【摘 要】
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目的探讨CRL4B复合物在胰腺癌发生发展中的作用及其分子机制。方法将胰腺癌细胞分为对照组(转染阴性对照慢病毒)、shCUL4B组(转染CUL4B慢病毒)、shDDB1组[转染DNA损伤结合蛋白1(DDB1)慢病毒]和shCUL4B+siSFRP1组[转染CUL4B慢病毒+分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)-siRNA]。对敲低CUL4B和DDB1的胰腺癌细胞系进行RNA测序(RNA-seq),寻找
【机 构】
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天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系 天津市医学表观遗传学协同创新中心 天津市医学表观遗传学重点实验室 免疫微环境与疾病教育部重点实验室 300070,天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物
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目的探讨CRL4B复合物在胰腺癌发生发展中的作用及其分子机制。
方法将胰腺癌细胞分为对照组(转染阴性对照慢病毒)、shCUL4B组(转染CUL4B慢病毒)、shDDB1组[转染DNA损伤结合蛋白1(DDB1)慢病毒]和shCUL4B+siSFRP1组[转染CUL4B慢病毒+分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)-siRNA]。对敲低CUL4B和DDB1的胰腺癌细胞系进行RNA测序(RNA-seq),寻找CRL4B复合物调控的靶基因,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测靶基因mRNA的表达,染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR实验鉴定CRL4B复合物直接调控的靶基因,Western blot法检测上皮-间充质转化(EMT)标志物蛋白的表达水平,EdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。采用GEO、TCGA和GTEx数据库中胰腺癌相关肿瘤样本和正常组织样本的测序数据,分析CUL4B、DDB1和其下游靶基因的表达相关性。
结果RNA-seq结果显示,CRL4B复合物调控的靶基因涉及多种恶性肿瘤相关信号通路。qRT-PCR检测结果显示,shCUL4B和shDDB1组待验证靶基因的mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。ChIP-PCR实验结果显示,CRL4B复合物直接结合在NME1和SFRP1靶基因启动子区,敲低CUL4B的表达后,靶基因启动子区域组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化富集减少。对照组PANC-1细胞增殖率为(32.10±3.58)%,高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(13.95±1.66)%和(22.38±0.77)%,均P<0.05];对照组AsPC-1细胞增殖率为(35.47±7.80)%,高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(19.60±3.58)%和(30.09±0.81)%,均P<0.05]。细胞划痕实验显示,对照组PANC-1细胞迁移率为(53.18±3.70)%,高于shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(17.46±2.62)%和(44.99±9.18)%,均P<0.05]。Western blot结果显示,对照组细胞上皮标志物α-catenin和γ-catenin的表达分别为1.00±0.03和1.01±0.11),低于shCUL4B组(分别为1.44±0.01和1.21±0.06,均P<0.05),对照组细胞间充质标志物Fibronectin和Vimentin表达水平分别为1.01±0.14和1.02±0.18,高于shCUL4B+siSFRP1组(分别为1.53±0.13和1.22±0.07,均P<0.05)。对照组细胞的迁移率为(100.00±3.96)%,与shCUL4B组和shCUL4B+siSFRP1组[分别为(35.49±0.34)%和(107.06±2.77)%]比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CUL4B和DDB1在胰腺癌中表达升高,且与SFRP1的表达呈负相关(r分别为-0.342和-0.264)。
结论胰腺癌中CRL4B复合物转录抑制靶基因SFRP1进而促进胰腺癌的发生发展,且CRL4B复合物在胰腺癌中的高表达支持了其作为胰腺癌治疗的潜在靶点。
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