【摘 要】
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为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(BmNPV),以BmNPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(GenBank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染BmNPV(广西宜州分离株)2h
【机 构】
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河池学院化学与生物工程学院,广西宜州546300;广西大学生命科学与技术学院,南宁530004;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530004
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为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(BmNPV),以BmNPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(GenBank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染BmNPV(广西宜州分离株)2h的5龄家蚕幼虫中肠组织提取的DNA为模板,建立二温式PCR检测BmNPV的方法,最终确定的最佳反应体系为:10xPCR buffer 1.5 μL,5 mmol/L MgCl2 2μL,2.5mmol/L dNTP 0.5 μL,10 iμmol/L上、下游引物各1μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.1 μL,18 ng/μL模板DNA 1 μL,加水至总体积15 μL.确定的最佳反应条件为:94℃预变性3 min;95℃15 s,延伸和退火温度合并为62℃30 s,共25个循环.按上述条件PCR扩增得到大小约309 bp的特异性片段,测序结果与已知polh基因序列的相似度为100％.与普通PCR检测方法比较,采用二温式PCR方法对样本的检测时间节省1.5h,反应特异性强,灵敏度高(能被检测的最小感病组织基因组DNA的质量浓度为1.8 pg/μL),并且选择最初2h感病的幼虫中肠组织为检测材料,因而可用于家蚕血液型脓病的早期诊断.
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