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摘要
利用Cobb过筛法分离合肥市大蜀山植物根际螺旋线虫属线虫，在光学显微镜下用de Man法观察并测计形态特征，比对相关文献资料，将大蜀山螺旋线虫Helicotylenchus spp. 鉴定为阿布拿马螺旋线虫 H.abunaamai、非洲螺旋线虫 H.africanus、H.mucronatus和假强壮螺旋线虫 H.pseudorobustus，除假强壮螺旋线虫外，均为安徽省首次记录，H.africanus 和H.mucronatus为国内首次记录。
关键词
螺旋线虫；形态学；种类鉴定
中图分类号：
S 432.45
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.018
Abstract
Nematodes were isolated by the Cobb decanting and sieving method from soil samples collected from the plant rhizosphere in Dashushan， Hefei City， Anhui Province. Morphometric data of the isolated spiral nematodes were obtained according to de Man formula under light microscope， and the spiral nematodes were further identified to species based on morphometrics through comparison to the related references. Totally 4 species of Helicotylenchus abunaamai，H.africanus，H.mucronatus and H.pseudorobustus were recorded. Except H.pseudorobustus， the other 3 species were new records in Anhui Province. H.africanus and H.mucronatus were recorded for the first time in China.
Key words
spiral nematode；morphology；species identification
螺旋线虫spiral nematode泛指一类隶属垫刃目Tylenchida Thorne， 1949，纽带线虫科Hopololaimidae Filipjev，1934的线虫，其自然或死亡状态通常呈螺旋形，包括螺旋线虫属Helicotylenchus、盘旋线虫属Rotylenchus、畸唇线虫属Aorolaimus、盾线虫属Scutellonema和遁移栖属Peltamigratus等，狭义的螺旋線虫专指螺旋线虫属线虫Helicotylenchus spp.[1]。
螺旋线虫属于1945年由Steiner建立，1966年Sher 给出了该属38个种的检索表[2]，1984年Fortuner等人的报道中指出螺旋线虫属有180个名义种[34]。1985年Boag Jairajpuri重新描述该属，并列出了154个种的形态特征数值[5]，2005年，谢辉在《植物线虫分类学》一书中再次介绍这154种螺旋线虫特征[6]；2013年，徐玉梅、赵增旗等指出全世界已报道的螺旋线虫属线虫约200种[7]；2014年， Kashi和Karegar在报道中叙述该属有250个种[8]。螺旋线虫属线虫新种记录不断刷新，最新的资料是2015年Uzma等报道该属有193个名义种（nominal species）[9]，迄今，螺旋线虫属成为线虫门垫刃目线虫种类最多的一个属。由于不断有新种报道，以及存在同种异名，螺旋线虫属的种类数量不稳定状态还将继续存在。
在中国，刘维志2004年出版的《植物线虫志》中收录了中国报道的47种螺旋线虫属线虫[10]；而杨文霞、杨宝君2006年出版的《中国线虫名录》中收录了国内报道的48种螺旋线虫属线虫[11]；徐玉梅、赵增旗等在2013年发表的文献综述中提到中国记载的螺旋线虫已经有67个名义种[7]。
根据《中国线虫名录》[11]和我们已经收集到的最新资料，安徽省已经报道8种螺旋线虫，即，多带螺旋线虫H.multicinctus、缓慢螺旋线虫H.bradys、加利福尼亚螺旋线虫H.californicus、双宫螺旋线虫H.dihystera、异螺旋线虫H.exallus、豌豆螺旋线虫H.pisi、塞沙德尔螺旋线虫H.seshadrii和假强壮螺旋线虫H.pseudorobustus[11]。
螺旋线虫被列为全球十大植物寄生线虫，该属主要在植物根外部寄生取食，也可能完全进入根的皮层组织[12]。 在热带地区螺旋线虫危害多种作物，是芭蕉属作物的重要病原[13]，在气候温和地区则是危害草皮的重要病原。Firoza等报道土壤中多带螺旋线虫H.multicinctus数量达到4条/g土时即能引起茄子、番茄和小麦生长受阻，根系发育不良，叶片褪绿[14]。另有报道指出螺旋线虫造成的伤口可引发细菌、真菌、病毒等病原对植物的危害，引起枯黄、腐烂等症状[15]。
随着中国园林面积的扩大，螺旋线虫发生范围扩大，对农业生产存在的潜在威胁和风险增大。安徽省合肥市地处中纬度地带，属亚热带湿润季风气候，全年气温冬寒夏热，春秋温和，适宜螺旋线虫发生和危害。大蜀山位于江淮之间，距离合肥市中心10 km，为国家级森林公园，我们在前期调查中发现风景区螺旋属线虫发生量较大，为了确定大蜀山的螺旋线虫种类，为园林及农业螺旋线虫病害发生规律研究奠定基础，我们于2014—2016年间进行了植物根际土壤采样、分离，并对线虫种类进行了形态鉴定。 1材料与方法
1.1植物根围土样采集和线虫分离
在大蜀山随机选择采集根际土样，采样时用铲子先去除植株周围表面2 cm浮土，取土层深度10～30 cm土样1 000 g左右，塑料袋保存土样，记录植被等信息，带回室内后及时用Cobb过筛法（decanting and sieving method）分离土样中的线虫[1617]。获得线虫悬浮液储存4℃冰箱内，供形态观察显微拍照。
1.2线虫形态观察和测计
线虫经温和热杀死固定后，制成临时玻片，在解剖镜（Nikon SMZ800，Nikon corporation， 日本）下挑出螺旋线虫属线虫。利用自带软件和装备显微相机的光学显微镜（Nikon DSRi2， Nikon corporation， 日本）观察并拍照，依据Cobb 改进的 de Man Formula（1876，1880）形态特征测定方法，测定线虫形态特征值[6，18]。
1.3种类鉴定
采用Filipjev（1934） 分类系统， 确定科阶元，根据Fortuner（1984）分类系统，比对虫体头高、头架、口针、背食道腺开口位置、食道腺覆盖、尾形态等特征数据，确定线虫属的分类地位[4，19]。根据Fortuner对种内形态特征变异观察结果，确定形态特征比对优先序如下：体前端至阴门的距离×100/体长（V）；口针长（Stylet）；体长（L）；背食道腺开口至口针基部球的距离（DGO）；食道长（Oes）；排泄孔至头端的距离（Ex.pore）；将尾长、尾部环纹数量、侧尾腺口的位置等种内变异大的特征作为次要参考数据[4]。并与Boag 和Jairajpuri发表的检索特征进行对比[5]。 其他形态特征缩写：a：体长/最大体宽；b：体长/体前端至食道与肠连接处的距离；c：体长/尾长；c′：尾长/肛门处体宽。
2结果与分析
大蜀山螺旋线虫属线虫的形态特征：通常虫体具明显环纹，头帽较高，头架发达，口针强壮，食道常从背腹或中間覆盖肠，尾短（c′<2）。进一步比对相关质量形态和数量形态资料后，确定为以下4个种，形态特征见图1，数量形态特征值见表1～4。
2.1阿布拿马螺旋线虫 Helicotylenchus abunaamai Siddiqi，1972
雌虫形态特征：虫体通常有粗环纹，经热杀死后向腹面弯曲，呈螺旋形；唇区半球状，无缢缩；口针粗壮，基部球较大，前缘略凹陷；背食道腺开口明显；中食道球近圆形；排泄孔开口于食道腺与肠的交界处前，距体前端97.6～126.4 μm；食道腺从腹面覆盖肠；尾部有环纹，尾端有小的腹突，受精囊小而圆。
雄虫：未发现。
寄主：牛筋草 Eleusine indica，马唐Digitaria sanguinalis。
2.2非洲螺旋线虫 Helicotylenchus africanus （Micoletzky，1916） Andrassy，1958
雌虫形态特征：虫体热杀死向腹面弯曲，呈开放“C”形，环纹可见，横纹在体中部宽1.5～2 μm。头部半球形，略低，高3.92 μm，有缢缩。口针较长，基部球粗壮，前缘略凹陷；排泄孔在食道腺与肠的交界处前。
雄虫：体长711 μm，体环纹更显著。中食道球长圆形，口针长29.5 μm。抱片到尾端，长23 μm，宽8 μm。交合刺成对，长26 μm。
寄主：牛筋草E.indica，马唐D.sanguinalis，麦冬Ophiopogon japonicus。
2.3Helicotylenchus mucronatus
雌虫鉴定特征：身体圆柱状，热杀死后向腹部弯曲，通常一次螺旋。体前部渐尖，头区最前端为中食道球处体宽的1/3，身体环纹粗糙，纵纹间距1.7 μm，侧线4条，侧尾腺孔后端有3个体环。头部圆锥形，与虫体连续，头架骨化程度高，口针前伸肌肉（protractor muscles）黏附在口针的导环（spear guide）上，口针基部球强壮，前部呈杯状，DGO为8.8～12.9 μm，食道腺强大，占身体的五分之三的宽度，峡部管状，较细，食道腺比前体窄，排泄孔到头端的距离87.4～116.1 μm，靠近食道腺与肠的交界处，半月板清晰，在排泄孔前一个体环处，阴门下陷横裂成缝，尾部指状，尾端钉状，有尾刺[21]。
雄虫：体长547 μm，a=23.27，口针长20.5 μm。单精巢前伸。交合刺成对，强壮，长21.4 μm。
寄主：络石Trachelospermum jasminoides，鸡矢藤Paederia scandens。
3结论与讨论
本文将采自合肥大蜀山植物根际的螺旋线虫分别鉴定为阿布拿马螺旋线虫H.abunaamai、非洲螺旋线虫H.africanus、H.mucronatus和假强壮螺旋线虫 H.pseudorobustus。除假强壮螺旋线虫外，均为安徽省首次记录[11]。H.africanus和H.mucronatus为国内首次记录。截至本文所报道，安徽省新增加螺旋线虫属3个新记录种，共发现11种螺旋线虫。
此次在安徽省合肥发现的H.abunaamai等4种线虫均具体环，头部半球形，有腹突，体长和尾长范围较大。
根据有无雄虫可将H.africanus和H.mucronatus区别于其他两种线虫。根据温和杀死或放松状态下虫体的形态可以将这4种线虫区别开，H.abunaamai和H.pseudorobustus虫体后部呈一次以上螺旋，呈“6”字形。H.mucronatus有一次螺旋，或开放的“C”形，而H.africanus常常仅虫体后部弯曲，虫体前端较直，本文观察到的均为直型略有弯曲。 阿布拿马螺旋线虫H.abunaamai大蜀山群体体长与原模数值接近，但均值小于云南刘永涛等[20]报道的种群体长均值；根据存在雄虫，尾部腹突，虫体具较粗的环纹，口针基部球显著，食道腺体开口到头端的距离短，受精囊圆而小等特征，将其确定为阿布拿马螺旋线虫。大蜀山非洲螺旋线虫H.africanus种群的主要特点是口针长，背食道腺开口距离口针基部球距离短，排泄孔的开口位于食道腺中间位置，尾突背弓大，腹突明显；其体长均值小于Micoletzky 1916年报道的数值，尾长和食道长度与原模数值存在差异，但尾长和食道长度均为种内变异较大的形态数值[24]，故将此种群确定为非洲螺旋线虫。H.mucronatus 各项形态测定数据与Siddiqi 1963报道数值均接近[21]。假强壮螺旋线虫H.pseudorobustus在我国多地有报道，大蜀山种群与南京种群比对，体长均值较大[2，22，25]。据报道，已经发现的螺旋线虫属种类有193～250种[5，79]。由地理分隔形成的环境适应性差异造成种间形态特征值差异，给形态鉴定和种类的定义同时带来挑战。在形态特征比对时，选用变异小、稳定的形态特征非常关键。
此次在大蜀山发现的螺旋线虫寄主涉及夹竹桃科、茜草科和禾本科植物，均为重要的园艺景观植物，据Padhi和Das报道，阿布拿马螺旋线虫寄主广泛，可危害水稻等多种农作物[23]，园林螺旋线虫病害的发生扩大加重有可能成为农业生产的隐性灾害，需引起注意，建立防范预案措施，避免给农业生产带来更大的损失。
参考文献
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[23]Padhi N N， Das S N.Observation of Helicotylenchus abunaamai in host tissue [J]. Nematologia Mediterranea， 1985， 13： 115116.
[24]Micoletzky H.Ergebnisse einer botanischen Reise nach Deutsch Ostafrika und Sudafrika （Kapland， Natal und Rhodesien） SüsswasserNematoden aus Sudafrika[M]. Denkschriften der kais. Akademie. der Wissenschaften， Wien， Math. Naturw. Klasse， 1916， 92： 149171.
[25]Maqbool M A.Classification and distribution of plant parasitic nematodes in Pakistan [M]. National Nematological Research Centre， University of Karachi， Karachi，Pakistan， 1986：58.
（責任编辑：田喆）
利用Cobb过筛法分离合肥市大蜀山植物根际螺旋线虫属线虫，在光学显微镜下用de Man法观察并测计形态特征，比对相关文献资料，将大蜀山螺旋线虫Helicotylenchus spp. 鉴定为阿布拿马螺旋线虫 H.abunaamai、非洲螺旋线虫 H.africanus、H.mucronatus和假强壮螺旋线虫 H.pseudorobustus，除假强壮螺旋线虫外，均为安徽省首次记录，H.africanus 和H.mucronatus为国内首次记录。
关键词
螺旋线虫；形态学；种类鉴定
中图分类号：
S 432.45
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.018
Abstract
Nematodes were isolated by the Cobb decanting and sieving method from soil samples collected from the plant rhizosphere in Dashushan， Hefei City， Anhui Province. Morphometric data of the isolated spiral nematodes were obtained according to de Man formula under light microscope， and the spiral nematodes were further identified to species based on morphometrics through comparison to the related references. Totally 4 species of Helicotylenchus abunaamai，H.africanus，H.mucronatus and H.pseudorobustus were recorded. Except H.pseudorobustus， the other 3 species were new records in Anhui Province. H.africanus and H.mucronatus were recorded for the first time in China.
Key words
spiral nematode；morphology；species identification
螺旋线虫spiral nematode泛指一类隶属垫刃目Tylenchida Thorne， 1949，纽带线虫科Hopololaimidae Filipjev，1934的线虫，其自然或死亡状态通常呈螺旋形，包括螺旋线虫属Helicotylenchus、盘旋线虫属Rotylenchus、畸唇线虫属Aorolaimus、盾线虫属Scutellonema和遁移栖属Peltamigratus等，狭义的螺旋線虫专指螺旋线虫属线虫Helicotylenchus spp.[1]。
螺旋线虫属于1945年由Steiner建立，1966年Sher 给出了该属38个种的检索表[2]，1984年Fortuner等人的报道中指出螺旋线虫属有180个名义种[34]。1985年Boag Jairajpuri重新描述该属，并列出了154个种的形态特征数值[5]，2005年，谢辉在《植物线虫分类学》一书中再次介绍这154种螺旋线虫特征[6]；2013年，徐玉梅、赵增旗等指出全世界已报道的螺旋线虫属线虫约200种[7]；2014年， Kashi和Karegar在报道中叙述该属有250个种[8]。螺旋线虫属线虫新种记录不断刷新，最新的资料是2015年Uzma等报道该属有193个名义种（nominal species）[9]，迄今，螺旋线虫属成为线虫门垫刃目线虫种类最多的一个属。由于不断有新种报道，以及存在同种异名，螺旋线虫属的种类数量不稳定状态还将继续存在。
在中国，刘维志2004年出版的《植物线虫志》中收录了中国报道的47种螺旋线虫属线虫[10]；而杨文霞、杨宝君2006年出版的《中国线虫名录》中收录了国内报道的48种螺旋线虫属线虫[11]；徐玉梅、赵增旗等在2013年发表的文献综述中提到中国记载的螺旋线虫已经有67个名义种[7]。
根据《中国线虫名录》[11]和我们已经收集到的最新资料，安徽省已经报道8种螺旋线虫，即，多带螺旋线虫H.multicinctus、缓慢螺旋线虫H.bradys、加利福尼亚螺旋线虫H.californicus、双宫螺旋线虫H.dihystera、异螺旋线虫H.exallus、豌豆螺旋线虫H.pisi、塞沙德尔螺旋线虫H.seshadrii和假强壮螺旋线虫H.pseudorobustus[11]。
螺旋线虫被列为全球十大植物寄生线虫，该属主要在植物根外部寄生取食，也可能完全进入根的皮层组织[12]。 在热带地区螺旋线虫危害多种作物，是芭蕉属作物的重要病原[13]，在气候温和地区则是危害草皮的重要病原。Firoza等报道土壤中多带螺旋线虫H.multicinctus数量达到4条/g土时即能引起茄子、番茄和小麦生长受阻，根系发育不良，叶片褪绿[14]。另有报道指出螺旋线虫造成的伤口可引发细菌、真菌、病毒等病原对植物的危害，引起枯黄、腐烂等症状[15]。
随着中国园林面积的扩大，螺旋线虫发生范围扩大，对农业生产存在的潜在威胁和风险增大。安徽省合肥市地处中纬度地带，属亚热带湿润季风气候，全年气温冬寒夏热，春秋温和，适宜螺旋线虫发生和危害。大蜀山位于江淮之间，距离合肥市中心10 km，为国家级森林公园，我们在前期调查中发现风景区螺旋属线虫发生量较大，为了确定大蜀山的螺旋线虫种类，为园林及农业螺旋线虫病害发生规律研究奠定基础，我们于2014—2016年间进行了植物根际土壤采样、分离，并对线虫种类进行了形态鉴定。 1材料与方法
1.1植物根围土样采集和线虫分离
在大蜀山随机选择采集根际土样，采样时用铲子先去除植株周围表面2 cm浮土，取土层深度10～30 cm土样1 000 g左右，塑料袋保存土样，记录植被等信息，带回室内后及时用Cobb过筛法（decanting and sieving method）分离土样中的线虫[1617]。获得线虫悬浮液储存4℃冰箱内，供形态观察显微拍照。
1.2线虫形态观察和测计
线虫经温和热杀死固定后，制成临时玻片，在解剖镜（Nikon SMZ800，Nikon corporation， 日本）下挑出螺旋线虫属线虫。利用自带软件和装备显微相机的光学显微镜（Nikon DSRi2， Nikon corporation， 日本）观察并拍照，依据Cobb 改进的 de Man Formula（1876，1880）形态特征测定方法，测定线虫形态特征值[6，18]。
1.3种类鉴定
采用Filipjev（1934） 分类系统， 确定科阶元，根据Fortuner（1984）分类系统，比对虫体头高、头架、口针、背食道腺开口位置、食道腺覆盖、尾形态等特征数据，确定线虫属的分类地位[4，19]。根据Fortuner对种内形态特征变异观察结果，确定形态特征比对优先序如下：体前端至阴门的距离×100/体长（V）；口针长（Stylet）；体长（L）；背食道腺开口至口针基部球的距离（DGO）；食道长（Oes）；排泄孔至头端的距离（Ex.pore）；将尾长、尾部环纹数量、侧尾腺口的位置等种内变异大的特征作为次要参考数据[4]。并与Boag 和Jairajpuri发表的检索特征进行对比[5]。 其他形态特征缩写：a：体长/最大体宽；b：体长/体前端至食道与肠连接处的距离；c：体长/尾长；c′：尾长/肛门处体宽。
2结果与分析
大蜀山螺旋线虫属线虫的形态特征：通常虫体具明显环纹，头帽较高，头架发达，口针强壮，食道常从背腹或中間覆盖肠，尾短（c′<2）。进一步比对相关质量形态和数量形态资料后，确定为以下4个种，形态特征见图1，数量形态特征值见表1～4。
2.1阿布拿马螺旋线虫 Helicotylenchus abunaamai Siddiqi，1972
雌虫形态特征：虫体通常有粗环纹，经热杀死后向腹面弯曲，呈螺旋形；唇区半球状，无缢缩；口针粗壮，基部球较大，前缘略凹陷；背食道腺开口明显；中食道球近圆形；排泄孔开口于食道腺与肠的交界处前，距体前端97.6～126.4 μm；食道腺从腹面覆盖肠；尾部有环纹，尾端有小的腹突，受精囊小而圆。
雄虫：未发现。
寄主：牛筋草 Eleusine indica，马唐Digitaria sanguinalis。
2.2非洲螺旋线虫 Helicotylenchus africanus （Micoletzky，1916） Andrassy，1958
雌虫形态特征：虫体热杀死向腹面弯曲，呈开放“C”形，环纹可见，横纹在体中部宽1.5～2 μm。头部半球形，略低，高3.92 μm，有缢缩。口针较长，基部球粗壮，前缘略凹陷；排泄孔在食道腺与肠的交界处前。
雄虫：体长711 μm，体环纹更显著。中食道球长圆形，口针长29.5 μm。抱片到尾端，长23 μm，宽8 μm。交合刺成对，长26 μm。
寄主：牛筋草E.indica，马唐D.sanguinalis，麦冬Ophiopogon japonicus。
2.3Helicotylenchus mucronatus
雌虫鉴定特征：身体圆柱状，热杀死后向腹部弯曲，通常一次螺旋。体前部渐尖，头区最前端为中食道球处体宽的1/3，身体环纹粗糙，纵纹间距1.7 μm，侧线4条，侧尾腺孔后端有3个体环。头部圆锥形，与虫体连续，头架骨化程度高，口针前伸肌肉（protractor muscles）黏附在口针的导环（spear guide）上，口针基部球强壮，前部呈杯状，DGO为8.8～12.9 μm，食道腺强大，占身体的五分之三的宽度，峡部管状，较细，食道腺比前体窄，排泄孔到头端的距离87.4～116.1 μm，靠近食道腺与肠的交界处，半月板清晰，在排泄孔前一个体环处，阴门下陷横裂成缝，尾部指状，尾端钉状，有尾刺[21]。
雄虫：体长547 μm，a=23.27，口针长20.5 μm。单精巢前伸。交合刺成对，强壮，长21.4 μm。
寄主：络石Trachelospermum jasminoides，鸡矢藤Paederia scandens。
3结论与讨论
本文将采自合肥大蜀山植物根际的螺旋线虫分别鉴定为阿布拿马螺旋线虫H.abunaamai、非洲螺旋线虫H.africanus、H.mucronatus和假强壮螺旋线虫 H.pseudorobustus。除假强壮螺旋线虫外，均为安徽省首次记录[11]。H.africanus和H.mucronatus为国内首次记录。截至本文所报道，安徽省新增加螺旋线虫属3个新记录种，共发现11种螺旋线虫。
此次在安徽省合肥发现的H.abunaamai等4种线虫均具体环，头部半球形，有腹突，体长和尾长范围较大。
根据有无雄虫可将H.africanus和H.mucronatus区别于其他两种线虫。根据温和杀死或放松状态下虫体的形态可以将这4种线虫区别开，H.abunaamai和H.pseudorobustus虫体后部呈一次以上螺旋，呈“6”字形。H.mucronatus有一次螺旋，或开放的“C”形，而H.africanus常常仅虫体后部弯曲，虫体前端较直，本文观察到的均为直型略有弯曲。 阿布拿马螺旋线虫H.abunaamai大蜀山群体体长与原模数值接近，但均值小于云南刘永涛等[20]报道的种群体长均值；根据存在雄虫，尾部腹突，虫体具较粗的环纹，口针基部球显著，食道腺体开口到头端的距离短，受精囊圆而小等特征，将其确定为阿布拿马螺旋线虫。大蜀山非洲螺旋线虫H.africanus种群的主要特点是口针长，背食道腺开口距离口针基部球距离短，排泄孔的开口位于食道腺中间位置，尾突背弓大，腹突明显；其体长均值小于Micoletzky 1916年报道的数值，尾长和食道长度与原模数值存在差异，但尾长和食道长度均为种内变异较大的形态数值[24]，故将此种群确定为非洲螺旋线虫。H.mucronatus 各项形态测定数据与Siddiqi 1963报道数值均接近[21]。假强壮螺旋线虫H.pseudorobustus在我国多地有报道，大蜀山种群与南京种群比对，体长均值较大[2，22，25]。据报道，已经发现的螺旋线虫属种类有193～250种[5，79]。由地理分隔形成的环境适应性差异造成种间形态特征值差异，给形态鉴定和种类的定义同时带来挑战。在形态特征比对时，选用变异小、稳定的形态特征非常关键。
此次在大蜀山发现的螺旋线虫寄主涉及夹竹桃科、茜草科和禾本科植物，均为重要的园艺景观植物，据Padhi和Das报道，阿布拿马螺旋线虫寄主广泛，可危害水稻等多种农作物[23]，园林螺旋线虫病害的发生扩大加重有可能成为农业生产的隐性灾害，需引起注意，建立防范预案措施，避免给农业生产带来更大的损失。
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（責任编辑：田喆）