论文部分内容阅读
目的 探讨miRNA219-5P (miR219-5P)调控Smad4在TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞(tendon derived fibroblasts,TDFs)纤维化过程中的作用.方法 取患者自愿捐赠的肌腱组织分离培养TDFs,取第3代细胞进行实验.化学合成miR219-5P类似物(mimics)、阻遏物(inhibitor)及阴性对照序列,分别转染TDFs 48 h后,采用实时定量PCR及Western blot法分别检测miR219-5P基因及Smad4蛋白表达情况;以正常细胞作为空白对照.信息学软件预测miR219-5P与Smad4基因3'UTR区结合位点,构建Smad4预测基因3'UTR-PGL3重组质粒,构建野生型及突变型报告基因表达载体,并通过荧光素酶报告基因实验进行靶位验证.取正常及转染后TDFs,采用TGF-β1诱导细胞发生纤维化,于培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性变化,72 h时采用Western blot法检测纤维化相关蛋白指标.结果 miR219-5P mimics转染TDFs可明显上调miR219-5P表达、下调Smad4蛋白表达,而miR219-5P inhibitor抑制细胞内miR219-5P表达、增加Smad4蛋白表达,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).荧光素酶实验显示,与pGL3-WT-Smad4转染组比较,pGL3-WT-Smad4+mimics转染组细胞内荧光素酶活性降低、pGL3-WT-Smad4+inhibitor转染组活性增强(P＜0.05);而pGL3-MT-Smad4+mimics转染组、pGL3-MT-Smad4+inhibitor转染组组间比较无明显变化(P＞0.05).与空白对照组比较,TGF-β1诱导培养72 h后细胞增殖活性明显增强(P＜0.01),同时上调细胞纤维化相关蛋白指标的表达(P＜0.01);与直接诱导组比较,miR219-5P过表达且诱导组TDFs细胞增殖活性和纤维化蛋白指标升高趋势得到抑制,而miR219-5P表达抑制且诱导组细胞增殖活性和纤维化蛋白指标则进一步增强,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 miR219-5P可通过抑制其靶基因Smad4表达,显著抑制TGF-β1诱导TDFs纤维化.