.8 重复性试验 取IMP-UDLs-Gel适量，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，IMP峰面积的RSD为0.48%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率试验 称取已知IMP含量的IMP-UDLs-Gel，共9份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液后，分别加入相当于IMP-UDLs-Gel中IMP含量的80%、100%、120%的IMP对照品，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算加样回收率。结果，IMP的平均加样回收率为97.33%～101.03%，RSD为0.06%～0.59%（n=9），详见表1。
2.2 IMP-UDLs-Gel的制备
2.2.1 IMP-UDLs的制备 采用薄膜分散法[13]制备IMP-UDLs。称取IMP 15 mg和适量大豆卵磷脂（与药物质量比为1 ∶ 65）、胆固醇（与药物质量比为1 ∶ 6），溶于适量10 mg/mL吐温20乙醇溶液中，使用旋转蒸发仪以55 ℃水浴减压挥去乙醇，以磷酸盐缓冲液（PBS，pH为7.4）水化30 min，然后冰浴条件下超声（频率：70 kHz，功率：350 W）10 min，灭菌，即得。
2.2.2 空白UDLs的制备 除不加入IMP外，其余同“2.2.1”项下方法操作，制备空白UDLs。
2.2.3 IMP-UDLs-Gel的制备 参考文献方法[14]，称取处方量的卡波姆940、甘油、丙二醇及水于烧杯中，搅拌均匀，放置过夜使其充分溶胀，然后加三乙醇胺调pH至6.8～7.0得初始凝胶。将初始凝胶与“2.2.1”项下IMP-UDLs按1 ∶ 1（m/m）混合，搅拌均匀，即得。
2.2.4 空白UDLs-Gel 除用“2.2.2”项下空白UDLs代替IMP-UDLs外，其余同“2.2.3”项下方法操作，制备空白UDLs-Gel。
2.3 单因素考察
参考相关文献[15]发现，凝胶基质、促渗剂和保湿剂的种类及比例对IMP-UDLs-Gel的制备有一定影响，因此选择这几个因素进行单因素试验。
2.3.1 凝胶基质的筛选 考察以卡波姆940、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和羟丙甲纤维素（HPMC）为基质对IMP-UDLs-Gel的影响，分别配制1%的卡波姆940、CMC-Na和HPMC水溶液，放置过夜使其充分溶胀。其中，卡波姆940溶液用三乙醇胺调pH至7.0左右。以颜色、成形性和涂展性為指标，确定最优基质。结果，卡波姆940成形性好、易涂抹，因此初步确定其作为凝胶基质。凝胶基质的筛选结果见表2。
2.3.2 卡波姆940浓度的筛选 选取不同比例（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的卡波姆940作为凝胶基质，加入10%甘油、10%丙二醇，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel。以IMP在离体皮肤12 h的累积透过量（Q12 h）[13，16]为指标，筛选卡波姆比例范围。Qn计算公式为：Qn=（CnV0+[∑][i=1][n-1]CiVs）/A[式中，Qn表示单位累积透过量 （μg/ cm2）;Cn表示各个取样时间点的药物浓度（μg/mL）;Ci表示取样时间点的前一时间点的药物浓度（μg/mL）;V0表示接收池体积（mL）;Vs表示接收液取样体积（mL），A表示扩散池的有效透过面积（cm2）]。结果，当卡波姆940比例为0.5%时，凝胶难以成形;随卡波姆940比例增加，IMP在离体皮肤上的Q12 h降低;当卡波姆940比例为1.5%时，IMP在离体皮肤上的Q12 h明显降低，故选取卡波姆940比例为0.75%、1%和1.25%进行下一步研究。卡波姆940比例筛选结果见图2。
2.3.3 促渗剂种类的筛选 选取常用促渗剂氮酮、丙二醇和薄荷醇进行考察。固定卡波姆940比例为1%，甘油比例为10%，分别加入3%的氮酮、丙二醇和薄荷醇，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel。以IMP在离体皮肤的Q12 h为评价指标，筛选促渗剂种类。结果，丙二醇与薄荷醇促渗效果相当，薄荷醇在水凝胶中的溶解度较低，因此选择丙二醇作为凝胶的促渗剂。促渗剂种类筛选结果见图3。
2.3.4 丙二醇比例的筛选 固定卡波姆940比例为1%、甘油比例为10%，加入不同比例（1%、2%、5%、10%）的丙二醇，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs- Gel。以IMP在离体皮肤的Q12 h为评价指标，筛选促渗剂浓度。结果，随促渗剂浓度的增加，促渗效果增强，但当促渗剂比例达到5%时促渗效果增加缓慢，故选取丙二醇比例为5%、7.5%、10%进行下一步研究。丙二醇比例筛选结果见图4。
2.3.5 保湿剂种类及其比例的筛选 选取甘油和聚乙二醇-400（PEG-400）这2种保湿剂进行比较。固定卡波姆940比例为1%、丙二醇比例为10%，分别加入不同比例（5%、10%、15%）的甘油和PEG-400，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel，以失水率（S）为评价指标，筛选保湿剂种类及其比例。参考文献方法[17-18]测定S：称定空白量瓶质量M0，然后加入一定质量的IMP-UDLs-Gel，称定总质量M，再将量瓶放入55 ℃烘箱中干燥，每隔1 h取出称定质量，记为Mi。S计算公式为：S=（M-Mi）/（M-M0）×100%。以时间（t）为横坐标、S为纵坐标，绘制S-t曲线，并计算终点失水率。不同保湿剂种类及其比例的S-t曲线见图5。 结果显示，甘油的终点失水率大于PEG-400，说明甘油的保湿效果比PEG-400好。随甘油用量的增加，失水率减小;当甘油比例为10%～15%时，其保湿效果较好，故选取甘油比例为10%、12.5%、15%进行下一步研究。
2.4 处方优化试验
2.4.1 正交试验 根据单因素考察结果，选取卡波姆940比例（A）、甘油比例（B）和丙二醇比例（C）为正交试验考察因素，每个因素选取3个水平，采用L9（33）正交表设计试验，以IMP在离体皮肤上的Q12 h为评价指标确定最优处方。因素与水平表见表3，正交试验设计及结果见表4，方差分析结果见表5。
2.4.2 结果分析 由表4和表5结果可知，各因素对IMP-UDLs-Gel的影响程度为C>B>A。由方差分析结果可知，因素C对Q12 h有显著影响（P<0.1），因此确定最优处方为A2B3C3，即卡波姆940比例为1%，甘油比例为15%，丙二醇比例为10%。
2.4.3 验证试验 根据优化的处方比例，取适量卡波姆940、甘油、丙二醇和水置于烧杯中，按“2.2.3”项下方法制备IMP-UDLs-Gel，平行制备3批，测定并计算IMP在离体皮肤上的Q12 h。结果，3批IMP-UDLs-Gel在离体皮肤上IMP的Q12 h为（11.543±0.241） μg/cm2，RSD为2.09%（n=3），表明优化后的处方稳定可行。
2.5 IMP-UDLs-Gel的质量评价
2.5.1 外观及性状观察 取“2.4.3”项下最优处方制备的IMP-UDLs-Gel适量，于黑色背景下观察。结果，IMP-UDLs-Gel为乳白色、半透明、均匀细腻的半固体制剂，详见图6。
2.5.2 粒径分布及Zeta电位 取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel适量，加水稀释，摇匀，采用纳米粒度/Zeta电位分析仪测定其粒径和Zeta电位，平行测定3次。结果，IMP-UDLs-Gel的粒徑为（93.13±1.68） nm，多分散系数（PDI）为0.268±0.012，Zeta电位为（-24.96±1.99） mV。
2.5.3 透射电镜观察 取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel适量，加水稀释后，用2%磷钨酸溶液负染，滴于铜网上，自然晾干，在透射电镜下观察。结果，IMP-UDLs-Gel中IMP脂质体呈均匀球形，详见图7。
2.5.4 pH值 取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs- Gel于烧杯中，加50 mL水稀释，测定其pH值。平行3份操作。结果，IMP-UDLs-Gel的pH为7.32±0.03。
2.5.5 凝胶的质构特性 参考相关文献方法[19]，分别取10 g“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel和按同法制备的空白UDLs-Gel于测试杯底，并保持表面平整，选择质构仪中的单次下压分析模式，使用P/0.5圆柱型探头，设置预测速度为1.5 mm/s、测试及测后速度均为1.0 mm/s、压缩距离为15 mm、触发力为5 g，测定胶凝强度、硬度和黏性。将皮肤组织粘合在P/10圆柱形探头上，设置预测速度为0.5 mm/s、测试及测后速度为0.1 mm/s、触发力为3 g、测定停留时间为10 min、返回距离为10 mm，测定生物黏附力和黏附功。结果，与空白UDLs-Gel比较，IMP-UDLs-Gel的胶凝强度与硬度较低，黏附功和黏度较高，说明IMP-UDLs-Gel具有良好的黏附性。IMP- UDLs-Gel的质构特性见表6。
2.5.6 稳定性试验 （1）离心稳定性。取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel于EP管中，平行3份，以3 000 r/min离心30 min，观察其分层情况。（2）光稳定性。取适量“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel密封于透明西林瓶中，于4 500 lx、25 ℃条件下放置0、5、10 d观察其外观，并测定IMP含量。（3）温度稳定性。取“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel于西林瓶中，遮光密封，分别于4、25、60 ℃下放置0、5、10 d后观察其外观，并测定IMP含量。结果，3批样品均无分层现象，具有良好的物理稳定性;光照10 d后IMP-UDLs-Gel中IMP的含量下降不超过5%;在4 ℃和25 ℃条件下放置不同时间后，IMP-UDLs- Gel中IMP的含量下降均未超过5%;在60 ℃条件下放置不同时间后，IMP-UDLs-Gel颜色逐渐由乳白色变为黄色，IMP含量下降超过5%。由此可知，IMP-UDLs- Gel具有良好物理稳定性和光稳定性，详见表7。
2.5.7 IMP-UDLs-Gel的透皮性能考察 取适量“2.4.3”项下制备的IMP-UDLs-Gel，进行离体皮肤透过试验。平行3份操作。以Qn为纵坐标、时间（t）为横坐标绘制Qn-t曲线，并进行拟合，拟合方程的斜率为稳态流量，截距为滞后时间。然后根据公式[表观渗透系数=稳态流量/C0，C0为IMP在IMP-UDLs-Gel中的含量（μg/g）]计算表观渗透系数。结果，IMP-UDLs-Gel的Q12 h为（11.632±0.271） μg/cm2，拟合方程为y=0.727x+3.168，稳态流量为（0.727±0.002） μg·h/cm2，滞后时间为（4.358±0.175） h，表观渗透系数为1.392×10-3 cm/h，表明IMP-UDLs- Gel的透皮性能良好。IMP-UDLs-Gel的Qn-t曲线见图8。
3 讨论
IMP是水不溶性药物，在肠胃中不易吸收且易代谢，生物利用度很低，因此考虑将其制成经皮给药制剂，但限于其不易透过角质层，故直接经皮给药也不易吸收。脂质体制剂具有较好的生物相容性，更容易透过皮肤角质层。基于此，本课题拟将药物包裹在类脂结构载体中，再将其制成凝胶，弥补单一制剂方法的不足，并对所得IMP-UDLs-Gel的质量及透皮特性进行研究。 凝胶基质、保湿剂及促渗剂的含量对凝胶的透皮性能均有影响。由单因素试验和正交试验可知，IMP- UDLs-Gel的最优处方为卡波姆940比例1%、甘油比例15%、丙二醇比例10%。验证试验所制得的IMP-UDLs- Gel的Q12 h为（11.543±0.241） μg/cm2。质量评价结果显示，其外观为乳白色、半透明状，粒径为（93.13±1.68） nm，PDI为0.268±0.012，Zeta电位为（-24.96±1.99）mV，pH为7.32±0.03（接近于人体皮肤的pH），且其黏附性较好。稳定性试验结果表明，IMP-UDLs-Gel在常温或低温状态下稳定性较好，而温度较高时会加快药物降解，降低药物含量。透皮性能考察结果表明，IMP- UDLs-Gel具有良好的透皮性。
综上，本研究成功优化处方并制备了IMP-UDLs- Gel;该制剂具有良好的黏附性、稳定性和透皮性，可为后续IMP-UDLs-Gel的开发应用提供参考。
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（收稿日期：2019-11-24 修回日期：2020-03-13）
（编辑：唐晓莲）