论文部分内容阅读
摘要：
采用固相萃取进行样品前处理，建立固相萃取高效液相色谱法（SPEHPLC）测定风湿马钱片中马钱子碱含量的分析方法。采用PXC阳离子交换固相萃取小柱净化，C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用体积分数为10%的磷酸调节pH值为2.（8），二者体积比为21∶79，流速为1.0 mL/min，检测波长为262 nm，柱温为30 ℃。 结果发现，马钱子碱在40～60 μg/mL范围线性关系良好，相关系数为0.999 3，平均回收率为99.6%～1010%，RSD值为1.04%。该方法操作简便、准确，重现性好，适用于风湿马钱片中马钱子碱的含量测定。
关键词：化学分析；风湿马钱片；固相萃取；高效液相色谱法；马钱子碱
中图分类号：TQ46；R283；R2841文献标志码：A
风湿马钱片具有显著的祛风、除湿、镇痛作用，标本兼治，能迅速缓解和改善风湿、类风湿和坐骨神经痛症状。处方中马钱子粉为主要成分，马钱子中生物碱的种类较多，各类生物碱的理化性质差异较小，分离困难。马钱子的主要成分是马钱子碱和士的宁。《中华人民共和国药典》（2010年版）采用高效液相色谱法测定士的宁的含量来控制风湿马钱片的含量，并未测定马钱子碱含量。马钱子碱具有通络止痛、散结消肿的功效。近年来的研究表明，马钱子碱还有抗炎、抗心律失常、抗血小板聚集、免疫调节以及抗菌、镇痛、抗肿瘤等作用。建立药物制剂中马钱子碱的测定方法有重要意义，近年来药物制剂中的马钱子碱通常采用高效液相色谱法进行分析检测。
中药样品基体复杂，前处理手段必不可少。固相萃取（solid phase extraction，简称SPE）是一项结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术，具有分离效率高、处理样品容量大、有机溶剂耗用量小等优点，成为近年来应用较多的中药前处理方法。中药制剂中的马钱子碱具有一定的药理作用，但测定过程中其他成分干扰严重，不能准确对其进行定性定量分析。传统方法采用液液萃取法分离马钱子碱，步骤繁琐且条件不宜控制。本文选用固相萃取法，简单、精确、快速地分离风湿马钱片中的马钱子碱，采用氯仿对风湿马钱片进行回流提取，进而采用固相萃取进行纯化分离，确定了固相萃取条件，去除了干扰，纯化后采用高效液相色谱法测定其中马钱子碱的含量。结果表明，该方法准确、可靠，重现性好，干扰少，为风湿马钱片的含量测定提供了新的控制指标，提高了风湿马钱片的质量控制标准，同时也为其他制剂中马钱子碱的分离、检测提供了新方法。
1实验部分
1.1仪器与试剂
LC2010 高效液相色谱仪（日本岛津公司提供），LCsolution 工作站（日本岛津公司提供），SYZ550 石英亚沸水蒸馏器（江苏金坛有限公司提供），AL204 电子天平（梅勒特公司提供），KQ250B 超声波清洗器（江苏昆山仪器公司提供），UV2600 酸度计（梅特勒公司提供），DZF6051 真空干燥箱（上海精宏公司提供）。
甲醇，乙腈（色谱纯，美国Tedia公司提供）；庚烷磺酸钠，磷酸二氢钾（分析纯，天津市永大公司提供）；浓磷酸，氨水，氯仿（石家庄试剂厂提供）；冰醋酸（天津富宇精细化工公司提供）；三乙胺（天津市博迪化工公司提供）；石油醚（天津津东天正精细化学公司提供）；风湿马钱片（太极集团四川绵阳制药有限公司提供）；马钱子碱标准品（Serve公司提供），马钱子碱分子印迹填料（Serve公司提供）。
1.2色谱条件
参考《中华人民共和国药典》中马钱子碱的测定方法，色谱条件如下：色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%（体积分数，下同）的磷酸调节pH值为2.（8），二者体积比为21∶79，流速为1.0 mL/min，检测波长为262 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。
1.3标准溶液的配制
精密称取马钱子碱对照品5 mg，放入10 mL量瓶中，加甲醇充分摇匀溶解，制成高浓度的标准品。精密量取1 mL高浓度的标准品，定容到10 mL量瓶中，得到1 mL含马钱子碱50 μg的溶液。
1.4供试品的处理
1.4.1提取
取风湿马钱片，用50%的乙醇除去包衣，研磨成粉。精密称重粉末3 g，用滤纸包好放入150 mL的索氏提取器中。精密量取70 mL的石油醚置于圆底烧瓶中，加热回流3 h，取出粉末真空烘干（30 ℃，25 min）。放冷，置于索式提取器中，精密量取60 mL氯仿置圆底烧瓶中，加热回流3 h，重复2次。合并氯仿提取液，旋蒸，用纯甲醇溶解，转移到100 mL的容量瓶中，定容到刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得粗提品。
1.4.2净化
分别精密量取2 mL制备好的风湿马钱片供试品溶液，转移到预洗过的PXC柱上待净化，分别使用5 mL体积分数为10%的甲醇淋洗，真空抽干，用5 mL含5%氨水的70%的甲醇洗脱，烘干馏出液，用2 mL甲醇溶液定容，进样测定。
1.5色谱系统适用性试验
按照“1.2”条件下进样检测，马钱子碱的保留时间为11.329 min，理论塔板数大于5 000。与士的宁混合进样，分离度为2.92，分离度良好。马钱子碱标准品及风湿马钱片的高效液相色谱图见图1。
2 实验结果与讨论
2.1固相萃取条件的筛选
2.1.1选择合适的SPE柱
分别精密量取1 mL制备好的风湿马钱片供试品溶液，转移到预洗过的C18小柱、炭黑小柱、自制MIP分子印迹填充小柱、PXC小柱上待净化，分别使用5 mL的水淋洗，真空抽干，用5 mL含5%氨水的70%的甲醇洗脱，烘干流出液，用2 mL甲醇溶液定容，进样测定。对比回收率，结果见图2。 由图2可知，C18小柱和炭黑小柱的回收率很低，由于在上样阶段大部分样品流出，所以舍弃；而MIP分子印迹填充小柱和PXC小柱的回收率都达到要求。
考察自制分子印迹填充柱与商品固相萃取柱放置一段时间后的萃取回收率，结果见图3。由图3可见，自制的MIP分子印迹填料不能长时间放置，回收率波动很大，填料稳定性仍需改善。本实验中选用PXC固相萃取小柱。
2.1.2上样量选择
通常情况下，对于正相、反相小柱，吸附容量不超过填料的5%，离子交换小柱的吸附容量为0.5～1.5 meq/g。本研究选用PXC小柱，规格为60 mg，3 mL，所以上样量应不超过90 μg。
2.1.3SPE淋洗液的选择
马钱子碱溶于甲醇、乙醇、二氯甲烷等有机溶剂，但是不溶于水。根据这些化学性质可以先选择水作为淋洗液，洗去多糖类等溶于水的杂质，同时添加一定量的甲醇淋洗其中的有机杂质。
精密量取1 mL供试品，转移到已活化好的PXC柱上，然后分别用5%～100%的甲醇水溶液淋洗，分析检测流出液中的马钱子碱。马钱子碱的淋洗曲线见图4。由图4可以看出，甲醇水溶液体积分数为30%时，淋洗液会将马钱子碱洗出，而体积分数低于10%时，马钱子碱完全没有流出。将淋洗液设定为10%的甲醇水溶液，可以最大限度地去除弱于马钱子碱的干扰物。
2.1.4 洗脱液的选择
分别选用纯甲醇、氨水甲醇（二者体积比为5∶9（5）、氨水甲醇水（三者体积比为5∶70∶2（5）作为洗脱液，检测洗脱流出液中的马钱子碱，比较结果见图5，回收率分别为35.98%，65.89%，94.29%。
生物碱在酸性条件下可溶于水，在碱性条件下溶于有机溶剂，PXC为阳离子交换固相萃取小柱，马钱子碱显碱性，若用纯甲醇很难完全洗脱，选择pH值相对高一些的甲醇溶液进行替换，可将马钱子碱洗脱下来。所以采用氨水甲醇水（三者体积比为5∶70∶2（5）洗脱。
2.1.5固相萃取前后的区别
将供试品按照确定好的固相萃取条件净化后检测，净化前后风湿马钱片的提取图见图6和图7。由图6、图7可知，固相萃取净化前在马钱子碱主峰前有一个杂质峰严重干扰马钱子碱的准确测定，固相萃取后的样品有效消除了杂质干扰，且马钱子碱的回收率为94%，符合要求。
2.2方法学考察
2.2.1线性关系考察
精密称取马钱子碱对照品5份，加甲醇稀释配置成质量浓度为40，45，50，55，60 μg/mL的标准品。取1 mL转移到预洗过PXC柱上待净化，分别使用3 mL体积分数为10%的甲醇淋洗，真空抽干，用3 mL氨水甲醇水（三者体积比为5∶70∶2（5）洗脱，烘干流出液，用1 mL甲醇溶液定容。分别以20 μL进样分析，记录峰面积，以质量浓度（[WTBX]x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。马钱子碱回归方程为y=21 362x+468 018，r=0.999 3。[WT]上述结果表明，马钱子碱在40～60 μg/mL范围内线性关系良好。
2.2.2精密度考察
分别精密吸取马钱子碱对照品溶液（50 μg/mL）1 mL，转移到预洗过的PXC柱上待净化，用3 mL体积分数为10%的甲醇淋洗，真空抽干，用3 mL含5%氨水的70%的甲醇洗脱，烘干流出液。用1 mL甲醇溶液定容，进样20 μL，连续重复进样6次，依次测定，记录色谱图峰面积，测得马钱子碱峰面积平均值为1 540 023，RSD值为1.4%。
2.2.3重复性实验
取同一批供试品6份，按照“1.4”的提取和净化方法操作。按拟定的含量测定方法测定，记录峰面积，风湿马钱片中马钱子碱的平均峰面积为807 477，RSD值为 1.1%。
2.2.4加样回收率考察
取已知含量的供试品9份，每份含量约为32 μg，精密加入24，30，36 μg的对照品，制成供试品溶液，按照上述所确定的固相萃取条件净化，进行液相色谱测定，结果见表1。
2.3样品测定
取3个批号的样品，每个批号的样品取3份，按照“1.4”的提取和净化方法操作，进行含量测定，结果见表2。
3结语
中药制剂往往成分复杂，提取纯化难度大，样品
表2风湿马钱片含量测定
Tab.2Content determination of Fengshi Maqian tablet
批号w（风湿乌钱片）/（mg·g-1）RSD值/%
12100090.5331.26
12100100.5561.02
12100110.56199.8
前处理方法的选择成为决定测量结果准确性及可操作性的关键。采用固相萃取法对样品进行前处理，要保证尽量在不损失待测组分的前提下去除杂质干扰。通过改变选择萃取柱类型、淋洗和洗脱条件等影响回收率的因素，确定了风湿马钱片中马钱子碱的固相萃取条件，并采用高效液相色谱法检测，方法的线性、精密度和回收率均符合要求，适用于风湿马钱片中马钱子碱的检测。所采用的方法也可作为其他制剂中马钱子碱的净化手段。
参考文献/References：
[1]李云霞，刘玺，郭艳玲，等.近红外光谱法测定腰痛宁胶囊中士的宁、马钱子碱和麻黄碱[J]. 现代药物与临床，2012，27（（3）：232235.
LI Yunxia，LIU Xi，GUO Yanling，et al.Determination of stychine， brucine，and ephedrine in Yaotongning Capsule by nearinfrared spectropy [J].Drugs & Clinik，2012，27（3）：232235. [2]牛晓峰，李维凤，歧林，等.用薄层色谱法测定骨康片中士的宁和马钱子碱含量[J].西安医科大学学报，2000，21（（5）：476477.
NIU Xiaofeng，LI Weifeng，QI Lin，et al.Simultaneous determination of strychnine and brucine in Gukang tablet by TLC [J].Journal of Xi’an Medical University，2000，21（（5）：476477.
[3]YANG Xiumin，ZHANG Shuaihua，WANG Juntao，et al.Online twostep stacking in capillary zone electrophoresis for the preconcentration of strychnine and brucine[J].Analytica Chimica Acta，2014（3）：6368.
[4]CORDELL G A，QUINN B M L，FARNSWORTH N R.The potential of alkaloids in drug discovery[J].Phyther Res，2001，15（3）：183205.
[5]李明，张弦，潘扬.RPHPLC法测定平消片中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国中医药信息杂志， 2007（1）：4748.
LI Ming，ZHANG Xian，PAN Yang.Determination the contents of bruchine and strychine in pingxiao tablet by RPHPLC [J].Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine，2007（1）：4748.
[6]孔文，王栋，林燕.高效液相色谱法测定蒙药顺气安神丸中马钱子碱和士的宁含量[J].北方药学，2010， 7（（6）：78.
KONG Wen，WANG Dong，LIN Yan.HPLC method for determination of brucine and strychnine in Mongolia Shunqi Anshen pill[J].Journal of North Pharmacy，2010，7（（6）：78.
[7]吕佳，袁子民，赵琳，等.高效液相色谱法测定伤科缓释胶囊中士的宁和马钱子碱的含量[J].药物分析杂志，2011（（5）：944946.
LYU Jia，YUAN Zimin，ZHAO Lin，et al.HPLC determination of strychnine and brucine in Shangke sustained release capsule[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2011（（5）：944946.
[8]KENNETH T，JOHANSEN J，SARAH J，et al.Alkaloid analysis by highperformance liquid chromatographysolid phase extractionnuclear magnetic resonance： New strategies going beyond the standard [J].Journal of Chromatography A，2012，1270：171177.
[9]冉卫兵.反向高效液相色谱法测定痹痛消丸中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药事，2006，20（（3）：160162.
RAN Weibing.Determination of strychnine and brucine in Bitongxiao pills by RPHPLC [J].Chinese Pharmaceutical Affairs，2006，20（3）：160162.
[10]金红宇，田金改，张莉，等.反相HPLC法测定马钱子中的士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药事，2005，19（（4）：219221.
JIN Hongyu，TIAN Jingai，ZHANG Li， et al. Determination of strychine and brucine in semen strychni by RPHPLC [J].Chinese Pharmaceutical Affairs，2005，19（（4）：219221.
[11]金郁，关多芬.马钱子碱的高效液相色谱测定[J].辽宁师范大学学报（自然科学版），1995，18（（1）：5758.
JIN Yu，GUAN Duofen.HPLC method for determination of brucine[J].Journal of Liaoning Normal University（Natural Science Edition），1995，18（（1）：5758.
[12]徐涛，张颖，于佳.高效液相色谱法测定马钱子散中士的宁的含量[J].黑龙江医药，2012（1）：1112.
XU Tao，ZHANG Ying，YU Jia.HPLC determination of strychnine in nux vomica powder [J].Heilongjiang Medicine Journal，2012（（1）：1112.
采用固相萃取进行样品前处理，建立固相萃取高效液相色谱法（SPEHPLC）测定风湿马钱片中马钱子碱含量的分析方法。采用PXC阳离子交换固相萃取小柱净化，C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用体积分数为10%的磷酸调节pH值为2.（8），二者体积比为21∶79，流速为1.0 mL/min，检测波长为262 nm，柱温为30 ℃。 结果发现，马钱子碱在40～60 μg/mL范围线性关系良好，相关系数为0.999 3，平均回收率为99.6%～1010%，RSD值为1.04%。该方法操作简便、准确，重现性好，适用于风湿马钱片中马钱子碱的含量测定。
关键词：化学分析；风湿马钱片；固相萃取；高效液相色谱法；马钱子碱
中图分类号：TQ46；R283；R2841文献标志码：A
风湿马钱片具有显著的祛风、除湿、镇痛作用，标本兼治，能迅速缓解和改善风湿、类风湿和坐骨神经痛症状。处方中马钱子粉为主要成分，马钱子中生物碱的种类较多，各类生物碱的理化性质差异较小，分离困难。马钱子的主要成分是马钱子碱和士的宁。《中华人民共和国药典》（2010年版）采用高效液相色谱法测定士的宁的含量来控制风湿马钱片的含量，并未测定马钱子碱含量。马钱子碱具有通络止痛、散结消肿的功效。近年来的研究表明，马钱子碱还有抗炎、抗心律失常、抗血小板聚集、免疫调节以及抗菌、镇痛、抗肿瘤等作用。建立药物制剂中马钱子碱的测定方法有重要意义，近年来药物制剂中的马钱子碱通常采用高效液相色谱法进行分析检测。
中药样品基体复杂，前处理手段必不可少。固相萃取（solid phase extraction，简称SPE）是一项结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术，具有分离效率高、处理样品容量大、有机溶剂耗用量小等优点，成为近年来应用较多的中药前处理方法。中药制剂中的马钱子碱具有一定的药理作用，但测定过程中其他成分干扰严重，不能准确对其进行定性定量分析。传统方法采用液液萃取法分离马钱子碱，步骤繁琐且条件不宜控制。本文选用固相萃取法，简单、精确、快速地分离风湿马钱片中的马钱子碱，采用氯仿对风湿马钱片进行回流提取，进而采用固相萃取进行纯化分离，确定了固相萃取条件，去除了干扰，纯化后采用高效液相色谱法测定其中马钱子碱的含量。结果表明，该方法准确、可靠，重现性好，干扰少，为风湿马钱片的含量测定提供了新的控制指标，提高了风湿马钱片的质量控制标准，同时也为其他制剂中马钱子碱的分离、检测提供了新方法。
1实验部分
1.1仪器与试剂
LC2010 高效液相色谱仪（日本岛津公司提供），LCsolution 工作站（日本岛津公司提供），SYZ550 石英亚沸水蒸馏器（江苏金坛有限公司提供），AL204 电子天平（梅勒特公司提供），KQ250B 超声波清洗器（江苏昆山仪器公司提供），UV2600 酸度计（梅特勒公司提供），DZF6051 真空干燥箱（上海精宏公司提供）。
甲醇，乙腈（色谱纯，美国Tedia公司提供）；庚烷磺酸钠，磷酸二氢钾（分析纯，天津市永大公司提供）；浓磷酸，氨水，氯仿（石家庄试剂厂提供）；冰醋酸（天津富宇精细化工公司提供）；三乙胺（天津市博迪化工公司提供）；石油醚（天津津东天正精细化学公司提供）；风湿马钱片（太极集团四川绵阳制药有限公司提供）；马钱子碱标准品（Serve公司提供），马钱子碱分子印迹填料（Serve公司提供）。
1.2色谱条件
参考《中华人民共和国药典》中马钱子碱的测定方法，色谱条件如下：色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%（体积分数，下同）的磷酸调节pH值为2.（8），二者体积比为21∶79，流速为1.0 mL/min，检测波长为262 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。
1.3标准溶液的配制
精密称取马钱子碱对照品5 mg，放入10 mL量瓶中，加甲醇充分摇匀溶解，制成高浓度的标准品。精密量取1 mL高浓度的标准品，定容到10 mL量瓶中，得到1 mL含马钱子碱50 μg的溶液。
1.4供试品的处理
1.4.1提取
取风湿马钱片，用50%的乙醇除去包衣，研磨成粉。精密称重粉末3 g，用滤纸包好放入150 mL的索氏提取器中。精密量取70 mL的石油醚置于圆底烧瓶中，加热回流3 h，取出粉末真空烘干（30 ℃，25 min）。放冷，置于索式提取器中，精密量取60 mL氯仿置圆底烧瓶中，加热回流3 h，重复2次。合并氯仿提取液，旋蒸，用纯甲醇溶解，转移到100 mL的容量瓶中，定容到刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得粗提品。
1.4.2净化
分别精密量取2 mL制备好的风湿马钱片供试品溶液，转移到预洗过的PXC柱上待净化，分别使用5 mL体积分数为10%的甲醇淋洗，真空抽干，用5 mL含5%氨水的70%的甲醇洗脱，烘干馏出液，用2 mL甲醇溶液定容，进样测定。
1.5色谱系统适用性试验
按照“1.2”条件下进样检测，马钱子碱的保留时间为11.329 min，理论塔板数大于5 000。与士的宁混合进样，分离度为2.92，分离度良好。马钱子碱标准品及风湿马钱片的高效液相色谱图见图1。
2 实验结果与讨论
2.1固相萃取条件的筛选
2.1.1选择合适的SPE柱
分别精密量取1 mL制备好的风湿马钱片供试品溶液，转移到预洗过的C18小柱、炭黑小柱、自制MIP分子印迹填充小柱、PXC小柱上待净化，分别使用5 mL的水淋洗，真空抽干，用5 mL含5%氨水的70%的甲醇洗脱，烘干流出液，用2 mL甲醇溶液定容，进样测定。对比回收率，结果见图2。 由图2可知，C18小柱和炭黑小柱的回收率很低，由于在上样阶段大部分样品流出，所以舍弃；而MIP分子印迹填充小柱和PXC小柱的回收率都达到要求。
考察自制分子印迹填充柱与商品固相萃取柱放置一段时间后的萃取回收率，结果见图3。由图3可见，自制的MIP分子印迹填料不能长时间放置，回收率波动很大，填料稳定性仍需改善。本实验中选用PXC固相萃取小柱。
2.1.2上样量选择
通常情况下，对于正相、反相小柱，吸附容量不超过填料的5%，离子交换小柱的吸附容量为0.5～1.5 meq/g。本研究选用PXC小柱，规格为60 mg，3 mL，所以上样量应不超过90 μg。
2.1.3SPE淋洗液的选择
马钱子碱溶于甲醇、乙醇、二氯甲烷等有机溶剂，但是不溶于水。根据这些化学性质可以先选择水作为淋洗液，洗去多糖类等溶于水的杂质，同时添加一定量的甲醇淋洗其中的有机杂质。
精密量取1 mL供试品，转移到已活化好的PXC柱上，然后分别用5%～100%的甲醇水溶液淋洗，分析检测流出液中的马钱子碱。马钱子碱的淋洗曲线见图4。由图4可以看出，甲醇水溶液体积分数为30%时，淋洗液会将马钱子碱洗出，而体积分数低于10%时，马钱子碱完全没有流出。将淋洗液设定为10%的甲醇水溶液，可以最大限度地去除弱于马钱子碱的干扰物。
2.1.4 洗脱液的选择
分别选用纯甲醇、氨水甲醇（二者体积比为5∶9（5）、氨水甲醇水（三者体积比为5∶70∶2（5）作为洗脱液，检测洗脱流出液中的马钱子碱，比较结果见图5，回收率分别为35.98%，65.89%，94.29%。
生物碱在酸性条件下可溶于水，在碱性条件下溶于有机溶剂，PXC为阳离子交换固相萃取小柱，马钱子碱显碱性，若用纯甲醇很难完全洗脱，选择pH值相对高一些的甲醇溶液进行替换，可将马钱子碱洗脱下来。所以采用氨水甲醇水（三者体积比为5∶70∶2（5）洗脱。
2.1.5固相萃取前后的区别
将供试品按照确定好的固相萃取条件净化后检测，净化前后风湿马钱片的提取图见图6和图7。由图6、图7可知，固相萃取净化前在马钱子碱主峰前有一个杂质峰严重干扰马钱子碱的准确测定，固相萃取后的样品有效消除了杂质干扰，且马钱子碱的回收率为94%，符合要求。
2.2方法学考察
2.2.1线性关系考察
精密称取马钱子碱对照品5份，加甲醇稀释配置成质量浓度为40，45，50，55，60 μg/mL的标准品。取1 mL转移到预洗过PXC柱上待净化，分别使用3 mL体积分数为10%的甲醇淋洗，真空抽干，用3 mL氨水甲醇水（三者体积比为5∶70∶2（5）洗脱，烘干流出液，用1 mL甲醇溶液定容。分别以20 μL进样分析，记录峰面积，以质量浓度（[WTBX]x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。马钱子碱回归方程为y=21 362x+468 018，r=0.999 3。[WT]上述结果表明，马钱子碱在40～60 μg/mL范围内线性关系良好。
2.2.2精密度考察
分别精密吸取马钱子碱对照品溶液（50 μg/mL）1 mL，转移到预洗过的PXC柱上待净化，用3 mL体积分数为10%的甲醇淋洗，真空抽干，用3 mL含5%氨水的70%的甲醇洗脱，烘干流出液。用1 mL甲醇溶液定容，进样20 μL，连续重复进样6次，依次测定，记录色谱图峰面积，测得马钱子碱峰面积平均值为1 540 023，RSD值为1.4%。
2.2.3重复性实验
取同一批供试品6份，按照“1.4”的提取和净化方法操作。按拟定的含量测定方法测定，记录峰面积，风湿马钱片中马钱子碱的平均峰面积为807 477，RSD值为 1.1%。
2.2.4加样回收率考察
取已知含量的供试品9份，每份含量约为32 μg，精密加入24，30，36 μg的对照品，制成供试品溶液，按照上述所确定的固相萃取条件净化，进行液相色谱测定，结果见表1。
2.3样品测定
取3个批号的样品，每个批号的样品取3份，按照“1.4”的提取和净化方法操作，进行含量测定，结果见表2。
3结语
中药制剂往往成分复杂，提取纯化难度大，样品
表2风湿马钱片含量测定
Tab.2Content determination of Fengshi Maqian tablet
批号w（风湿乌钱片）/（mg·g-1）RSD值/%
12100090.5331.26
12100100.5561.02
12100110.56199.8
前处理方法的选择成为决定测量结果准确性及可操作性的关键。采用固相萃取法对样品进行前处理，要保证尽量在不损失待测组分的前提下去除杂质干扰。通过改变选择萃取柱类型、淋洗和洗脱条件等影响回收率的因素，确定了风湿马钱片中马钱子碱的固相萃取条件，并采用高效液相色谱法检测，方法的线性、精密度和回收率均符合要求，适用于风湿马钱片中马钱子碱的检测。所采用的方法也可作为其他制剂中马钱子碱的净化手段。
参考文献/References：
[1]李云霞，刘玺，郭艳玲，等.近红外光谱法测定腰痛宁胶囊中士的宁、马钱子碱和麻黄碱[J]. 现代药物与临床，2012，27（（3）：232235.
LI Yunxia，LIU Xi，GUO Yanling，et al.Determination of stychine， brucine，and ephedrine in Yaotongning Capsule by nearinfrared spectropy [J].Drugs & Clinik，2012，27（3）：232235. [2]牛晓峰，李维凤，歧林，等.用薄层色谱法测定骨康片中士的宁和马钱子碱含量[J].西安医科大学学报，2000，21（（5）：476477.
NIU Xiaofeng，LI Weifeng，QI Lin，et al.Simultaneous determination of strychnine and brucine in Gukang tablet by TLC [J].Journal of Xi’an Medical University，2000，21（（5）：476477.
[3]YANG Xiumin，ZHANG Shuaihua，WANG Juntao，et al.Online twostep stacking in capillary zone electrophoresis for the preconcentration of strychnine and brucine[J].Analytica Chimica Acta，2014（3）：6368.
[4]CORDELL G A，QUINN B M L，FARNSWORTH N R.The potential of alkaloids in drug discovery[J].Phyther Res，2001，15（3）：183205.
[5]李明，张弦，潘扬.RPHPLC法测定平消片中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国中医药信息杂志， 2007（1）：4748.
LI Ming，ZHANG Xian，PAN Yang.Determination the contents of bruchine and strychine in pingxiao tablet by RPHPLC [J].Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine，2007（1）：4748.
[6]孔文，王栋，林燕.高效液相色谱法测定蒙药顺气安神丸中马钱子碱和士的宁含量[J].北方药学，2010， 7（（6）：78.
KONG Wen，WANG Dong，LIN Yan.HPLC method for determination of brucine and strychnine in Mongolia Shunqi Anshen pill[J].Journal of North Pharmacy，2010，7（（6）：78.
[7]吕佳，袁子民，赵琳，等.高效液相色谱法测定伤科缓释胶囊中士的宁和马钱子碱的含量[J].药物分析杂志，2011（（5）：944946.
LYU Jia，YUAN Zimin，ZHAO Lin，et al.HPLC determination of strychnine and brucine in Shangke sustained release capsule[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2011（（5）：944946.
[8]KENNETH T，JOHANSEN J，SARAH J，et al.Alkaloid analysis by highperformance liquid chromatographysolid phase extractionnuclear magnetic resonance： New strategies going beyond the standard [J].Journal of Chromatography A，2012，1270：171177.
[9]冉卫兵.反向高效液相色谱法测定痹痛消丸中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药事，2006，20（（3）：160162.
RAN Weibing.Determination of strychnine and brucine in Bitongxiao pills by RPHPLC [J].Chinese Pharmaceutical Affairs，2006，20（3）：160162.
[10]金红宇，田金改，张莉，等.反相HPLC法测定马钱子中的士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药事，2005，19（（4）：219221.
JIN Hongyu，TIAN Jingai，ZHANG Li， et al. Determination of strychine and brucine in semen strychni by RPHPLC [J].Chinese Pharmaceutical Affairs，2005，19（（4）：219221.
[11]金郁，关多芬.马钱子碱的高效液相色谱测定[J].辽宁师范大学学报（自然科学版），1995，18（（1）：5758.
JIN Yu，GUAN Duofen.HPLC method for determination of brucine[J].Journal of Liaoning Normal University（Natural Science Edition），1995，18（（1）：5758.
[12]徐涛，张颖，于佳.高效液相色谱法测定马钱子散中士的宁的含量[J].黑龙江医药，2012（1）：1112.
XU Tao，ZHANG Ying，YU Jia.HPLC determination of strychnine in nux vomica powder [J].Heilongjiang Medicine Journal，2012（（1）：1112.