【摘 要】
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DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用.但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶.文中克隆表达了超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis) A501来源的B家族DNA聚合酶基因(NCBI数据库基因登录号为TEU_RS04875)、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用.将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶(Teu-PolB)进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5\
【机 构】
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上海交通大学微生物代谢国家重点实验室生命科学技术学院,上海200240
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DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用.但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶.文中克隆表达了超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis) A501来源的B家族DNA聚合酶基因(NCBI数据库基因登录号为TEU_RS04875)、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用.将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶(Teu-PolB)进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5\'端带荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Teu-PolB的生化特性;以噬菌体λDNA基因组为模板,探究Teu-PolB的PCR应用.结果 显示,Teu-PolB具有DNA聚合酶活性和3\'→5\'核酸外切酶活性,该酶在98℃下的半衰期约为2h,热稳定性高.使用Teu-PolB进行PCR扩增,最适PCR缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2.5 mmol/L MgC12,60 mmol/L KC1,10 mmol/L (NH4)2SO4,0.015％ Triton X-100和0.01％ BSA,最适延伸温度为68℃.此外,Teu-PolB能在2kb/min条件下成功扩增4kb目的 片段,扩增产量弱于商品化Taq DNA聚合酶,优于Pfu DNA聚合酶,但扩增速率和保真度优于Taq和Pfu DNA聚合酶,且对盐的耐受性较高.综上所述,本研究鉴定了一种高保真DNA聚合酶Teu-PolB的生化特性,结果表明该酶可应用于PCR扩增,具有热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高等特征.
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