【摘 要】
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目的 构建人纤维连接蛋白1(FN1)基因的原核表达载体,诱导其表达并纯化该蛋白,制备特异性抗体.方法 利用RT-PCR方法 扩增人FN1编码序列450 bp的片段,包含FN1羧基端的150个氨基
【机 构】
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天津医科大学基础医学院天津市生命科学中心实验室
【基金项目】
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天津市自然科学基金重点项目;国家自然科学基金;国家高技术研究发展计划(863计划)
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目的 构建人纤维连接蛋白1(FN1)基因的原核表达载体,诱导其表达并纯化该蛋白,制备特异性抗体.方法 利用RT-PCR方法 扩增人FN1编码序列450 bp的片段,包含FN1羧基端的150个氨基酸.构建原核表达质粒pRSETA2-FN1,转化大肠杆菌BL21(DE3),FN1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过Ni~(2+)-NTA树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清.蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫组化检测其特异性.结果成功构建重组质粒pRSETA2-FN1,限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序均显示插入片段正确.SDS-PAGE凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为20 000(FN1-His标签),与预期结果一致.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价约为1:10 000, Western blot显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系HepG2全细胞裂解液中相对分子质量约250 000的纤维连接蛋白.免疫组织化学可显示FN1在正常肺及肺癌组织中的特异性分布.结论 成功地原核表达了FN1 C-末端蛋白,并免疫获得了抗FN1特异性抗体.
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