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摘 要：猪流行性腹泻病毒可引起感染猪严重腹泻与脱水，对仔猪有很高的致死率，给全球养猪业带来了重大经济损失，尤其对包括中国在内的亚洲国家的养猪业造成越来越严重的危害。猪流行性腹泻的诊断方法主要有临床症状与病理学诊断以及基于仪器设备的实验室诊断，如病毒分离鉴定、病毒血清中和试验、免疫电镜观察、免疫荧光检测、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应以及环介导等温扩增技术等。然而要确诊该病，必须结合各种检测手段综合判定。
关键词：猪流行性腹泻；诊断；概述
中图分类号：S851 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2017）10-0046-03
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一種严重的传染性疾病。猪流行性腹泻病毒属冠状病毒，主要感染猪小肠细胞，造成感染猪呕吐、腹泻及脱水[1]。大龄猪感染后，主要表现为体弱与体重减轻；新生仔猪感染后，通常在5 d内死亡。虽然猪流行性腹泻最先发现于欧洲，但目前主要对亚洲国家的养猪业造成严重危害。在我国已经有二十多个省存在该病[2]，并且存在许多各种年龄猪都易感的猪群[3]。猪流行性腹泻病毒也已经传播至北美国家，在2013年5月，美国印第安纳州首次检测到该病毒。由于猪流行性腹泻的高传染性，尤其对仔猪造成严重的致病率与致死率，给全球养猪业带来严重经济损失，因而对该病的诊断与防控，越来越受到研究人员的重视。本文概述该病的诊断技术，为猪场控制该病提供参考。
1 猪流行性腹泻的诊断
1.1 临床症状及病理学诊断
猪流行性腹泻的临床症状一般表现为严重的黄色水样腹泻，并伴有呕吐现象，全身脱水，体型明显消瘦。病猪精神萎靡，眼窝下陷，食欲减退或废绝，患病仔猪在腹泻3 d～4 d天后，因严重脱水而死亡。病死猪解剖后，从外观上看，肠道明显膨大，肠内有水样粪便滞留，相比健康仔猪小肠壁明显变薄，肠系膜常出现充血，部分猪偶见胃底部黏膜层黏膜坏死。
1.2 实验室诊断
1.2.1 病毒的分离鉴定
对疑似感染猪流性腹泻病毒的猪只，刮取少许肠道内容物，用磷酸盐缓冲液浸泡1 h后，高速离心，取上清接种Vero细胞，培养过夜后观察细胞病变，若生长的Vero细胞出现圆缩、坏死以及从瓶壁上脱落等情况后，遂进行病毒分离，而后对分离后的病毒进行各种分子病毒学鉴定。通过病毒分离鉴定诊断猪流行性腹泻病毒，虽然试验条件要求严格、操作步骤多、检测周期较长，但该方法是检测该病的最为准确的方法。
1.2.2 病毒微量血清中和试验
微量血清中和试验的原理为，预先将病毒与血清中的特异性抗体作用后，病毒继而失去致病力，接种到细胞后不再有细胞病变的产生，通过观察细胞病变即可进行鉴别诊断。最早在1994年，林志雄等利用PK-15传代细胞作为指示性细胞，使用猪流行性腹泻病毒PEDV G1株，建立了检测猪流行性腹泻病毒的微量血清中和试验。结果表明，该方法能准确检测PEDV，同时对其他病毒进行的鉴别诊断也显示，猪瘟、轮状病毒病、猪伪狂犬病等病毒病的阳性血清皆不能有效中和猪流行性腹泻病毒，表明该检测方法特异性好、结果准确可靠、具有较高的敏感性[4]。但该方法需要进行体外细胞培养，不适于临床实践中对PEDV的快速检测。
1.2.3 免疫电镜法
由于冠状病毒属是一类具有外套膜的正链单股RNA病毒，在电镜下观察均具有相近的形态特征，所以无法通过电镜观察直接鉴别PEDV，而借助免疫电镜的方法就能鉴别诊断。王继科等把抗原和抗体分别高速离心后，又对抗原-抗体复合物高速离心，最后在电镜下观察到典型的病毒粒子与抗体形成的免疫复合物，建立了改进型的直接免疫电镜法[5]。该方法简捷、直观、快速，并可作为鉴别诊断PEDV和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）的手段之一。但免疫电镜法由于设备的限制，不适于大规模的临床检测。
1.2.4 免疫荧光技术检测
免疫荧光技术是荧光抗体技术中的一种，利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合后，在荧光显微镜下检测得出结果，具有较高的准确性与特异性。利用免疫荧光技术检测PEDV的简要操作过程为：取发病猪小肠组织，低温冷冻后，制作冰冻切片或黏膜抹片，用丙酮固定30 min后，加入特异性荧光抗体充分反应后，用水充分洗去未反应的多余荧光抗体，置室温下干燥后，于荧光显微镜下观察便可获取检测结果。崔现兰等建立了直接免疫荧光技术用于PED的检测，试验结果显示，对PEDV人工感染仔猪的阳性检出率为91.4%，比电镜观察阳性检出率要高，后者阳性检出率仅67.4%，表明所建立的免疫荧光法相比电镜观察法更为灵敏可靠[6]。比较用于荧光检测的冰冻切片与空肠黏膜涂片的检测效果，发现前者优于后者。虽然该方法较为直观快速，但由于需要获取小肠病料，故而不能用于发病初期的检测，在临床诊断中具有一定的局限性。
1.2.5 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）
ELISA法可以直接利用病猪的粪便作为检测样本，当疑似病猪出现了腹泻症状时，可立即提取样本开展检测，有利于对病猪早诊断、早治疗。孙智锋等利用纯化的PEDV与酶标记的葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA）建立了SPA-ELISA法，该方法具有简捷、敏感、特异、快速的特点，可用于免疫猪的血清PEDV抗体的动态监测以及临床自然感染猪的检测[7]。邹勇等建立的ELISA法，可鉴别诊断PEDV、TGEV以及轮状病毒（Rotavirus，RV），应用到临床检测表明，未经免疫的猪场，PEDV血清抗体的阳性检出率接近100%，部分猪场呈现PEDV与TGEV的混合感染，另外RV阳性血清抗体水平普遍也很高[8]。目前在ELISA法原理的基础上，已经建立了间接ELISA、竞争阻断ELISA、双抗体夹心法ELISA以及Dot-ELISA 法等多种诊断方法。 1.2.6 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测
随着现代分子生物学的快速发展，RT-PCR技术成为检测PEDV的最有效的技术手段之一。国内外的研究人员均对此均进行了深入研究。吴凌等设计合成了PEDV M基因的两对特异性引物，应用RT-PCR技术，扩增出PEDV M基因的长度为854 bp的全长片段，在对照组Vero培养基中未扩增出特异产物[9]。2015年，徐旭东等针对PEDV的S基因的保守序列设计特异性引物，成功对感染PEDV的病猪进行了检测，并证实该特异性引物可以鉴别其他引起仔猪腹泻的病原[10]。在此基础上，研究人员也开发了多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等方法。Ben Salem等建立了多重巢式PCR用于检测猪肠道病毒（PEDV、TGEV以及RV），175份腹泻病猪的样本，同时进行PEDV、TGEV与RV的检测表明，4%呈现PEDV与RV的混合感染，25%单纯感染PEDV，41%单纯感染RV[11]。刘邓等基于PEDV N基因序列，设计一对特异性引物与探针，以包含N基因的pMD18-T质粒作为标准品，建立了一种能快速定量PEDV含量的TaqMan荧光定量RT-PCR法，该方法的线性检测范围可达10拷贝/μL～108拷贝/μL，敏感性与特异性显著高于常规的RT-PCR法[12]。但由于RT-PCR法需要使用荧光定量PCR仪，操作也相对复杂，在临床推广上有较大限制，目前仍只能用于实验室检测。
1.2.7 逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）
LAMP技术利用4条特殊设计的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒定温度下特异、高效、快速扩增目标DNA。RT-LAMP的检测是在LAMP技术的基础上，在反应体系内加入了逆转录酶，在反转录RNA的同时进行DNA扩增，省去了传统RT-PCR的先行反转录步骤。Ren等建立了一种RT-LAMP，该方法针对PEDV N基因设计6条特异性引物，63 ℃反应50 min即可出结果，不仅能从临床病料中检测PEDV，还能对TGEV、PRV、PRRSV等多种进行鉴别诊断，同时具有比常规RT-PCR技术及ELISA更高的敏感性[13]。LAMP 相比常规的PCR检测，LAMP检测对设备要求简单，只需一个加热器即可，更适合于临床。
2 结语
由于许多病原都能引起猪腹泻并且临床症状又非常相似，如PEDV与猪瘟、传染性胃肠炎、轮状病毒病、猪伪狂犬病、副伤寒、猪痢疾、增生性肠病、等孢球虫病等疾病的临床症状都有较大相似性，而在实际情况中，猪腹泻并不是由单一病原引起，往往由多种病原混合感染导致，这就加大了病原诊断的难度。总之，PEDV不能单纯依靠临床症状和组织病理学变化来诊断。要确诊本病，必须依靠上述各种实验室技术手段综合检測判定。
参考文献：（13篇，略）
关键词：猪流行性腹泻；诊断；概述
中图分类号：S851 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2017）10-0046-03
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一種严重的传染性疾病。猪流行性腹泻病毒属冠状病毒，主要感染猪小肠细胞，造成感染猪呕吐、腹泻及脱水[1]。大龄猪感染后，主要表现为体弱与体重减轻；新生仔猪感染后，通常在5 d内死亡。虽然猪流行性腹泻最先发现于欧洲，但目前主要对亚洲国家的养猪业造成严重危害。在我国已经有二十多个省存在该病[2]，并且存在许多各种年龄猪都易感的猪群[3]。猪流行性腹泻病毒也已经传播至北美国家，在2013年5月，美国印第安纳州首次检测到该病毒。由于猪流行性腹泻的高传染性，尤其对仔猪造成严重的致病率与致死率，给全球养猪业带来严重经济损失，因而对该病的诊断与防控，越来越受到研究人员的重视。本文概述该病的诊断技术，为猪场控制该病提供参考。
1 猪流行性腹泻的诊断
1.1 临床症状及病理学诊断
猪流行性腹泻的临床症状一般表现为严重的黄色水样腹泻，并伴有呕吐现象，全身脱水，体型明显消瘦。病猪精神萎靡，眼窝下陷，食欲减退或废绝，患病仔猪在腹泻3 d～4 d天后，因严重脱水而死亡。病死猪解剖后，从外观上看，肠道明显膨大，肠内有水样粪便滞留，相比健康仔猪小肠壁明显变薄，肠系膜常出现充血，部分猪偶见胃底部黏膜层黏膜坏死。
1.2 实验室诊断
1.2.1 病毒的分离鉴定
对疑似感染猪流性腹泻病毒的猪只，刮取少许肠道内容物，用磷酸盐缓冲液浸泡1 h后，高速离心，取上清接种Vero细胞，培养过夜后观察细胞病变，若生长的Vero细胞出现圆缩、坏死以及从瓶壁上脱落等情况后，遂进行病毒分离，而后对分离后的病毒进行各种分子病毒学鉴定。通过病毒分离鉴定诊断猪流行性腹泻病毒，虽然试验条件要求严格、操作步骤多、检测周期较长，但该方法是检测该病的最为准确的方法。
1.2.2 病毒微量血清中和试验
微量血清中和试验的原理为，预先将病毒与血清中的特异性抗体作用后，病毒继而失去致病力，接种到细胞后不再有细胞病变的产生，通过观察细胞病变即可进行鉴别诊断。最早在1994年，林志雄等利用PK-15传代细胞作为指示性细胞，使用猪流行性腹泻病毒PEDV G1株，建立了检测猪流行性腹泻病毒的微量血清中和试验。结果表明，该方法能准确检测PEDV，同时对其他病毒进行的鉴别诊断也显示，猪瘟、轮状病毒病、猪伪狂犬病等病毒病的阳性血清皆不能有效中和猪流行性腹泻病毒，表明该检测方法特异性好、结果准确可靠、具有较高的敏感性[4]。但该方法需要进行体外细胞培养，不适于临床实践中对PEDV的快速检测。
1.2.3 免疫电镜法
由于冠状病毒属是一类具有外套膜的正链单股RNA病毒，在电镜下观察均具有相近的形态特征，所以无法通过电镜观察直接鉴别PEDV，而借助免疫电镜的方法就能鉴别诊断。王继科等把抗原和抗体分别高速离心后，又对抗原-抗体复合物高速离心，最后在电镜下观察到典型的病毒粒子与抗体形成的免疫复合物，建立了改进型的直接免疫电镜法[5]。该方法简捷、直观、快速，并可作为鉴别诊断PEDV和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）的手段之一。但免疫电镜法由于设备的限制，不适于大规模的临床检测。
1.2.4 免疫荧光技术检测
免疫荧光技术是荧光抗体技术中的一种，利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合后，在荧光显微镜下检测得出结果，具有较高的准确性与特异性。利用免疫荧光技术检测PEDV的简要操作过程为：取发病猪小肠组织，低温冷冻后，制作冰冻切片或黏膜抹片，用丙酮固定30 min后，加入特异性荧光抗体充分反应后，用水充分洗去未反应的多余荧光抗体，置室温下干燥后，于荧光显微镜下观察便可获取检测结果。崔现兰等建立了直接免疫荧光技术用于PED的检测，试验结果显示，对PEDV人工感染仔猪的阳性检出率为91.4%，比电镜观察阳性检出率要高，后者阳性检出率仅67.4%，表明所建立的免疫荧光法相比电镜观察法更为灵敏可靠[6]。比较用于荧光检测的冰冻切片与空肠黏膜涂片的检测效果，发现前者优于后者。虽然该方法较为直观快速，但由于需要获取小肠病料，故而不能用于发病初期的检测，在临床诊断中具有一定的局限性。
1.2.5 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）
ELISA法可以直接利用病猪的粪便作为检测样本，当疑似病猪出现了腹泻症状时，可立即提取样本开展检测，有利于对病猪早诊断、早治疗。孙智锋等利用纯化的PEDV与酶标记的葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA）建立了SPA-ELISA法，该方法具有简捷、敏感、特异、快速的特点，可用于免疫猪的血清PEDV抗体的动态监测以及临床自然感染猪的检测[7]。邹勇等建立的ELISA法，可鉴别诊断PEDV、TGEV以及轮状病毒（Rotavirus，RV），应用到临床检测表明，未经免疫的猪场，PEDV血清抗体的阳性检出率接近100%，部分猪场呈现PEDV与TGEV的混合感染，另外RV阳性血清抗体水平普遍也很高[8]。目前在ELISA法原理的基础上，已经建立了间接ELISA、竞争阻断ELISA、双抗体夹心法ELISA以及Dot-ELISA 法等多种诊断方法。 1.2.6 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测
随着现代分子生物学的快速发展，RT-PCR技术成为检测PEDV的最有效的技术手段之一。国内外的研究人员均对此均进行了深入研究。吴凌等设计合成了PEDV M基因的两对特异性引物，应用RT-PCR技术，扩增出PEDV M基因的长度为854 bp的全长片段，在对照组Vero培养基中未扩增出特异产物[9]。2015年，徐旭东等针对PEDV的S基因的保守序列设计特异性引物，成功对感染PEDV的病猪进行了检测，并证实该特异性引物可以鉴别其他引起仔猪腹泻的病原[10]。在此基础上，研究人员也开发了多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等方法。Ben Salem等建立了多重巢式PCR用于检测猪肠道病毒（PEDV、TGEV以及RV），175份腹泻病猪的样本，同时进行PEDV、TGEV与RV的检测表明，4%呈现PEDV与RV的混合感染，25%单纯感染PEDV，41%单纯感染RV[11]。刘邓等基于PEDV N基因序列，设计一对特异性引物与探针，以包含N基因的pMD18-T质粒作为标准品，建立了一种能快速定量PEDV含量的TaqMan荧光定量RT-PCR法，该方法的线性检测范围可达10拷贝/μL～108拷贝/μL，敏感性与特异性显著高于常规的RT-PCR法[12]。但由于RT-PCR法需要使用荧光定量PCR仪，操作也相对复杂，在临床推广上有较大限制，目前仍只能用于实验室检测。
1.2.7 逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）
LAMP技术利用4条特殊设计的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒定温度下特异、高效、快速扩增目标DNA。RT-LAMP的检测是在LAMP技术的基础上，在反应体系内加入了逆转录酶，在反转录RNA的同时进行DNA扩增，省去了传统RT-PCR的先行反转录步骤。Ren等建立了一种RT-LAMP，该方法针对PEDV N基因设计6条特异性引物，63 ℃反应50 min即可出结果，不仅能从临床病料中检测PEDV，还能对TGEV、PRV、PRRSV等多种进行鉴别诊断，同时具有比常规RT-PCR技术及ELISA更高的敏感性[13]。LAMP 相比常规的PCR检测，LAMP检测对设备要求简单，只需一个加热器即可，更适合于临床。
2 结语
由于许多病原都能引起猪腹泻并且临床症状又非常相似，如PEDV与猪瘟、传染性胃肠炎、轮状病毒病、猪伪狂犬病、副伤寒、猪痢疾、增生性肠病、等孢球虫病等疾病的临床症状都有较大相似性，而在实际情况中，猪腹泻并不是由单一病原引起，往往由多种病原混合感染导致，这就加大了病原诊断的难度。总之，PEDV不能单纯依靠临床症状和组织病理学变化来诊断。要确诊本病，必须依靠上述各种实验室技术手段综合检測判定。
参考文献：（13篇，略）