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【摘要】目的：建立了刺五加总苷总黄酮软胶囊中紫丁香苷的含量测定方法。方法：采用HPLC法测定，使用Diamonsil C18(250mm×4.6mm, 5μm)色谱柱,流动相：甲醇-水（20:80）,流速:0.8ml/min,检测波长:265nm。结果：紫丁香苷在20.56μg/ml~205.6μg/ml范围内有良好线性关系(r=0.9997),平均回收率为98.12%, RSD= 1.8%(n=5)。结论该法操作简便、准确、重现性好，可作刺五加总苷总黄酮软胶囊 中紫丁香苷的质量控制方法。
【关键词】 刺五加总苷总黄酮软胶囊；紫丁香苷；高效液相色谱法
【Abstract】 ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of Syringin in Ciwujia Eleutherosides and Total Flavonoids Soft Capsule. MethodsThe HPLC method was used at a Diamonsil C18 column as analytical column, with the mobile phase of methanol-water (20:80). The flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was 265nm. Results The concentration of Syringin was linearly related to its peak area in the range of reference substance of was 20.56μg/ml~205.6μg/ml (r=0.9997). The average recovery was 98.12% (RSD=1.8%(n=5)). Conclusion The method is simple, accurate and the results are stable with good reproducibility,so it can be used for the quality control of Syringin in Ciwujia Eleutherosides and Total Flavonoids Soft Capsule.
【Key words】 Ciwujia Eleutherosides and Total Flavonoids Soft Capsule; Syringin; HPLC
【中圖分类号】R852【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)03-0005-01
中药5类新药刺五加总苷总黄酮软胶囊是以刺五加总苷总黄酮提取物加定量植物油和赋形剂经加工而制成软胶囊剂型。产品具有增强机体免疫力、缓解体力疲劳、抗抑郁的功效。刺五加紫丁香苷是其中所含的主要功效性成分，经现代药理学研究表明刺五加紫丁香苷具有多种显著的药理作用。
1 仪器、试药与试剂
Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；刺五加总苷总黄酮软胶囊（哈尔滨仁皇药业股份有限公司，批号：20110101，20110102，20110103）；紫丁香苷对照品(中国生物制品检定所，批号：111574-200502，含量测定用）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱: Diamonsil C18 柱( 4.6mm ×250mm，5μm)；流动相:甲醇-水(20∶80)；流速:0.8ml/min，柱温:30℃；检测波长为265 nm；进样量:10μl。上述色谱条件下，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000。
2.2溶液的制备：
2.2.1对照品溶液的制备：精密称取紫丁香苷对照品约5.14mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液5ml，置10ml 量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备：取本品6粒,剪开,置100ml 锥形瓶中少量正己烷洗尽油分,加甲醇50ml,超声30min, 放冷,抽滤,滤液回收至干,残渣加2mol/L H2SO430ml, 沸水浴回流2h,稍冷,加氯仿20ml回流30min,再用氯仿萃取3次,每次20ml,水洗两次,每次30ml,氯仿液回收至干,加甲醇约8ml溶解,加水定容至10ml,-2℃冷藏2h,微孔滤膜滤过, 取续滤液,即得。
2.2.3阴性对照溶液的制备：取刺五加总苷总黄酮提取物按处方工艺制成阴性对照品, 按2.2.3 项下方法制成阴性对照溶液。
2.3测定法：分别精密吸取上述3种溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定。样品中紫丁香苷色谱峰的保留时间为21.73min。
2.4 方法学考察：
2.4.1 线性试验：精密吸取紫丁香苷浓度为0.2056mg/ml的对照品贮备液1，2，4，6，8，10ml,分别置于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下测定, 以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,方程为Y=24.94X-2.7491，r=0.9997。结果表明,紫丁香苷在20.56~205.6μg/ml线性良好。
2.4.2 精密度试验：取同一样品溶液连续进样6次,测得紫丁香苷的峰面积RSD=1.1%。
2.4.3 稳定性考察：同一样品溶液和对照分别在0, 2, 4, 6, 8 h 进样,测得紫丁香苷浓度的RSD= 1.4%。表明样品溶液及对照溶液在8h内稳定。
2.4.4 重现性试验：取同一批号样品6份(201101) ,按2.2.2 项下方法操作,分别测定紫丁香苷的含量,RSD=1.3% 。表明方法重复性较好。
2.4.5 回收率试验：采用加样回收率测定方法。取刺五加软胶囊3粒, 添加一定量(20.56μg) 的紫丁香苷对照品溶液, 按2.2.2项下方法操作, 制备成加样回收供试液,并依法测定。结果紫丁香苷的平均加样回收率为98.12% , RSD=1.8% (n=5) 。
2.5 样品测定结果:取3批样品依法操作,测定峰面积,计算样品含量。
3 讨论
关于紫丁香苷含量的HPLC法测定已有文献报道。本试验建立的HPLC法测定刺五加总苷总黄酮软胶囊中紫丁香苷的含量,方法简便、快速、重现性好、准确度高,可作为该制剂的定量控制指标。
在供试品溶液制备时,比较了甲醇超声提取和加热回流提取,结果两种提取方式对紫丁香苷含量的影响无差异,但超声提取简便快速,甲醇超声45min以后可将样品中紫丁香苷提取完全。用甲醇超声提取液直接进样测定,结果有干扰杂质,利用紫丁香苷的性质,用萃取分离的方法对提取成分进行进一步分离净化,可有效减少杂质干扰。
HPLC法测定紫丁香苷含量时,曾比较了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸等多种流动相系统,结果以甲醇-水(20∶80)作为流动相,色谱图峰型好,出峰时间适宜,分离效果较好。
参考文献
[1] 王刚,赵才德,马玉旬等.HPLC法测定活血通络丸中紫丁香苷含量
[2] 郑 键,刘玉珍,李 军,等.反相高效液相色谱法测定刺五加注射液中紫丁香苷的含量[J].中成药,2000,22(4)：263
[3] 赵陆华,屠颖,赵振宇等HPLC 测定刺五加软胶囊中异秦皮啶含量，中草药，2003，34（10）：911-912
[4] 杨水新,赵国忠,张圣民等.高效液相色谱法测定刺五加注射液中紫丁香苷的含量[J].药物分析杂志,2001,21(1)：16
[5] 罗兴平,聂凌云,翟宗德等.HPLC测定康儿灵颗粒中紫丁香苷的含量[J].解放军药学学报,2005,21(4)：305－306
作者单位：150300 哈尔滨仁皇药业有限公司1
150300 黑龙江省刺五加研究所2
【关键词】 刺五加总苷总黄酮软胶囊；紫丁香苷；高效液相色谱法
【Abstract】 ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of Syringin in Ciwujia Eleutherosides and Total Flavonoids Soft Capsule. MethodsThe HPLC method was used at a Diamonsil C18 column as analytical column, with the mobile phase of methanol-water (20:80). The flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was 265nm. Results The concentration of Syringin was linearly related to its peak area in the range of reference substance of was 20.56μg/ml~205.6μg/ml (r=0.9997). The average recovery was 98.12% (RSD=1.8%(n=5)). Conclusion The method is simple, accurate and the results are stable with good reproducibility,so it can be used for the quality control of Syringin in Ciwujia Eleutherosides and Total Flavonoids Soft Capsule.
【Key words】 Ciwujia Eleutherosides and Total Flavonoids Soft Capsule; Syringin; HPLC
【中圖分类号】R852【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)03-0005-01
中药5类新药刺五加总苷总黄酮软胶囊是以刺五加总苷总黄酮提取物加定量植物油和赋形剂经加工而制成软胶囊剂型。产品具有增强机体免疫力、缓解体力疲劳、抗抑郁的功效。刺五加紫丁香苷是其中所含的主要功效性成分，经现代药理学研究表明刺五加紫丁香苷具有多种显著的药理作用。
1 仪器、试药与试剂
Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；刺五加总苷总黄酮软胶囊（哈尔滨仁皇药业股份有限公司，批号：20110101，20110102，20110103）；紫丁香苷对照品(中国生物制品检定所，批号：111574-200502，含量测定用）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱: Diamonsil C18 柱( 4.6mm ×250mm，5μm)；流动相:甲醇-水(20∶80)；流速:0.8ml/min，柱温:30℃；检测波长为265 nm；进样量:10μl。上述色谱条件下，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000。
2.2溶液的制备：
2.2.1对照品溶液的制备：精密称取紫丁香苷对照品约5.14mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液5ml，置10ml 量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备：取本品6粒,剪开,置100ml 锥形瓶中少量正己烷洗尽油分,加甲醇50ml,超声30min, 放冷,抽滤,滤液回收至干,残渣加2mol/L H2SO430ml, 沸水浴回流2h,稍冷,加氯仿20ml回流30min,再用氯仿萃取3次,每次20ml,水洗两次,每次30ml,氯仿液回收至干,加甲醇约8ml溶解,加水定容至10ml,-2℃冷藏2h,微孔滤膜滤过, 取续滤液,即得。
2.2.3阴性对照溶液的制备：取刺五加总苷总黄酮提取物按处方工艺制成阴性对照品, 按2.2.3 项下方法制成阴性对照溶液。
2.3测定法：分别精密吸取上述3种溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定。样品中紫丁香苷色谱峰的保留时间为21.73min。
2.4 方法学考察：
2.4.1 线性试验：精密吸取紫丁香苷浓度为0.2056mg/ml的对照品贮备液1，2，4，6，8，10ml,分别置于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下测定, 以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,方程为Y=24.94X-2.7491，r=0.9997。结果表明,紫丁香苷在20.56~205.6μg/ml线性良好。
2.4.2 精密度试验：取同一样品溶液连续进样6次,测得紫丁香苷的峰面积RSD=1.1%。
2.4.3 稳定性考察：同一样品溶液和对照分别在0, 2, 4, 6, 8 h 进样,测得紫丁香苷浓度的RSD= 1.4%。表明样品溶液及对照溶液在8h内稳定。
2.4.4 重现性试验：取同一批号样品6份(201101) ,按2.2.2 项下方法操作,分别测定紫丁香苷的含量,RSD=1.3% 。表明方法重复性较好。
2.4.5 回收率试验：采用加样回收率测定方法。取刺五加软胶囊3粒, 添加一定量(20.56μg) 的紫丁香苷对照品溶液, 按2.2.2项下方法操作, 制备成加样回收供试液,并依法测定。结果紫丁香苷的平均加样回收率为98.12% , RSD=1.8% (n=5) 。
2.5 样品测定结果:取3批样品依法操作,测定峰面积,计算样品含量。
3 讨论
关于紫丁香苷含量的HPLC法测定已有文献报道。本试验建立的HPLC法测定刺五加总苷总黄酮软胶囊中紫丁香苷的含量,方法简便、快速、重现性好、准确度高,可作为该制剂的定量控制指标。
在供试品溶液制备时,比较了甲醇超声提取和加热回流提取,结果两种提取方式对紫丁香苷含量的影响无差异,但超声提取简便快速,甲醇超声45min以后可将样品中紫丁香苷提取完全。用甲醇超声提取液直接进样测定,结果有干扰杂质,利用紫丁香苷的性质,用萃取分离的方法对提取成分进行进一步分离净化,可有效减少杂质干扰。
HPLC法测定紫丁香苷含量时,曾比较了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸等多种流动相系统,结果以甲醇-水(20∶80)作为流动相,色谱图峰型好,出峰时间适宜,分离效果较好。
参考文献
[1] 王刚,赵才德,马玉旬等.HPLC法测定活血通络丸中紫丁香苷含量
[2] 郑 键,刘玉珍,李 军,等.反相高效液相色谱法测定刺五加注射液中紫丁香苷的含量[J].中成药,2000,22(4)：263
[3] 赵陆华,屠颖,赵振宇等HPLC 测定刺五加软胶囊中异秦皮啶含量，中草药，2003，34（10）：911-912
[4] 杨水新,赵国忠,张圣民等.高效液相色谱法测定刺五加注射液中紫丁香苷的含量[J].药物分析杂志,2001,21(1)：16
[5] 罗兴平,聂凌云,翟宗德等.HPLC测定康儿灵颗粒中紫丁香苷的含量[J].解放军药学学报,2005,21(4)：305－306
作者单位：150300 哈尔滨仁皇药业有限公司1
150300 黑龙江省刺五加研究所2