明确中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)对内皮细胞的损伤作用,探讨肝素能否减轻NETs诱导的内皮细胞损伤,发挥对内皮细胞的保护作用。
方法提取健康志愿者外周血,利用Percoll-Histopaque密度梯度离心法提取中性粒细胞(PMN),应用佛波酯(PMA)刺激PMN产生NETs,用免疫荧光染色联合荧光酶标仪对NETs进行定性及定量检测。用提取到的NETs诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并分别加入重组DNA水解酶(rhDNase)拮抗及肝素干预,6 h后应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组HUVEC活性。
结果PMA刺激PMN可以产生NETs,免疫荧光染色显示在PMN周围可形成网状结构。荧光酶标仪检测显示,与对照组比较,经PMA刺激的PMN上清液中游离DNA含量(μg/L)显著增加(2 h:119.62±14.83比24.27±0.67,4 h:146.67±21.24比28.35±2.98,均P<0.05)。应用NETs诱导HUVEC,随着NETs含量的增加内皮细胞抑制率逐渐上升,加入rhDNase后,NETs诱导的内皮细胞抑制率可被拮抗〔10、20、30 μg/L NETs时内皮细胞抑制率分别为:(8.65±0.51)%比(10.99±0.35)%,(14.85±0.43)%比(16.85±0.49)%,(26.06±3.51)%比(27.54±0.62)%,均P<0.05〕。在NETs诱导内皮细胞损伤后,加入0.01、0.1、1和10 kU/L肝素可明显降低细胞抑制率,且呈剂量依赖趋势,10 μg/L NETs时内皮细胞抑制率分别为(8.96±0.70)%、(5.32±1.36)%、(0.70±0.30)%、(0.75±0.20)%比(10.99±0.35)%,20 μg/L NETs时内皮细胞抑制率分别为(15.57±0.62)%、(13.28±0.65)%、(6.91±0.15)%、(5.86±0.17)%比(16.85±0.49)%,30 μg/L NETs时内皮细胞抑制率分别为(30.49±0.74)%、(29.41±1.41)%、(23.45±0.75)%、(21.72±1.52)%比(27.54±0.62)%,且1 kU/L和10 kU/L的肝素对所有浓度NETs诱导内皮细胞抑制均有改善作用,差异均有统计学意义(均P<0.05)。
结论NETs能够诱导内皮细胞损伤,且NETs含量越高细胞损伤程度越重;肝素能够减轻NETs诱导的内皮细胞损伤,可能是肝素内皮细胞保护及改善脓毒症器官功能损伤作用的一种潜在机制。