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摘要 ：为明确青海省樱桃叶斑病菌链格孢Alternaria alternata的生物学特性及筛选出对其防效最佳的药剂，本研究采用菌丝生长速率法和孢子计数法研究了不同培养条件对该病原菌菌丝生长和产孢量的影响，并用菌丝生长抑制率法对9种杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明，菌絲生长和产孢的最适培养基分别为马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，最适温度为25℃，最适氮源为蛋白胨，最适碳源分别为肌醇和乳糖，最适pH分别为6～8和6～7，24 h持续黑暗处理更有利于菌丝生长和产孢。9种化学药剂对病原菌均有不同程度的抑制作用，其中250 g/L嘧菌酯悬浮剂抑菌效果最好，EC50为1.258 mg/L。该研究结果可为青海省樱桃叶斑病的防治提供理论依据。
关键词 ：樱桃; 叶斑病; 链格孢; 生物学特性; 毒力测定
中图分类号：
S 436.629
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020107
Biological characteristics of pathogen causing leaf spot disease of cherry in Qinghai
province and toxicity test of different fungicides in laboratory
LIU Qiao#， NING Nannan#， MA Yongqiang*， GUO Qingyun*
（Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Qinghai University， Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management， of Qinghai， Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Biotechnology， Ministry of Education， Xining 810016， China）
Abstract
The aim of this study is to confirm the biological characteristics of Alternaria alternata causing leaf spot disease of cherry in Qinghai province and to screen out the best fungicides. Influence of different culture conditions on mycelium growth and sporulation of pathogen was investigated using the mycelial growth rate method and spore counting method. The toxicity of nine fungicides to the pathogen was determined by mycelial growth inhibition method in laboratory. The results showed that the optimal medium for mycelium growth and sporulation was PSA medium and PDA medium， respectively. The optimal temperature was 25℃， the optimal nitrogen source was peptone， the optimal carbon source was inositol and lactose， and the optimal pH value was 6-8 and 6-7， respectively. 24 h dark treatment was more favorable for mycelium growth and sporulation. Nine kinds of fungicides had different inhibition activity on the pathogen. Among them， azoxystrobin 250 g/L SC has the best antibacterial effect， with the EC50 value of 1.258 mg/L. The results provide a theoretical basis for the control of cherry leaf spot in Qinghai province.
Key words
cherry; leaf spot; Alternaria alternata; biological characteristics; toxicity test
甜樱桃原产于西亚、非洲西北部和黑海沿岸，早在16世纪就作为果树栽培，现已在世界范围内种植，目前主要有土耳其、美国、伊朗、乌克兰、德国、西班牙和意大利等60多个国家进行商业化栽培[12]。在我国作为果树栽培最早始于19世纪70年代，目前，国内作为经济栽培的樱桃除了甜樱桃外，还有中国樱桃、酸樱桃和毛樱桃，但以欧美甜樱桃为主，主要分布在山东、辽宁、陕西、四川、河南、贵州等地[3]。樱桃果实中含有丰富的蛋白质、维生素、以及铁、钾、钙、磷等多种矿物质，能够促进能量代谢、增加人体免疫力、延缓机体衰老，医疗保健价值颇高，被誉为“水果中的钻石”[4]。此外，樱桃还具有较高的药用价值，其根、枝、叶、核、鲜果皆可入药，能治疗多种疾病[5]。樱桃经济效益高，生产前景广，因此在我国各省市有大面积的推广栽培。 青海省于1994年首次试点栽培甜樱桃，目前全省的樱桃栽培面积已发展到800 hm2，主要集中在海拔2 200 m以下的湟水河流域及黄河河谷地带的平原川水地区和黄土丘陵浅山地带[6]。青海省地处青藏高原东北部，是长江、黄河和澜沧江的发源地，其地形地貌復杂多样，属高原大陆性气候，光照时数长，太阳辐射强，昼夜温差大，降雨量少，温度相对较低，年平均气温在-5～8℃之间[7]。由于特殊的地理位置和气候条件，病虫害极轻，产出的樱桃果实品质极佳。再加上栽培方式多为露地栽培，成熟期较其他各省晚，大大延长了国内樱桃产品的供应时间，发展前景广阔。
近年来，由于青海省气温升高，雨量增加，导致发生在樱桃上的病害种类和危害程度明显上升。其中，叶斑病发生最为严重，在7、8月份病株率高达100%。病菌在叶片上引起圆形或近圆形的褐色或紫红色病斑，严重时，病斑相互连接成不规则状，使叶片失绿黄化，导致树体衰弱，果实大量减产。本研究组通过形态学和分子生物学手段，将病原菌鉴定为链格孢Alternaria alternata、细极链格孢A.tenuissima和刺盘孢属Colletotrichum spp.，分离频率分别为84.95%、5.02%和10.03%[8]。本文在青海省樱桃叶斑病病原鉴定的基础上对主要病原菌A.alternata的生物学特性进行研究，并用9种化学试剂对其防效进行评价，旨在为青海省樱桃叶斑病的科学防控提供理论支撑和技术指导。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
樱桃叶斑病菌HS002（链格孢A.alternata），分离自海东市乐都区樱桃病叶，保存在青海省农林科学院植物保护研究所青海省农业有害生物综合治理重点实验室。
1.2 供试培养基
参照张秀伟等[9]、安颖等[10]、孙宇等[11]和马雪儿等[12]对病原菌生物学特性的研究方法，本研究选择了马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、燕麦片琼脂培养基（OA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、淀粉琼脂培养基（SA）、葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（GPA）、麦芽糖琼脂培养基（MA）、酵母膏琼脂培养基（YEA）、査氏培养基（Czapek）、马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）、水琼脂培养基（WA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）和V8培养基等12种培养基对樱桃叶斑病菌A.alternata进行培养，筛选该病原菌生长和产孢的最适培养基。
1.3 供试药剂
本试验所用的杀菌剂种类、厂家及稀释倍数见表1。
1.4 樱桃叶斑病病原菌生物学特性研究
1.4.1 不同培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
将病原菌接种在PDA平板上，25℃黑暗培养6 d，使其形成供试菌落。配制12种供试培养基，于121℃下湿热灭菌30 min，待温度下降至60℃左右时，在无菌条件下分别倒入直径为9 cm的培养皿中制成平板[1214]。用灭菌打孔器沿供试菌株菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼接种在平板中央，重复3次，置于25℃下黑暗培养6 d后，用十字交叉法测量菌落直径取平均值。培养12 d后，采用十字交叉法，用直径为5 mm的打孔器从平板中央向边缘依次打取不同部位的菌丝块，每皿20块，放入20 mL无菌水中，压碎菌饼并不断搅拌，使分生孢子充分混匀于无菌水中，于显微镜下用血球计数板测定孢子数量[14]。
1.4.2 温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
在培养好的供试病原菌菌落边缘打取5 mm的
菌饼接种在PDA平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃和40℃下进行黑暗培养[15]，重复次数、菌落直径和产孢量的测量方法同1.4.1。
1.4.3 碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
以PDA培养基为基础培养基，以不加糖的PDA培养基为对照，以淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、肌醇、乳糖、山梨醇、木糖为碳源等质量替换PDA培养基中的葡萄糖配制成不同含碳培养基[12]，处理方法同1.4.1。
1.4.4 氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
以 PDA 培养基为基础培养基和对照，分别加入3 g NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4、NH4NO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏配制成不同含氮培养基[16]，处理方法同1.4.1。
1.4.5 pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
用1 mol/L HCl和NaOH将无菌PDA培养基的pH调至4～12后，制成平板[15]。处理方法同14.1。
1.4.6 光照周期对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
将病原菌菌饼接在PDA平板中央，分别置于25℃恒温培养箱中进行24 h持续光照、24 h持续黑暗、L∥D=12 h∥12 h光暗交替培养[17]。重复次数、菌落直径和产孢量的测量方法同1.4.1。
1.4.7 菌丝致死温度测定
在无菌条件下，打取供试病原菌菌饼置于试管中，分别放入35、40、45、50、55℃和60℃恒温水浴锅中水浴10 min（到达设定温度时开始计时）。以室温下放置的试管作为对照，重复3次[18]。将菌饼接种在PDA平板上，25℃黑暗培养3 d后观察病原菌的生长状况。
1.5 室内毒力测定
1.5.1 含药培养基的制备
将所有供试药剂按照推荐浓度分别稀释相应的倍数备用。将配制好的PDA培养基分装在容量为250 mL的三角瓶中，每瓶99 mL，封口后进行灭菌。待温度冷却至60℃左右时，在无菌条件下，将配制好的药剂分别加入到PDA培养基中，最终稀释倍数如表1所示，以不加药剂的PDA平板作为对照，再加入少量的链霉素，防止细菌污染。振荡摇匀后倒入直径为9 cm的一次性培养皿中，制成不同的含药平板[19]。 1.5.2 不同药剂对病原菌菌丝生长的毒力测定
采用菌丝生长抑制率法[20]，将供试病原菌菌饼接种在不同含药培养基中央，重复5次。25℃黑暗培养6 d后测量菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。以菌丝生长抑制率几率值作为因变量（y），药剂浓度的自然对数值作为自变量（x），利用最小二乘法建立“浓度对数-几率值”直线方程（y=ax b）[21]。采用Excel 2010、SPSS 19.0等软件，求出各药剂对樱桃叶斑病菌的抑制中浓度（EC50），以衡量不同杀菌剂对病原菌的毒力效果。
抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。
2 结果与分析
2.1 病原菌的生物学特性
2.1.1 不同培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
病原菌在12种供试培养基上均能生长但差异显著（P<0.05），在GPA、PSA和MA培养基上菌丝生长较快，但在GPA和MA培养基上菌丝较稀疏;其次是PDA、OA、CMA和V8培养基，但在OA和CMA培养基上菌丝生长不紧密且在OA上颜色较浅;在PCA、WA、Czapek和YEA培养基上菌丝生长较慢。SA培养基则不利于菌丝生长，其菌落直径显著小于其他培养基上的菌落直径。不同培养基对病原菌产孢量的影响也显著不同，在PDA和PSA培养基上产孢量显著多于其他培养基上的产孢量，且在PDA培养基上产孢量最多;其次是GPA培养基，在SA、YEA、OA、PCA和CMA培养基上产孢较少，而在MA、Czapek、WA和V8培养基上不产孢（图1）。
2.1.2 温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
病原菌在5～35℃下均能生长，但差异显著。在25℃时，菌落直径最大，显著大于其他温度条件下的菌落直径;在15～35℃时菌落生长良好，其中在30～35℃时菌落生长较快;5℃和10℃时菌落生长较慢，而40℃时菌落不生长。病原菌产孢的最适温度为25℃，显著多于其他温度条件下的产孢量，在20℃、30℃和35℃下产孢较多;在5℃和10℃下产孢量较少，其中5℃下产孢最少（40℃除外）;而在40℃下菌落不生长也不产孢（图2）。
2.1.3 碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
菌丝在以肌醇为碳源的培养基上生长最快，菌落直径最大;以蔗糖、果糖、乳糖和山梨醇为碳源的培养基上，菌落生长较好，菌落直径显著大于对照;以葡萄糖、麦芽糖和淀粉为碳源的培养基上菌落大小與对照差异不显著;而以木糖为碳源的培养基上菌落直径最小，显著小于对照。病原菌在以乳糖为碳源的培养基上产孢最多;在以肌醇、果糖、木糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇为碳源的培养基上产孢次之，其产孢量均显著多于对照;而在以麦芽糖和淀粉为碳源的培养基上产孢量与空白碳源培养基上的产孢量无显著差异（图3）。
2.1.4 氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
菌丝生长的最适氮源是蛋白胨，在以蛋白胨为氮源的培养基上菌落直径显著大于其他氮源培养基上的菌落直径，但与对照无显著差异。在以KNO3为氮源的培养基上菌丝生长相对较快，而以牛肉膏、酵母膏、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3为氮源能够显著抑制菌丝生长。病原菌在以蛋白胨为氮源的培养基上产孢最多，其次是KNO3，两者的产孢量均显著多于其他氮源培养基上的产孢量，但与对照差异不显著;而在以牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3为氮源的培养基上，病原菌的产孢量严重受到抑制，显著低于对照;而在以酵母膏为氮源的培养基上不产孢（图4）。
2.1.5 pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
病原菌在pH为4～12范围内均能生长和产孢，但差异显著。菌丝生长的最适pH为6～8，产孢的最适pH为6～7，过酸过碱均不利于菌丝生长和产孢（图5）。
2.1.6 光照周期对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
在24 h持续黑暗处理条件下，菌丝生长速率最快，菌落直径显著大于其他2种光照周期下的菌落直径;其次是24 h光照处理，而12 h∥12 h光照黑暗交替条件不利于菌丝生长。24 h持续黑暗处理有利于产孢，其产孢量显著多于其他2种光照周期下的产孢量;24 h持续光照处理和12 h∥12 h光照黑暗交替条件下产孢量较少且无显著差异（图6）。
2.1.7 菌丝致死温度
将分别在35～60℃的恒温水浴锅内处理10 min的菌饼接种在PDA平板上，置于25℃下黑暗培养3 d后，结果发现在35～50℃条件下处理10 min后，菌丝能够生长且产生新的菌落，而在50℃及以上条件下菌丝不生长，说明病原菌菌丝的致死条件为50℃处理10 min。
2.2 室内毒力测定结果
9种化学药剂对病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，且随药剂浓度的升高抑制作用逐渐增强（图7）。表2结果显示，在不同防治药剂中250 g/L嘧菌酯SC抑制效果最好，EC50为1.258 mg/L;10%苯醚甲环唑WG和250 g/L吡唑嘧菌酯EC抑制效果次之，EC50分别为1.555 mg/L和1.727 mg/L;再者是50%啶酰菌胺WG，EC50为11.348 mg/L;抑菌效果最差的为75%百菌清WP，其EC50高达10 894.317 mg/L。
3 结论与讨论
樱桃叶斑病是由多种不同病原菌引起的一种世界性真菌病害，常造成樱桃果实大量减产，是遏制樱桃产业发展的主要病害之一[2228]。青海省樱桃病害以叶斑病发生最为普遍，主要危害樱桃叶片，尤其是下部老叶更容易发病。本研究组前期将其病原菌鉴定为链格孢、细极链格孢和刺盘孢属，其中以链格孢病原菌为主。研究发现，链格孢作为链格孢属的模式种，具有侵染能力强、寄主范围广和危害程度重等特点，可引起观赏凤梨叶斑病[29]、枸杞叶枯病[30]、草莓叶斑病[31]、番茄黑斑病[32]、香榧果实褐斑病[33]和紫花苜蓿叶斑病和枯萎病[34]等多种植物病害。此外，该病原菌还可以侵染骏枣、蓝莓、向日葵、菊花和鹰嘴豆等多种植物，使其发病，表现出明显的症状[3539]。 国内外对于链格孢引起的病害防控主要依赖于化学药剂。然而，化学药剂的种类和剂量的选择成为病害防控过程中的一个突出问题。为此，很多学者对链格孢进行防治药剂的室内毒力测定。孙洁等[40]通过菌丝生长速率法测定了8种杀菌剂对新疆红枣缩果病菌A.alternata菌丝的毒力，结果表明，70%代森锰锌WP和50%福美双WP对病原菌菌丝生长的抑制效果较好;其次为70%丙森锌WP和75%百菌清WP;抑制作用最差的为25%阿米西达SC和70%甲基硫菌灵WP。王志霞等[41]通过菌丝生长抑制率法和孢子萌发抑制率法测定了5种杀菌剂对新疆红枣叶斑病菌A.tenuissima和A.alternata的毒力，结果表明，70%代森锰锌对病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果最好。王芳等[42]选择了7种杀菌剂对玉米大斑病病原菌A.alternata进行毒力测定，结果表明，50%异菌脲WP抑制效果最好，当试验浓度为50 mg/L时，抑制率可达95%。此外，张丹华等[43]对重庆地区枇杷叶斑病菌A.alternata进行防治药剂室内筛选，认为5种杀菌剂中10%苯醚甲环唑WG的抑制效果最好，EC50为3.84 mg/L。
本研究对青海省樱桃叶斑病主要病原菌A.alternata进行了生物学特性研究及室内防治药剂的筛选，结果表明，不同培养条件对菌丝生长和产孢量均有显著影响，且菌落颜色、厚度以及菌丝的生长状况显著不同。病原菌在12种供试培养基上均能生长，但在PSA培养基上生长最佳。病原菌生长的温度范围比较广，在5～35℃条件下均能生长，适宜温度是25～30℃，最适温度为25℃，而温度高于40℃时，菌落不生长，这与孙洁等[40]、王志霞等[41]和詹文平等[44]的研究结果相似。病原菌在不同碳氮源培养基上均能生长，但对碳氮源具有一定的选择性，其中以肌醇为碳源，蛋白胨为氮源最有利于菌丝生长，而以乳糖为碳源，蛋白胨为氮源最有利于产孢。病原菌在不加碳氮源培养基上虽能快速生长，但菌丝稀疏、菌落稀薄且颜色较浅，由此可知碳氮源对病原菌的生长具有重要作用。病原菌在pH为4～12条件下均能生长，且菌丝生长的最适pH为6～8，产孢的最适pH为6～7，过酸过碱均不利于菌丝生长和产孢，这与孙洁等[40]的研究结果相同。病原菌在3种光照周期下均可生长和产孢，持续黑暗条件下菌丝生长最快，产孢量最多，这与乔镜澄等[32]的研究结果相同，与沈会芳等[14]和刘晓琳等[45]的研究结果相反，他们认为光照能够促进链格孢菌丝生长和产孢。病原菌的致死温度为50℃水浴处理10 min。
防治药剂室内毒力测定结果表明，9种杀菌剂对病原菌均有不同程度的抑制作用且抑制效果差异显著，其中250 g/L嘧菌酯悬浮剂抑制效果最好，EC50为1.258 mg/L;10%苯醚甲环唑水分散粒剂和250 g/L吡唑嘧菌酯乳油抑制效果次之，EC50分别为1.555 mg/L和1.727 mg/L，这与王芳等[42]和张丹华等[43]对A.alternata的毒力测定试验结果相似。再者是50%啶酰菌胺水分散粒剂，抑菌效果最差的为75%百菌清可湿性粉剂，其EC50高达10 894.317 mg/L。周英等[46]在对猕猴桃黑斑病菌进行室内药剂筛选时也得到相同的结果，认为75%百菌清可湿性粉剂对病原菌A.alternata的抑制效果较弱或不明显。
本研究对青海省樱桃叶斑病菌A.alternata的生物学特性进行分析，并用9种杀菌剂对其进行室内毒力测定，该试验结果可为青海省樱桃叶斑病的防治提供技术参考。由于药剂试验是在室内进行，田间防治效果还需进一步验证。
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（责任编辑：杨明丽）
关键词 ：樱桃; 叶斑病; 链格孢; 生物学特性; 毒力测定
中图分类号：
S 436.629
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020107
Biological characteristics of pathogen causing leaf spot disease of cherry in Qinghai
province and toxicity test of different fungicides in laboratory
LIU Qiao#， NING Nannan#， MA Yongqiang*， GUO Qingyun*
（Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Qinghai University， Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management， of Qinghai， Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Biotechnology， Ministry of Education， Xining 810016， China）
Abstract
The aim of this study is to confirm the biological characteristics of Alternaria alternata causing leaf spot disease of cherry in Qinghai province and to screen out the best fungicides. Influence of different culture conditions on mycelium growth and sporulation of pathogen was investigated using the mycelial growth rate method and spore counting method. The toxicity of nine fungicides to the pathogen was determined by mycelial growth inhibition method in laboratory. The results showed that the optimal medium for mycelium growth and sporulation was PSA medium and PDA medium， respectively. The optimal temperature was 25℃， the optimal nitrogen source was peptone， the optimal carbon source was inositol and lactose， and the optimal pH value was 6-8 and 6-7， respectively. 24 h dark treatment was more favorable for mycelium growth and sporulation. Nine kinds of fungicides had different inhibition activity on the pathogen. Among them， azoxystrobin 250 g/L SC has the best antibacterial effect， with the EC50 value of 1.258 mg/L. The results provide a theoretical basis for the control of cherry leaf spot in Qinghai province.
Key words
cherry; leaf spot; Alternaria alternata; biological characteristics; toxicity test
甜樱桃原产于西亚、非洲西北部和黑海沿岸，早在16世纪就作为果树栽培，现已在世界范围内种植，目前主要有土耳其、美国、伊朗、乌克兰、德国、西班牙和意大利等60多个国家进行商业化栽培[12]。在我国作为果树栽培最早始于19世纪70年代，目前，国内作为经济栽培的樱桃除了甜樱桃外，还有中国樱桃、酸樱桃和毛樱桃，但以欧美甜樱桃为主，主要分布在山东、辽宁、陕西、四川、河南、贵州等地[3]。樱桃果实中含有丰富的蛋白质、维生素、以及铁、钾、钙、磷等多种矿物质，能够促进能量代谢、增加人体免疫力、延缓机体衰老，医疗保健价值颇高，被誉为“水果中的钻石”[4]。此外，樱桃还具有较高的药用价值，其根、枝、叶、核、鲜果皆可入药，能治疗多种疾病[5]。樱桃经济效益高，生产前景广，因此在我国各省市有大面积的推广栽培。 青海省于1994年首次试点栽培甜樱桃，目前全省的樱桃栽培面积已发展到800 hm2，主要集中在海拔2 200 m以下的湟水河流域及黄河河谷地带的平原川水地区和黄土丘陵浅山地带[6]。青海省地处青藏高原东北部，是长江、黄河和澜沧江的发源地，其地形地貌復杂多样，属高原大陆性气候，光照时数长，太阳辐射强，昼夜温差大，降雨量少，温度相对较低，年平均气温在-5～8℃之间[7]。由于特殊的地理位置和气候条件，病虫害极轻，产出的樱桃果实品质极佳。再加上栽培方式多为露地栽培，成熟期较其他各省晚，大大延长了国内樱桃产品的供应时间，发展前景广阔。
近年来，由于青海省气温升高，雨量增加，导致发生在樱桃上的病害种类和危害程度明显上升。其中，叶斑病发生最为严重，在7、8月份病株率高达100%。病菌在叶片上引起圆形或近圆形的褐色或紫红色病斑，严重时，病斑相互连接成不规则状，使叶片失绿黄化，导致树体衰弱，果实大量减产。本研究组通过形态学和分子生物学手段，将病原菌鉴定为链格孢Alternaria alternata、细极链格孢A.tenuissima和刺盘孢属Colletotrichum spp.，分离频率分别为84.95%、5.02%和10.03%[8]。本文在青海省樱桃叶斑病病原鉴定的基础上对主要病原菌A.alternata的生物学特性进行研究，并用9种化学试剂对其防效进行评价，旨在为青海省樱桃叶斑病的科学防控提供理论支撑和技术指导。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
樱桃叶斑病菌HS002（链格孢A.alternata），分离自海东市乐都区樱桃病叶，保存在青海省农林科学院植物保护研究所青海省农业有害生物综合治理重点实验室。
1.2 供试培养基
参照张秀伟等[9]、安颖等[10]、孙宇等[11]和马雪儿等[12]对病原菌生物学特性的研究方法，本研究选择了马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、燕麦片琼脂培养基（OA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、淀粉琼脂培养基（SA）、葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（GPA）、麦芽糖琼脂培养基（MA）、酵母膏琼脂培养基（YEA）、査氏培养基（Czapek）、马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）、水琼脂培养基（WA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）和V8培养基等12种培养基对樱桃叶斑病菌A.alternata进行培养，筛选该病原菌生长和产孢的最适培养基。
1.3 供试药剂
本试验所用的杀菌剂种类、厂家及稀释倍数见表1。
1.4 樱桃叶斑病病原菌生物学特性研究
1.4.1 不同培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
将病原菌接种在PDA平板上，25℃黑暗培养6 d，使其形成供试菌落。配制12种供试培养基，于121℃下湿热灭菌30 min，待温度下降至60℃左右时，在无菌条件下分别倒入直径为9 cm的培养皿中制成平板[1214]。用灭菌打孔器沿供试菌株菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼接种在平板中央，重复3次，置于25℃下黑暗培养6 d后，用十字交叉法测量菌落直径取平均值。培养12 d后，采用十字交叉法，用直径为5 mm的打孔器从平板中央向边缘依次打取不同部位的菌丝块，每皿20块，放入20 mL无菌水中，压碎菌饼并不断搅拌，使分生孢子充分混匀于无菌水中，于显微镜下用血球计数板测定孢子数量[14]。
1.4.2 温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
在培养好的供试病原菌菌落边缘打取5 mm的
菌饼接种在PDA平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃和40℃下进行黑暗培养[15]，重复次数、菌落直径和产孢量的测量方法同1.4.1。
1.4.3 碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
以PDA培养基为基础培养基，以不加糖的PDA培养基为对照，以淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、肌醇、乳糖、山梨醇、木糖为碳源等质量替换PDA培养基中的葡萄糖配制成不同含碳培养基[12]，处理方法同1.4.1。
1.4.4 氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
以 PDA 培养基为基础培养基和对照，分别加入3 g NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4、NH4NO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏配制成不同含氮培养基[16]，处理方法同1.4.1。
1.4.5 pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
用1 mol/L HCl和NaOH将无菌PDA培养基的pH调至4～12后，制成平板[15]。处理方法同14.1。
1.4.6 光照周期对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
将病原菌菌饼接在PDA平板中央，分别置于25℃恒温培养箱中进行24 h持续光照、24 h持续黑暗、L∥D=12 h∥12 h光暗交替培养[17]。重复次数、菌落直径和产孢量的测量方法同1.4.1。
1.4.7 菌丝致死温度测定
在无菌条件下，打取供试病原菌菌饼置于试管中，分别放入35、40、45、50、55℃和60℃恒温水浴锅中水浴10 min（到达设定温度时开始计时）。以室温下放置的试管作为对照，重复3次[18]。将菌饼接种在PDA平板上，25℃黑暗培养3 d后观察病原菌的生长状况。
1.5 室内毒力测定
1.5.1 含药培养基的制备
将所有供试药剂按照推荐浓度分别稀释相应的倍数备用。将配制好的PDA培养基分装在容量为250 mL的三角瓶中，每瓶99 mL，封口后进行灭菌。待温度冷却至60℃左右时，在无菌条件下，将配制好的药剂分别加入到PDA培养基中，最终稀释倍数如表1所示，以不加药剂的PDA平板作为对照，再加入少量的链霉素，防止细菌污染。振荡摇匀后倒入直径为9 cm的一次性培养皿中，制成不同的含药平板[19]。 1.5.2 不同药剂对病原菌菌丝生长的毒力测定
采用菌丝生长抑制率法[20]，将供试病原菌菌饼接种在不同含药培养基中央，重复5次。25℃黑暗培养6 d后测量菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。以菌丝生长抑制率几率值作为因变量（y），药剂浓度的自然对数值作为自变量（x），利用最小二乘法建立“浓度对数-几率值”直线方程（y=ax b）[21]。采用Excel 2010、SPSS 19.0等软件，求出各药剂对樱桃叶斑病菌的抑制中浓度（EC50），以衡量不同杀菌剂对病原菌的毒力效果。
抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。
2 结果与分析
2.1 病原菌的生物学特性
2.1.1 不同培养基对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
病原菌在12种供试培养基上均能生长但差异显著（P<0.05），在GPA、PSA和MA培养基上菌丝生长较快，但在GPA和MA培养基上菌丝较稀疏;其次是PDA、OA、CMA和V8培养基，但在OA和CMA培养基上菌丝生长不紧密且在OA上颜色较浅;在PCA、WA、Czapek和YEA培养基上菌丝生长较慢。SA培养基则不利于菌丝生长，其菌落直径显著小于其他培养基上的菌落直径。不同培养基对病原菌产孢量的影响也显著不同，在PDA和PSA培养基上产孢量显著多于其他培养基上的产孢量，且在PDA培养基上产孢量最多;其次是GPA培养基，在SA、YEA、OA、PCA和CMA培养基上产孢较少，而在MA、Czapek、WA和V8培养基上不产孢（图1）。
2.1.2 温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
病原菌在5～35℃下均能生长，但差异显著。在25℃时，菌落直径最大，显著大于其他温度条件下的菌落直径;在15～35℃时菌落生长良好，其中在30～35℃时菌落生长较快;5℃和10℃时菌落生长较慢，而40℃时菌落不生长。病原菌产孢的最适温度为25℃，显著多于其他温度条件下的产孢量，在20℃、30℃和35℃下产孢较多;在5℃和10℃下产孢量较少，其中5℃下产孢最少（40℃除外）;而在40℃下菌落不生长也不产孢（图2）。
2.1.3 碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
菌丝在以肌醇为碳源的培养基上生长最快，菌落直径最大;以蔗糖、果糖、乳糖和山梨醇为碳源的培养基上，菌落生长较好，菌落直径显著大于对照;以葡萄糖、麦芽糖和淀粉为碳源的培养基上菌落大小與对照差异不显著;而以木糖为碳源的培养基上菌落直径最小，显著小于对照。病原菌在以乳糖为碳源的培养基上产孢最多;在以肌醇、果糖、木糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇为碳源的培养基上产孢次之，其产孢量均显著多于对照;而在以麦芽糖和淀粉为碳源的培养基上产孢量与空白碳源培养基上的产孢量无显著差异（图3）。
2.1.4 氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
菌丝生长的最适氮源是蛋白胨，在以蛋白胨为氮源的培养基上菌落直径显著大于其他氮源培养基上的菌落直径，但与对照无显著差异。在以KNO3为氮源的培养基上菌丝生长相对较快，而以牛肉膏、酵母膏、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3为氮源能够显著抑制菌丝生长。病原菌在以蛋白胨为氮源的培养基上产孢最多，其次是KNO3，两者的产孢量均显著多于其他氮源培养基上的产孢量，但与对照差异不显著;而在以牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3为氮源的培养基上，病原菌的产孢量严重受到抑制，显著低于对照;而在以酵母膏为氮源的培养基上不产孢（图4）。
2.1.5 pH对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
病原菌在pH为4～12范围内均能生长和产孢，但差异显著。菌丝生长的最适pH为6～8，产孢的最适pH为6～7，过酸过碱均不利于菌丝生长和产孢（图5）。
2.1.6 光照周期对病原菌菌丝生长和产孢量的影响
在24 h持续黑暗处理条件下，菌丝生长速率最快，菌落直径显著大于其他2种光照周期下的菌落直径;其次是24 h光照处理，而12 h∥12 h光照黑暗交替条件不利于菌丝生长。24 h持续黑暗处理有利于产孢，其产孢量显著多于其他2种光照周期下的产孢量;24 h持续光照处理和12 h∥12 h光照黑暗交替条件下产孢量较少且无显著差异（图6）。
2.1.7 菌丝致死温度
将分别在35～60℃的恒温水浴锅内处理10 min的菌饼接种在PDA平板上，置于25℃下黑暗培养3 d后，结果发现在35～50℃条件下处理10 min后，菌丝能够生长且产生新的菌落，而在50℃及以上条件下菌丝不生长，说明病原菌菌丝的致死条件为50℃处理10 min。
2.2 室内毒力测定结果
9种化学药剂对病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，且随药剂浓度的升高抑制作用逐渐增强（图7）。表2结果显示，在不同防治药剂中250 g/L嘧菌酯SC抑制效果最好，EC50为1.258 mg/L;10%苯醚甲环唑WG和250 g/L吡唑嘧菌酯EC抑制效果次之，EC50分别为1.555 mg/L和1.727 mg/L;再者是50%啶酰菌胺WG，EC50为11.348 mg/L;抑菌效果最差的为75%百菌清WP，其EC50高达10 894.317 mg/L。
3 结论与讨论
樱桃叶斑病是由多种不同病原菌引起的一种世界性真菌病害，常造成樱桃果实大量减产，是遏制樱桃产业发展的主要病害之一[2228]。青海省樱桃病害以叶斑病发生最为普遍，主要危害樱桃叶片，尤其是下部老叶更容易发病。本研究组前期将其病原菌鉴定为链格孢、细极链格孢和刺盘孢属，其中以链格孢病原菌为主。研究发现，链格孢作为链格孢属的模式种，具有侵染能力强、寄主范围广和危害程度重等特点，可引起观赏凤梨叶斑病[29]、枸杞叶枯病[30]、草莓叶斑病[31]、番茄黑斑病[32]、香榧果实褐斑病[33]和紫花苜蓿叶斑病和枯萎病[34]等多种植物病害。此外，该病原菌还可以侵染骏枣、蓝莓、向日葵、菊花和鹰嘴豆等多种植物，使其发病，表现出明显的症状[3539]。 国内外对于链格孢引起的病害防控主要依赖于化学药剂。然而，化学药剂的种类和剂量的选择成为病害防控过程中的一个突出问题。为此，很多学者对链格孢进行防治药剂的室内毒力测定。孙洁等[40]通过菌丝生长速率法测定了8种杀菌剂对新疆红枣缩果病菌A.alternata菌丝的毒力，结果表明，70%代森锰锌WP和50%福美双WP对病原菌菌丝生长的抑制效果较好;其次为70%丙森锌WP和75%百菌清WP;抑制作用最差的为25%阿米西达SC和70%甲基硫菌灵WP。王志霞等[41]通过菌丝生长抑制率法和孢子萌发抑制率法测定了5种杀菌剂对新疆红枣叶斑病菌A.tenuissima和A.alternata的毒力，结果表明，70%代森锰锌对病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果最好。王芳等[42]选择了7种杀菌剂对玉米大斑病病原菌A.alternata进行毒力测定，结果表明，50%异菌脲WP抑制效果最好，当试验浓度为50 mg/L时，抑制率可达95%。此外，张丹华等[43]对重庆地区枇杷叶斑病菌A.alternata进行防治药剂室内筛选，认为5种杀菌剂中10%苯醚甲环唑WG的抑制效果最好，EC50为3.84 mg/L。
本研究对青海省樱桃叶斑病主要病原菌A.alternata进行了生物学特性研究及室内防治药剂的筛选，结果表明，不同培养条件对菌丝生长和产孢量均有显著影响，且菌落颜色、厚度以及菌丝的生长状况显著不同。病原菌在12种供试培养基上均能生长，但在PSA培养基上生长最佳。病原菌生长的温度范围比较广，在5～35℃条件下均能生长，适宜温度是25～30℃，最适温度为25℃，而温度高于40℃时，菌落不生长，这与孙洁等[40]、王志霞等[41]和詹文平等[44]的研究结果相似。病原菌在不同碳氮源培养基上均能生长，但对碳氮源具有一定的选择性，其中以肌醇为碳源，蛋白胨为氮源最有利于菌丝生长，而以乳糖为碳源，蛋白胨为氮源最有利于产孢。病原菌在不加碳氮源培养基上虽能快速生长，但菌丝稀疏、菌落稀薄且颜色较浅，由此可知碳氮源对病原菌的生长具有重要作用。病原菌在pH为4～12条件下均能生长，且菌丝生长的最适pH为6～8，产孢的最适pH为6～7，过酸过碱均不利于菌丝生长和产孢，这与孙洁等[40]的研究结果相同。病原菌在3种光照周期下均可生长和产孢，持续黑暗条件下菌丝生长最快，产孢量最多，这与乔镜澄等[32]的研究结果相同，与沈会芳等[14]和刘晓琳等[45]的研究结果相反，他们认为光照能够促进链格孢菌丝生长和产孢。病原菌的致死温度为50℃水浴处理10 min。
防治药剂室内毒力测定结果表明，9种杀菌剂对病原菌均有不同程度的抑制作用且抑制效果差异显著，其中250 g/L嘧菌酯悬浮剂抑制效果最好，EC50为1.258 mg/L;10%苯醚甲环唑水分散粒剂和250 g/L吡唑嘧菌酯乳油抑制效果次之，EC50分别为1.555 mg/L和1.727 mg/L，这与王芳等[42]和张丹华等[43]对A.alternata的毒力测定试验结果相似。再者是50%啶酰菌胺水分散粒剂，抑菌效果最差的为75%百菌清可湿性粉剂，其EC50高达10 894.317 mg/L。周英等[46]在对猕猴桃黑斑病菌进行室内药剂筛选时也得到相同的结果，认为75%百菌清可湿性粉剂对病原菌A.alternata的抑制效果较弱或不明显。
本研究对青海省樱桃叶斑病菌A.alternata的生物学特性进行分析，并用9种杀菌剂对其进行室内毒力测定，该试验结果可为青海省樱桃叶斑病的防治提供技术参考。由于药剂试验是在室内进行，田间防治效果还需进一步验证。
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（责任编辑：杨明丽）