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【摘 要】 本文论述了建立动物源性食品中3种β-受体激动剂（沙丁胺醇，克伦特罗，莱克多巴胺）残留的检测方法。结果表明：3种β-受体激动剂在2ng/mL～100ng/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系，R2均大于0.996，方法检出限均小于0.1μg/kg，加标回收率范围在71.4%～91.6%。该方法相对易操作，重现性好。
【关键词】 β-受体激动剂 固相萃取 同位素 液相色谱-质谱
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.11.007
β-受体激动剂俗称“瘦肉精”，是一类人工合成的药物。β-受体激动剂最常用的是克伦特罗和沙丁胺醇，因为将其加入畜类饲料中，会减少脂肪的形成，明显增加瘦肉率[1，2]，因此被长期或屠宰前滥用。β-受体激动剂一经使用会大量在动物的组织中残留，尤其是肝脏、尿液、肉中含量最高。人食用了高残留的β-受体激动剂的肉类或肝脏后会引起呼吸、心率加快、胸闷、头痛、肌肉震颤等中毒症状[3]。欧盟、美国和我国都先后立法禁止畜禽生产中食用该类药物。日本允许将莱克多巴胺使用于动物养殖，但是严格制定了最高残留量[4]。
图1 β-受体激动剂的化学结构
β-受体激动剂的检测方法主要有酶联免疫法[5]、高效液相色谱法[6]、气质联用法[7]、液质联用法[8]、放射免疫法[9]等。每种方法都有优缺点，其中液质联用法具有定性准确和测定效率高的特点而被广泛应用。本方法参考了一些文献中的液质方法，采用了最佳的酶解条件和时间[10]，并改进了一些前处理步骤，提高了工作效率，取得了较好的实验结果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，β-Glucuronidase/aryl sulfatase（>100，000units/mL），Waters MCX SPE固相萃取小柱（60mg-3CC，使用前依次用5%甲醇-氨，甲醇，水，0.1mmol/L高氯酸活化），乙酸铵、异丙醇、氢氧化钠、氨水均为分析纯，超纯水，标准物质均购自Dr Ehrenstorfer：盐酸克伦特罗（98.5%），盐酸莱克多巴胺（97.0%），沙丁胺醇（99.5%），盐酸克伦特罗-D9，莱克多巴胺-D6，沙丁胺醇-D3。
1.2 仪器与设备
固相萃取装置（安捷伦），氮吹仪HSC-12B（天津恒奥），高速冷冻离心机CT15RT（上海天美），1290-6460 液相色谱-三重串联四极杆质谱仪（安捷伦）。
1.3 仪器参数
（1）色谱条件
色谱柱：Agilent RRHD Eclipse plus C18，2.1mm×50mm，1.8μm，柱温35℃，进样体积10μL，梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱程序
（2）质谱条件
电喷雾离子源，正离子模式（ESI+），检测模式：多反应监测MRM，毛细管电压4000V，干燥气流量10L/min，干燥气温度350℃，雾化器压力35psi。质谱参数见表2。
表2 待测物质谱参数
注：*代表子离子用来做定量分析。
1.4 标准溶液的配制
（1）取沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗标准品，用乙腈配制成1μg/mL混标。
（2）取沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D6、克伦特罗-D9内标，用乙腈配制为10ng/mL混内标。
（3）将标准品配制成质量浓度分别为5，10，25，40，80，160（ng/mL），内标质量浓度均为5ng/mL的系列工作溶液。
1.5 样品处理
称取5.00g样品，于50mL离心管内，加入浓度均为10ng/mL的三种内标工作液0.25mL，加入0.2moL/L乙酸铵溶液（pH5.2）10.0mL，再加入β-Glucuronidase/aryl sulfatase120μL（近似于2500u/g），涡旋混匀，37℃条件下，酶解6小时。酶解后10000r/min条件下离心10min，上清液转移至另一离心管中，加入2mL高氯酸，再10000r/min条件下离心10min，上清液转移至另一离心管中，用12mol/L的NaOH溶液调pH至3-4，再5000r/min，-10℃条件下，离心5min，上清液过活化好的MCX-SPE 60mg-3CC小柱，依次用甲醇、5%甲醇水淋洗，用6mL5%甲醇氨洗脱，15mL离心管收集，氮吹吹干，加0.5mL水复溶，过0.22μm滤膜过滤，上机。
2 结果与分析
2.1 处理，酶解，提取，净化，色谱条件的选择
在选择每克加入2500u的β-Glucuronidase/aryl sulfatase，37℃条件下，酶解6小时。因β-Glucuronidase/aryl sulfatase在pH5.2的条件下活性最佳，因此选用pH5.2的乙酸铵溶液来提取，净化选了MCX固相萃取小柱，对弱碱性的β-受体激动剂有很强的吸附作用，净化效果好。乙腈-酸性水流动相系统对目标物有增强离子化效率的作用，采用安捷伦的质谱设备对质谱条件进行了摸索。最后得到了目标物多反应离子监测质谱图，如图2所示。
质谱峰的响应强度为纵坐标，待测物的保留时间为横坐标，在合适的条件下所有的待测物和内标都取得了良好的响应值。
2.2 方法检出限，标曲线性及回收率
按照1.4中标准曲线的配制方法配制不同浓度的标液，按照1.3中的仪器参数进行分析，质谱峰的响应高度为纵坐标，待测物浓度为横坐标，分别绘制沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗的曲线，如图3所示。
图3 三种β-受体激动剂的曲线线性 从图3可见，3种β-受体激动剂在5ng/mL～150ng/mL浓度范围内线性良好，各组分的相关系数R2>0.996。以各目标物在空白样品中的S/N=3计算方法检出限，三种β-受体激动剂的检出限均小于0.1μg/kg，满足检测机构的检测要求。
2.3 方法回收率
在空白样品中分别加入浓度为10ng/mL、20ng/mL混合标液，混匀后按1.5的方法进行处理，按1.3中的仪器参数对样品进行分析，二个添加水平的回收率见表3。
表3 三种β-受体激动剂的回收率
由上表可看出，三种β-受体激动剂的回收率在71.4～91.6之间，总体较理想。
3 结论
该方法的前处理利用酶解法，提高了样品提取效率，用固相萃取去除干扰物质，对目标物进行了有效的提取，摸索出了合理的液相和质谱条件，处理步骤简单易操作，重现性好，方法回收率较高，灵敏度满足实验室检测要求，适用于食品中β-受体激动剂的检测。
参考文献
[1]丁焕中，陈杖榴，杨志凌.营养重分配剂莱克多巴胺的药理作用和应用[J].兽药与饲料添加剂，2002，（1）：18-20.
[2]Smith D J. The pharmacokinetics， metabolis， and tissue residues of β-adrenergic agonists in livestock[J].J Anim Sci，1998，76（1）：173-194.
[3]王竹天，杨大进.食品安全与健康[M].北京：化学工业出版社，2005：103.
[4]Sakai T， Hitomi T， Sugaya K， et al. Determination method for ractopamine in swine and cattle tissues using LC/MS[J]. Food Hyg Soc Japan，2007，48（5）：144-147.
[5]Howells L， Sauer M， Sayer R D Clark， Extraction and clean-up of theβ-agonists salbutamol from liver and its determination by enzyme immuoassay[J].Analytica Chimica Acta， 1993：275-278.
[6]林奕芝，刘奋，戴京晶，梁伟.高效液相色谱法测定肉与肉制品中盐酸克伦特罗残留量[J].中国卫生检验杂志，2002，（2）：180-181.
[7]吴银良，李晓薇，刘素英，沈建忠，杨挺.气相色谱-质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸菜克多巴胺.分析化学【J】，2006，（8）：1083-1086.
[8]农业部1025号公告-18-2008.动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法[S].
[9]COLLINS S， O KEEFE M， SMYTH M R， Multi-residue anlysis for β-agonists in urine and liver samples using mixedphase columns with determination by radio immunoassay. Analyst，1994，119：2671-2674.
[10]曾绍东，王明月，杨春亮，查玉兵，林玲.超高效液相色谱-质谱法测定猪肉中9种β-受体激动剂残留量[J].分析仪器，2013年（4）：5-11.
作者简介
姜晓野，工程师，大连工业大学硕士研究生毕业，现就职于抚顺市产品质量监督检验所食品检测中心，从事食品检测工作。
张超，高级工程师，机械设计及制造专业，学士学位，从事实验室质量管理和质量控制方面的工作。
（责任编辑：张晓明）
【关键词】 β-受体激动剂 固相萃取 同位素 液相色谱-质谱
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.11.007
β-受体激动剂俗称“瘦肉精”，是一类人工合成的药物。β-受体激动剂最常用的是克伦特罗和沙丁胺醇，因为将其加入畜类饲料中，会减少脂肪的形成，明显增加瘦肉率[1，2]，因此被长期或屠宰前滥用。β-受体激动剂一经使用会大量在动物的组织中残留，尤其是肝脏、尿液、肉中含量最高。人食用了高残留的β-受体激动剂的肉类或肝脏后会引起呼吸、心率加快、胸闷、头痛、肌肉震颤等中毒症状[3]。欧盟、美国和我国都先后立法禁止畜禽生产中食用该类药物。日本允许将莱克多巴胺使用于动物养殖，但是严格制定了最高残留量[4]。
图1 β-受体激动剂的化学结构
β-受体激动剂的检测方法主要有酶联免疫法[5]、高效液相色谱法[6]、气质联用法[7]、液质联用法[8]、放射免疫法[9]等。每种方法都有优缺点，其中液质联用法具有定性准确和测定效率高的特点而被广泛应用。本方法参考了一些文献中的液质方法，采用了最佳的酶解条件和时间[10]，并改进了一些前处理步骤，提高了工作效率，取得了较好的实验结果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，β-Glucuronidase/aryl sulfatase（>100，000units/mL），Waters MCX SPE固相萃取小柱（60mg-3CC，使用前依次用5%甲醇-氨，甲醇，水，0.1mmol/L高氯酸活化），乙酸铵、异丙醇、氢氧化钠、氨水均为分析纯，超纯水，标准物质均购自Dr Ehrenstorfer：盐酸克伦特罗（98.5%），盐酸莱克多巴胺（97.0%），沙丁胺醇（99.5%），盐酸克伦特罗-D9，莱克多巴胺-D6，沙丁胺醇-D3。
1.2 仪器与设备
固相萃取装置（安捷伦），氮吹仪HSC-12B（天津恒奥），高速冷冻离心机CT15RT（上海天美），1290-6460 液相色谱-三重串联四极杆质谱仪（安捷伦）。
1.3 仪器参数
（1）色谱条件
色谱柱：Agilent RRHD Eclipse plus C18，2.1mm×50mm，1.8μm，柱温35℃，进样体积10μL，梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱程序
（2）质谱条件
电喷雾离子源，正离子模式（ESI+），检测模式：多反应监测MRM，毛细管电压4000V，干燥气流量10L/min，干燥气温度350℃，雾化器压力35psi。质谱参数见表2。
表2 待测物质谱参数
注：*代表子离子用来做定量分析。
1.4 标准溶液的配制
（1）取沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗标准品，用乙腈配制成1μg/mL混标。
（2）取沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D6、克伦特罗-D9内标，用乙腈配制为10ng/mL混内标。
（3）将标准品配制成质量浓度分别为5，10，25，40，80，160（ng/mL），内标质量浓度均为5ng/mL的系列工作溶液。
1.5 样品处理
称取5.00g样品，于50mL离心管内，加入浓度均为10ng/mL的三种内标工作液0.25mL，加入0.2moL/L乙酸铵溶液（pH5.2）10.0mL，再加入β-Glucuronidase/aryl sulfatase120μL（近似于2500u/g），涡旋混匀，37℃条件下，酶解6小时。酶解后10000r/min条件下离心10min，上清液转移至另一离心管中，加入2mL高氯酸，再10000r/min条件下离心10min，上清液转移至另一离心管中，用12mol/L的NaOH溶液调pH至3-4，再5000r/min，-10℃条件下，离心5min，上清液过活化好的MCX-SPE 60mg-3CC小柱，依次用甲醇、5%甲醇水淋洗，用6mL5%甲醇氨洗脱，15mL离心管收集，氮吹吹干，加0.5mL水复溶，过0.22μm滤膜过滤，上机。
2 结果与分析
2.1 处理，酶解，提取，净化，色谱条件的选择
在选择每克加入2500u的β-Glucuronidase/aryl sulfatase，37℃条件下，酶解6小时。因β-Glucuronidase/aryl sulfatase在pH5.2的条件下活性最佳，因此选用pH5.2的乙酸铵溶液来提取，净化选了MCX固相萃取小柱，对弱碱性的β-受体激动剂有很强的吸附作用，净化效果好。乙腈-酸性水流动相系统对目标物有增强离子化效率的作用，采用安捷伦的质谱设备对质谱条件进行了摸索。最后得到了目标物多反应离子监测质谱图，如图2所示。
质谱峰的响应强度为纵坐标，待测物的保留时间为横坐标，在合适的条件下所有的待测物和内标都取得了良好的响应值。
2.2 方法检出限，标曲线性及回收率
按照1.4中标准曲线的配制方法配制不同浓度的标液，按照1.3中的仪器参数进行分析，质谱峰的响应高度为纵坐标，待测物浓度为横坐标，分别绘制沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗的曲线，如图3所示。
图3 三种β-受体激动剂的曲线线性 从图3可见，3种β-受体激动剂在5ng/mL～150ng/mL浓度范围内线性良好，各组分的相关系数R2>0.996。以各目标物在空白样品中的S/N=3计算方法检出限，三种β-受体激动剂的检出限均小于0.1μg/kg，满足检测机构的检测要求。
2.3 方法回收率
在空白样品中分别加入浓度为10ng/mL、20ng/mL混合标液，混匀后按1.5的方法进行处理，按1.3中的仪器参数对样品进行分析，二个添加水平的回收率见表3。
表3 三种β-受体激动剂的回收率
由上表可看出，三种β-受体激动剂的回收率在71.4～91.6之间，总体较理想。
3 结论
该方法的前处理利用酶解法，提高了样品提取效率，用固相萃取去除干扰物质，对目标物进行了有效的提取，摸索出了合理的液相和质谱条件，处理步骤简单易操作，重现性好，方法回收率较高，灵敏度满足实验室检测要求，适用于食品中β-受体激动剂的检测。
参考文献
[1]丁焕中，陈杖榴，杨志凌.营养重分配剂莱克多巴胺的药理作用和应用[J].兽药与饲料添加剂，2002，（1）：18-20.
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[5]Howells L， Sauer M， Sayer R D Clark， Extraction and clean-up of theβ-agonists salbutamol from liver and its determination by enzyme immuoassay[J].Analytica Chimica Acta， 1993：275-278.
[6]林奕芝，刘奋，戴京晶，梁伟.高效液相色谱法测定肉与肉制品中盐酸克伦特罗残留量[J].中国卫生检验杂志，2002，（2）：180-181.
[7]吴银良，李晓薇，刘素英，沈建忠，杨挺.气相色谱-质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸菜克多巴胺.分析化学【J】，2006，（8）：1083-1086.
[8]农业部1025号公告-18-2008.动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法[S].
[9]COLLINS S， O KEEFE M， SMYTH M R， Multi-residue anlysis for β-agonists in urine and liver samples using mixedphase columns with determination by radio immunoassay. Analyst，1994，119：2671-2674.
[10]曾绍东，王明月，杨春亮，查玉兵，林玲.超高效液相色谱-质谱法测定猪肉中9种β-受体激动剂残留量[J].分析仪器，2013年（4）：5-11.
作者简介
姜晓野，工程师，大连工业大学硕士研究生毕业，现就职于抚顺市产品质量监督检验所食品检测中心，从事食品检测工作。
张超，高级工程师，机械设计及制造专业，学士学位，从事实验室质量管理和质量控制方面的工作。
（责任编辑：张晓明）