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摘要：为了检测不同处理方式对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）R15在辣椒根部定殖数量和防治辣椒疫病效果的影响，利用重复伤根法、重复伤根接种法、重复浇灌尿素溶液法、重复灌菌液接种法处理接种R15的辣椒苗，测定各个处理组在第一次接种后5～60 d的定殖数量，以及在接种10、25、40、55 d对辣椒疫病的防治效果。结果表明，重复伤根处理对R15菌株的定殖量增加有限；重复伤根接种能使内生细菌的定殖量明显增加，但是多次伤根对植物体造成伤害，植株防治辣椒疫病的能力下降；重复浇灌尿素溶液使内生细菌的定殖量缓慢下降，但是防效提高不显著；重复灌菌液接种能使内生细菌R15在辣椒体内的定殖数量大于105.61CFU/g，防治效果维持在80%～100%之间。因此，生防菌R15的使用方法是在第一次接种后，每隔15～20 d在辣椒根部进行菌液灌根，可以高效防治辣椒疫病。
关键词：内生细菌；辣椒疫病；定殖；防效；接种方法；处理方式
中图分类号： S182；S436.418文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0076-04
辣椒疫病是危害辣椒的主要病害之一，辣椒疫病俗称死秧病，该病害是一种土传病害，病原菌可以在土壤中长时间存活，使得该病害成为生产上最难防治的一种病害。从苗期到成株期都能引起严重的危害，在高温、高湿条件下可在短期内引起大面积死苗、烂叶和烂果，不仅严重影响了辣椒的产量和品质，甚至导致绝收，是一种毁灭性病害。目前防治辣椒疫病主要以化学防治为主，例如甲霜灵、三乙膦酸铝、氯唑灵、霜霉威盐酸盐等[1]。但长期使用这些杀菌剂容易引起病原菌的抗药性，导致用药量不断提高，同时容易造成药物残留、污染环境、威胁人类健康等问题。植物体内存在大量具有拮抗活性的菌株，它们对由病原真菌、细菌、寄生线虫引起的植物病害有着不同程度的防治作用，通过不同的生防机制，使植物免受或减轻危害，有些还具有促生作用。内生细菌由于定殖在植物体内，不易受环境影响，目前已经引起植物学家、微生物学家等的重视，成为研究的热门课题。近年来已从自然界中分离筛选到大量对辣椒疫病具有防控作用的生防菌[2-6]。
但目前利用内生细菌防治植物病害，还没有在农业生产上大面积推广应用，主要是因为应用效果不稳定。田间环境和植物体微生态环境中许多因子都会影响内生细菌防病作用的发挥。Weyens等认为内生细菌防效不稳定的原因之一是定殖量不稳定[7]。例如2株产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的内生细菌DP24和XG32都能够定殖在辣椒体内，DP24和XG32在辣椒根部达到最大定殖量的时间分别为接种后7、12 d，随后逐渐下降，30 d后在根部检测不到这2种细菌的存在[8]。笔者所在实验室筛选到1株能有效防治辣椒疫病的内生细菌Pseudomonas fluorescens R15，它能稳定定殖在辣椒体内，并且在定殖量高于6.3×105 CFU/g，防治辣椒疫病的效果达到100%。但是定殖一段时间后，其定殖数量逐渐下降，防治效果也逐渐降低，定殖30 d后防治辣椒疫病的效果为70.8%，防治效果不太理想[9]。文才艺等研究了内生细菌EBS05在小麦体内的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治作用，发现接种初期EBS05在小麦体内的定殖量逐渐增加，10～12 d定殖数量达到最大，防治效果最好，建议在应用EBS05进行小麦纹枯病防治时，分别于发病高峰期即冬前期和返青期的前10 d左右施药可达到理想的防治效果[10]。现阶段关于如何使内生细菌成功定殖，并确保一定的定殖数量以及达到良好的防治效果方面的研究尚未见报道。
内生细菌成功接入宿主植物的技术已经成熟，例如通过伤根、灌根、蘸根、喷洒、涂抹、浸种等人工接种方法能使内生细菌成功定殖在植物体内。内生细菌采用不同的接种方式以及宿主的健康状况对内生细菌在植物体内的成功定殖并发挥作用起着决定性作用[11]。目前还未见报道关于使接种内生细菌在宿主体内稳定保持一定菌体数量的处理方法。本研究通过对成功定殖内生细菌的辣椒苗进行不同处理，从定殖数量和对辣椒疫病的防效上研究了这些处理方法对内生细菌R15菌株在辣椒根部的定殖量及防治效果的影响，为内生细菌在农业上更有效防治病原菌提供理论依据及技术支持。
1材料与方法
1.1试验材料及菌种培养
菌株R15经鉴定为荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biovar Ⅱ）；定殖试验和防效试验表明其具有在辣椒体内定殖的能力和防治辣椒疫病的特性[9]。
辣椒疫霉菌孢子悬浮液的制备：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）由山东农业大学植物保护学院张修国教授惠赠。辣椒疫霉菌接种到燕麦培养基（50 g燕麦，1 000 mL蒸馏水，20 g琼脂）上，置于25 ℃光照培养箱中培养7 d，用蒸馏水洗下孢子囊，配制孢子囊悬浮液。置4 ℃冰箱内30 min，诱导孢子释放，纱布过滤，用无菌水稀释到105个孢子/mL。
辣椒品种为加州特大牛角椒，种子购自江苏明天种业科技有限公司，催芽后播种到无菌土中，2片子叶时移栽至 10 cm×15 cm（直径×高）的花盆中，每盆4株苗，4～6叶期时供试验用。
精甲霜·锰锌，购自先正达（中国）投资有限公司。
1.2接种剂的准备
参照Simons等的方法[12]对R15进行抗生素标记，筛选到抗300 μg/mL链霉素的突变株，其菌落形态及拮抗活性与原菌株基本一致。将标记的R15菌株接种到装有含链霉素的50 mL牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩48 h。将发酵好的菌株发酵液离心留下菌体，悬浮在无菌水中，利用分光光度计把浓度调为108 CFU/mL。
1.3试验设计和内生细菌定殖数量调查方法 选取4～6叶期长势一致的辣椒盆栽苗，用伤根法接入内生细菌，每株接种12.5 mL，分别在接种15、30、45 d后进行如下处理，处理1：对接种的辣椒苗每隔15 d伤根并接种1次，共接种3次；处理2：对接种的辣椒苗每隔15 d伤根1次，共伤根3次；处理3：对接种的辣椒苗每隔15 d在根部周围浇灌0.16%尿素溶液1次，共3次；处理4：对接种的辣椒苗每隔 15 d 灌根接种菌液1次，共接种3次。设第1次接种后不处理为对照组，同时设不接种内生细菌为空白组。每组12盆，每盆4株苗，3次重复。分别在第1次接种5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d后随机选取3棵辣椒苗，分别剪取根部，清洗，晾干，称质量后，用75%乙醇表面消毒1 min，无菌水洗5次，1%次氯酸钠处理 5 min，无菌蒸馏水洗涤5次，取最后1次清洗的无菌水 200 μL 涂于牛肉膏蛋白胨平板上，若没有长出细菌，就证明消毒彻底。将用清水洗净的根置于无菌的组织匀浆器中捣碎，再用无菌蒸馏水梯度稀释，每个处理设3个重复。取稀释梯度为10-2、10-3、10-4、10-5的稀释液分别涂布于含 300 μg/mL 链霉素的牛肉膏蛋白胨平板上，每个梯度3个重复，于28 ℃培养72 h后计数。
1.4对辣椒疫病防效的试验方法
试验设计同“1.3”节，每个处理（包括对照组）分别在第1次接种10、25、40、55 d后接种辣椒疫霉孢子悬浮液，每株接 3 mL，25～28 ℃保湿7 d后调查发病情况。同时设不接种病原菌为空白对照，设清水浇苗后接病原菌作为阴性对照及喷洒农药（精甲霜·锰锌）接种病原菌的作为阳性对照。
1.5调查方法和数据统计
辣椒疫病发病情况分级标准参照曹云等的方法[13]。0级：没有发病；1级：茎基稍变黑，但植株健康不萎蔫；2级：茎基变黑1～2 cm，叶片萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：茎基变黑超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级：茎基变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎蔫；5级：植株全部枯死。
病情指数=∑（各级发病株数×各级代表数值）/（总株数×发病最重级的代表数值）×100；
发病率=发病株数/总株数×100%；
防治效果=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100%。
利用SPSS 17.0进行数据处理和方差分析，显著性水平设定P<0.05，采用Origin 8.0软件进行图形绘制。
2结果与分析
2.1不同处理对R15菌株在辣椒根内定殖动态的影响
由图1可知，对照组在接种5～15 d，R15菌株在辣椒根内定殖数量呈上升趋势，在15 d时达到最大值，为 105.86 CFU/g，15～30 d呈现逐渐下降趋势，30 d后定殖数量基本趋于稳定，保持在105.22 CFU/g左右。总体趋势为先增加后降低，最后趋于稳定。未接种R15菌株的辣椒苗没有分离出目的菌株。重复伤根接种（处理1）R15菌株定殖数量有大幅度增加，定殖数量最大，为106.06 CFU/g。只伤根处理方法（处理2）虽然能刺激内生细菌定殖数量的变化，但与重复伤根接种比较不能使定殖数量明显增加和维持较高的定殖量。接种后浇灌尿素溶液（处理3）R15菌株定殖数量比对照组下降慢，当内生细菌的定殖数量达到最低时，再次浇灌尿素溶液（40 d），R15菌株的量有稍微增加的趋势。多次灌根菌液（处理4）R15菌株的定殖数量明显增加，每次灌根处理后R15菌株最大定殖量分别增加到105.79（30 d）、106.03（45 d）、106.06 CFU/g（60 d），并且在50 d后，內生细菌R15菌株的数量高于多次伤根接种组（处理1）的定殖数量。
2.2内生细菌R15接种后在辣椒根内的定殖动态与其防效的关系
由图2可知，接种内生细菌R15后，辣椒苗不进行任何处理，防治辣椒疫病的效果与定殖数量呈正相关，即内生细菌定殖数量越高，防治效果越好；定殖数量趋于稳定，防治效果也稳定。总体来看，内生细菌R15对辣椒疫病的效果呈先下降后稳定的趋势，最低防治效果为58.3%。对未定殖内生细菌R15的辣椒苗在接种辣椒疫霉前先喷洒农药，7 d后调查辣椒的发病情况，农药组的防效维持在85.4%左右。25 d后农药组控制辣椒疫病的效果均高于接种内生细菌R15处理组。而清水处理后接种辣椒疫霉组的辣椒苗全部枯死。
2.3重复伤根接种内生细菌定殖动态与防治辣椒疫病关系
由图3可知，多次重复伤根接种处理内生细菌的定殖量都保持在较高水平，尽管在10、25 d防治辣椒疫病的效果较高，但是在40 d后防治效果却出现下降趋势，55 d防治效果仅为75.6%，低于农药组的防治效果。
2.4重复伤根内生细菌在辣椒体内定殖动态与防效的关系
由图4可知，尽管伤根能使内生细菌的定殖量有所增加，但是对辣椒疫病的防治效果却逐渐降低，防治辣椒疫病的效果与内生细菌的定殖数量不成正相关关系。并且在每次处理后10 d接种辣椒疫霉，防治病原菌的效果均低于农药组，防治辣椒疫病的效果不理想。
2.5重复浇灌尿素内生细菌定殖动态与防效的关系
由图5可知，内生细菌R15防治辣椒疫病的效果与“22”节中相似，即防治辣椒疫病的效果随着内生细菌定殖数量的变化而变化。接种后25 d对病原菌的防效明显高于“2.2”节中同一天的防效。可能由于浇灌尿素溶液，内生细菌定殖数量下降缓慢，防治病原菌的效果有所增加，但提高不显著（P>0.05）。
2.6重复灌根接种内生细菌在辣椒根部定殖动态与防效的关系
由图6可知，接种R15后进行灌根菌液处理，防治辣椒疫病的效果分为91.7%（25 d）、100%（40 d）、100%（55 d），定殖数量维持在较高水平，对疫病的防治效果也较高。与“2.3”节相比，第1次接种25 d后，防治辣椒疫病的能力较低，但是40 d后，重复伤根接种组的防效逐渐下降，而重复灌根接种组的防效依然保持在较高水平。 3讨论
植物与内生细菌在长期的共同进化中形成了一种微妙的关系，内生细菌己经成为植物微生态系统的天然组成成分，内生细菌的存在可以促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保证寄生植物的健康生长。内生细菌生物防治的效果与其定殖能力密切相关。一株优秀的生防菌能否发挥生防能力的第一步就是在寄主植物的根围以及其他生境稳定定殖。某些内生菌与病原菌之间存在拮抗作用，但是因为接种的拮抗菌株难以在宿主植物根部定殖和表达而难以取得理想的防治效果[14]。植物内生细菌具有生防作用的机制之一是与病原菌竞争生态位点。内生细菌定殖在植物体内，可以优先占据病原菌入侵位点，并和病原菌竞争营养物质，使得病原菌无法侵入植物体或者是侵入后无法定殖或者缺乏足够的营养供给而死亡。内生细菌在寄主植物中的数量是制约其发挥生防作用的关键因素之一。Sturz等研究马铃薯软腐病的严重程度与能抑制这种病菌的内生菌数量的关系，发现内生菌越少，植物病害严重程度越重，即两者成负相关[15]。本研究在付思雅等的研究[9]基础上进一步证明了内生细菌R15定殖量在1～30 d内呈现先增加后降低的趋势，并且防治辣椒疫病的效果与内生细菌在辣椒根部的定殖数量呈正相关。在30 d后，定殖数量趋于稳定，防治效果也趋于平稳。这些数据说明R15菌株防治辣椒疫病的能力与其定殖量紧密相关。本研究解决的问题是如何保证R15菌株能成功、稳定、持续地并且较高水平地定殖在辣椒根部以及获得良好的生防效果。
内生细菌侵入宿主的方式和途徑是多样的。许多学者认为内生细菌是通过自然孔口（植物叶片上的气孔、水孔、茎上的皮孔、蜜腺、胚根以及次生根发生处等）和伤口（包括根在土壤中伸展造成的持续不断的擦伤口、雨水或冰雹和收割多年生植物等造成的机械损伤等）等进入植物体内[16-17]。农倩等研究表明，菌株B196通过浸种和喷雾的方法接种于水稻植株，从根、叶、叶鞘组织都分离到该菌株，表明菌株B196可通过水稻植株的自然孔口或伤口进入植物体内，并稳定定殖在水稻体内[18]。研究发现植物体中寄生的各种内生细菌大多来自于根际土壤[19-20]，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、产碱菌属（Alcaligenes）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）等菌株。本研究结果显示，对伤根接种R15菌株的辣椒苗进行多次伤根处理，菌株定殖数量有少量的增加，分析认为存在根际周围的R15菌体通过伤口进入植物体内，由于存在数量有限，进入根内的菌体也少；重复伤根接种处理，每次都能从外界增加大量的菌体数量，因此能明显增加根内R15菌株的定殖数量。但是，重复伤根和重复伤根接种对疫病的防治效果却逐渐下降。分析认为多次伤根对植物伤害比较严重，导致植物抵抗病原菌的能力降低和植物过多的伤口为疫病病菌侵染创造了机会，因此导致防效下降。
内生细菌对植物侵染（或者随种子进行垂直传播）、在植物体细胞内或者细胞间定殖以及内生细菌孢子萌发、菌体生长繁殖和代谢等过程均受宿主植物的表型和基因型的影响，并且需要合适的温度、光照、湿度、地理位置、植被等[21-24]环境条件以及合适的碳、氮等营养条件。潘江禹等研究不同肥料对生防菌淡紫拟青霉E7定殖的影响，发现施用一定浓度的肥料能有效提高淡紫拟青霉的根际定殖能力[25]。本试验在推测内生细菌R15菌株的生长繁殖需要N元素的基础上进行重复浇灌尿素溶液处理，调查结果显示，R15的定殖数量比未浇尿素组相比下降慢，并且防治效果比未处理组有所增加。分析认为氮素对R15菌株的定殖数量有影响。
Ledger等研究发现Cupriavidus pinatubonensis JMP134能利用拟南芥和洋槐根系的分泌物定殖在其根部的表皮以及皮层，且在根部的定殖量随接入量的增加而增大[26]。Liu等研究了E1R-j的接种量与小麦患全蚀病的严重程度的关系，发现接种量越大，患病植株越少，患病程度越低[27]。本试验通过重复灌根接种，相当于逐渐加大了辣椒根际R15菌株的数量，由此使辣椒根内的定殖数量有所增加，且高于 105.61 CFU/g，同时对辣椒疫病的防效高于80%。因此，建议在应用R15菌株进行防治辣椒疫病时，应采用每隔15～20 d进行灌根接种处理1次。但是，本试验仅为在实验室条件下得出的结果，在大田中的效果如何，还需要进一步进行验证。
4小结
本试验在内生细菌R15菌株的定殖数量对辣椒疫病的防治效果的影响研究基础上，探索了R15菌株的接种方法和处理方法。发现不同的处理方法对内生细菌定殖动态以及防效影响的一些规律。在接种1次R15菌株后单纯采用伤根和浇灌尿素处理对R15的定殖数量增加影响有限，同样也不会明显增加对疫病的防效；重复伤根接种虽然能维持R15的定殖数量但对疫病的防效不能保持在较高水平；接种后重复浇灌菌液接种能明显提高R15菌株的定殖数量，对疫病的防效也能维持较高的水平。
参考文献：
[1]Akgül D S，Mirik M. Biocontrol of Phytophthora capsici on pepper plants by Bacillus megaterium strains[J]. Journal of Plant Pathology，2008，90（1）：29-34.
[2]Wang Y，Zeng Q G，Zhang Z B，et al. Antagonistic bioactivity of an endophytic bacterium H-6[J]. African Journal of Biotechnology，2010，9（37）：6140-6145.
[3]Yang M M，Xu L P，Xue Q Y，et al. Screening potential bacterial biocontrol agents towards Phytophthora capsici in pepper[J]. European Journal of Plant Pathology，2012，134（4）：811-820.
关键词：内生细菌；辣椒疫病；定殖；防效；接种方法；处理方式
中图分类号： S182；S436.418文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0076-04
辣椒疫病是危害辣椒的主要病害之一，辣椒疫病俗称死秧病，该病害是一种土传病害，病原菌可以在土壤中长时间存活，使得该病害成为生产上最难防治的一种病害。从苗期到成株期都能引起严重的危害，在高温、高湿条件下可在短期内引起大面积死苗、烂叶和烂果，不仅严重影响了辣椒的产量和品质，甚至导致绝收，是一种毁灭性病害。目前防治辣椒疫病主要以化学防治为主，例如甲霜灵、三乙膦酸铝、氯唑灵、霜霉威盐酸盐等[1]。但长期使用这些杀菌剂容易引起病原菌的抗药性，导致用药量不断提高，同时容易造成药物残留、污染环境、威胁人类健康等问题。植物体内存在大量具有拮抗活性的菌株，它们对由病原真菌、细菌、寄生线虫引起的植物病害有着不同程度的防治作用，通过不同的生防机制，使植物免受或减轻危害，有些还具有促生作用。内生细菌由于定殖在植物体内，不易受环境影响，目前已经引起植物学家、微生物学家等的重视，成为研究的热门课题。近年来已从自然界中分离筛选到大量对辣椒疫病具有防控作用的生防菌[2-6]。
但目前利用内生细菌防治植物病害，还没有在农业生产上大面积推广应用，主要是因为应用效果不稳定。田间环境和植物体微生态环境中许多因子都会影响内生细菌防病作用的发挥。Weyens等认为内生细菌防效不稳定的原因之一是定殖量不稳定[7]。例如2株产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的内生细菌DP24和XG32都能够定殖在辣椒体内，DP24和XG32在辣椒根部达到最大定殖量的时间分别为接种后7、12 d，随后逐渐下降，30 d后在根部检测不到这2种细菌的存在[8]。笔者所在实验室筛选到1株能有效防治辣椒疫病的内生细菌Pseudomonas fluorescens R15，它能稳定定殖在辣椒体内，并且在定殖量高于6.3×105 CFU/g，防治辣椒疫病的效果达到100%。但是定殖一段时间后，其定殖数量逐渐下降，防治效果也逐渐降低，定殖30 d后防治辣椒疫病的效果为70.8%，防治效果不太理想[9]。文才艺等研究了内生细菌EBS05在小麦体内的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治作用，发现接种初期EBS05在小麦体内的定殖量逐渐增加，10～12 d定殖数量达到最大，防治效果最好，建议在应用EBS05进行小麦纹枯病防治时，分别于发病高峰期即冬前期和返青期的前10 d左右施药可达到理想的防治效果[10]。现阶段关于如何使内生细菌成功定殖，并确保一定的定殖数量以及达到良好的防治效果方面的研究尚未见报道。
内生细菌成功接入宿主植物的技术已经成熟，例如通过伤根、灌根、蘸根、喷洒、涂抹、浸种等人工接种方法能使内生细菌成功定殖在植物体内。内生细菌采用不同的接种方式以及宿主的健康状况对内生细菌在植物体内的成功定殖并发挥作用起着决定性作用[11]。目前还未见报道关于使接种内生细菌在宿主体内稳定保持一定菌体数量的处理方法。本研究通过对成功定殖内生细菌的辣椒苗进行不同处理，从定殖数量和对辣椒疫病的防效上研究了这些处理方法对内生细菌R15菌株在辣椒根部的定殖量及防治效果的影响，为内生细菌在农业上更有效防治病原菌提供理论依据及技术支持。
1材料与方法
1.1试验材料及菌种培养
菌株R15经鉴定为荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biovar Ⅱ）；定殖试验和防效试验表明其具有在辣椒体内定殖的能力和防治辣椒疫病的特性[9]。
辣椒疫霉菌孢子悬浮液的制备：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）由山东农业大学植物保护学院张修国教授惠赠。辣椒疫霉菌接种到燕麦培养基（50 g燕麦，1 000 mL蒸馏水，20 g琼脂）上，置于25 ℃光照培养箱中培养7 d，用蒸馏水洗下孢子囊，配制孢子囊悬浮液。置4 ℃冰箱内30 min，诱导孢子释放，纱布过滤，用无菌水稀释到105个孢子/mL。
辣椒品种为加州特大牛角椒，种子购自江苏明天种业科技有限公司，催芽后播种到无菌土中，2片子叶时移栽至 10 cm×15 cm（直径×高）的花盆中，每盆4株苗，4～6叶期时供试验用。
精甲霜·锰锌，购自先正达（中国）投资有限公司。
1.2接种剂的准备
参照Simons等的方法[12]对R15进行抗生素标记，筛选到抗300 μg/mL链霉素的突变株，其菌落形态及拮抗活性与原菌株基本一致。将标记的R15菌株接种到装有含链霉素的50 mL牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩48 h。将发酵好的菌株发酵液离心留下菌体，悬浮在无菌水中，利用分光光度计把浓度调为108 CFU/mL。
1.3试验设计和内生细菌定殖数量调查方法 选取4～6叶期长势一致的辣椒盆栽苗，用伤根法接入内生细菌，每株接种12.5 mL，分别在接种15、30、45 d后进行如下处理，处理1：对接种的辣椒苗每隔15 d伤根并接种1次，共接种3次；处理2：对接种的辣椒苗每隔15 d伤根1次，共伤根3次；处理3：对接种的辣椒苗每隔15 d在根部周围浇灌0.16%尿素溶液1次，共3次；处理4：对接种的辣椒苗每隔 15 d 灌根接种菌液1次，共接种3次。设第1次接种后不处理为对照组，同时设不接种内生细菌为空白组。每组12盆，每盆4株苗，3次重复。分别在第1次接种5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d后随机选取3棵辣椒苗，分别剪取根部，清洗，晾干，称质量后，用75%乙醇表面消毒1 min，无菌水洗5次，1%次氯酸钠处理 5 min，无菌蒸馏水洗涤5次，取最后1次清洗的无菌水 200 μL 涂于牛肉膏蛋白胨平板上，若没有长出细菌，就证明消毒彻底。将用清水洗净的根置于无菌的组织匀浆器中捣碎，再用无菌蒸馏水梯度稀释，每个处理设3个重复。取稀释梯度为10-2、10-3、10-4、10-5的稀释液分别涂布于含 300 μg/mL 链霉素的牛肉膏蛋白胨平板上，每个梯度3个重复，于28 ℃培养72 h后计数。
1.4对辣椒疫病防效的试验方法
试验设计同“1.3”节，每个处理（包括对照组）分别在第1次接种10、25、40、55 d后接种辣椒疫霉孢子悬浮液，每株接 3 mL，25～28 ℃保湿7 d后调查发病情况。同时设不接种病原菌为空白对照，设清水浇苗后接病原菌作为阴性对照及喷洒农药（精甲霜·锰锌）接种病原菌的作为阳性对照。
1.5调查方法和数据统计
辣椒疫病发病情况分级标准参照曹云等的方法[13]。0级：没有发病；1级：茎基稍变黑，但植株健康不萎蔫；2级：茎基变黑1～2 cm，叶片萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：茎基变黑超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级：茎基变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎蔫；5级：植株全部枯死。
病情指数=∑（各级发病株数×各级代表数值）/（总株数×发病最重级的代表数值）×100；
发病率=发病株数/总株数×100%；
防治效果=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100%。
利用SPSS 17.0进行数据处理和方差分析，显著性水平设定P<0.05，采用Origin 8.0软件进行图形绘制。
2结果与分析
2.1不同处理对R15菌株在辣椒根内定殖动态的影响
由图1可知，对照组在接种5～15 d，R15菌株在辣椒根内定殖数量呈上升趋势，在15 d时达到最大值，为 105.86 CFU/g，15～30 d呈现逐渐下降趋势，30 d后定殖数量基本趋于稳定，保持在105.22 CFU/g左右。总体趋势为先增加后降低，最后趋于稳定。未接种R15菌株的辣椒苗没有分离出目的菌株。重复伤根接种（处理1）R15菌株定殖数量有大幅度增加，定殖数量最大，为106.06 CFU/g。只伤根处理方法（处理2）虽然能刺激内生细菌定殖数量的变化，但与重复伤根接种比较不能使定殖数量明显增加和维持较高的定殖量。接种后浇灌尿素溶液（处理3）R15菌株定殖数量比对照组下降慢，当内生细菌的定殖数量达到最低时，再次浇灌尿素溶液（40 d），R15菌株的量有稍微增加的趋势。多次灌根菌液（处理4）R15菌株的定殖数量明显增加，每次灌根处理后R15菌株最大定殖量分别增加到105.79（30 d）、106.03（45 d）、106.06 CFU/g（60 d），并且在50 d后，內生细菌R15菌株的数量高于多次伤根接种组（处理1）的定殖数量。
2.2内生细菌R15接种后在辣椒根内的定殖动态与其防效的关系
由图2可知，接种内生细菌R15后，辣椒苗不进行任何处理，防治辣椒疫病的效果与定殖数量呈正相关，即内生细菌定殖数量越高，防治效果越好；定殖数量趋于稳定，防治效果也稳定。总体来看，内生细菌R15对辣椒疫病的效果呈先下降后稳定的趋势，最低防治效果为58.3%。对未定殖内生细菌R15的辣椒苗在接种辣椒疫霉前先喷洒农药，7 d后调查辣椒的发病情况，农药组的防效维持在85.4%左右。25 d后农药组控制辣椒疫病的效果均高于接种内生细菌R15处理组。而清水处理后接种辣椒疫霉组的辣椒苗全部枯死。
2.3重复伤根接种内生细菌定殖动态与防治辣椒疫病关系
由图3可知，多次重复伤根接种处理内生细菌的定殖量都保持在较高水平，尽管在10、25 d防治辣椒疫病的效果较高，但是在40 d后防治效果却出现下降趋势，55 d防治效果仅为75.6%，低于农药组的防治效果。
2.4重复伤根内生细菌在辣椒体内定殖动态与防效的关系
由图4可知，尽管伤根能使内生细菌的定殖量有所增加，但是对辣椒疫病的防治效果却逐渐降低，防治辣椒疫病的效果与内生细菌的定殖数量不成正相关关系。并且在每次处理后10 d接种辣椒疫霉，防治病原菌的效果均低于农药组，防治辣椒疫病的效果不理想。
2.5重复浇灌尿素内生细菌定殖动态与防效的关系
由图5可知，内生细菌R15防治辣椒疫病的效果与“22”节中相似，即防治辣椒疫病的效果随着内生细菌定殖数量的变化而变化。接种后25 d对病原菌的防效明显高于“2.2”节中同一天的防效。可能由于浇灌尿素溶液，内生细菌定殖数量下降缓慢，防治病原菌的效果有所增加，但提高不显著（P>0.05）。
2.6重复灌根接种内生细菌在辣椒根部定殖动态与防效的关系
由图6可知，接种R15后进行灌根菌液处理，防治辣椒疫病的效果分为91.7%（25 d）、100%（40 d）、100%（55 d），定殖数量维持在较高水平，对疫病的防治效果也较高。与“2.3”节相比，第1次接种25 d后，防治辣椒疫病的能力较低，但是40 d后，重复伤根接种组的防效逐渐下降，而重复灌根接种组的防效依然保持在较高水平。 3讨论
植物与内生细菌在长期的共同进化中形成了一种微妙的关系，内生细菌己经成为植物微生态系统的天然组成成分，内生细菌的存在可以促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保证寄生植物的健康生长。内生细菌生物防治的效果与其定殖能力密切相关。一株优秀的生防菌能否发挥生防能力的第一步就是在寄主植物的根围以及其他生境稳定定殖。某些内生菌与病原菌之间存在拮抗作用，但是因为接种的拮抗菌株难以在宿主植物根部定殖和表达而难以取得理想的防治效果[14]。植物内生细菌具有生防作用的机制之一是与病原菌竞争生态位点。内生细菌定殖在植物体内，可以优先占据病原菌入侵位点，并和病原菌竞争营养物质，使得病原菌无法侵入植物体或者是侵入后无法定殖或者缺乏足够的营养供给而死亡。内生细菌在寄主植物中的数量是制约其发挥生防作用的关键因素之一。Sturz等研究马铃薯软腐病的严重程度与能抑制这种病菌的内生菌数量的关系，发现内生菌越少，植物病害严重程度越重，即两者成负相关[15]。本研究在付思雅等的研究[9]基础上进一步证明了内生细菌R15定殖量在1～30 d内呈现先增加后降低的趋势，并且防治辣椒疫病的效果与内生细菌在辣椒根部的定殖数量呈正相关。在30 d后，定殖数量趋于稳定，防治效果也趋于平稳。这些数据说明R15菌株防治辣椒疫病的能力与其定殖量紧密相关。本研究解决的问题是如何保证R15菌株能成功、稳定、持续地并且较高水平地定殖在辣椒根部以及获得良好的生防效果。
内生细菌侵入宿主的方式和途徑是多样的。许多学者认为内生细菌是通过自然孔口（植物叶片上的气孔、水孔、茎上的皮孔、蜜腺、胚根以及次生根发生处等）和伤口（包括根在土壤中伸展造成的持续不断的擦伤口、雨水或冰雹和收割多年生植物等造成的机械损伤等）等进入植物体内[16-17]。农倩等研究表明，菌株B196通过浸种和喷雾的方法接种于水稻植株，从根、叶、叶鞘组织都分离到该菌株，表明菌株B196可通过水稻植株的自然孔口或伤口进入植物体内，并稳定定殖在水稻体内[18]。研究发现植物体中寄生的各种内生细菌大多来自于根际土壤[19-20]，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、产碱菌属（Alcaligenes）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）等菌株。本研究结果显示，对伤根接种R15菌株的辣椒苗进行多次伤根处理，菌株定殖数量有少量的增加，分析认为存在根际周围的R15菌体通过伤口进入植物体内，由于存在数量有限，进入根内的菌体也少；重复伤根接种处理，每次都能从外界增加大量的菌体数量，因此能明显增加根内R15菌株的定殖数量。但是，重复伤根和重复伤根接种对疫病的防治效果却逐渐下降。分析认为多次伤根对植物伤害比较严重，导致植物抵抗病原菌的能力降低和植物过多的伤口为疫病病菌侵染创造了机会，因此导致防效下降。
内生细菌对植物侵染（或者随种子进行垂直传播）、在植物体细胞内或者细胞间定殖以及内生细菌孢子萌发、菌体生长繁殖和代谢等过程均受宿主植物的表型和基因型的影响，并且需要合适的温度、光照、湿度、地理位置、植被等[21-24]环境条件以及合适的碳、氮等营养条件。潘江禹等研究不同肥料对生防菌淡紫拟青霉E7定殖的影响，发现施用一定浓度的肥料能有效提高淡紫拟青霉的根际定殖能力[25]。本试验在推测内生细菌R15菌株的生长繁殖需要N元素的基础上进行重复浇灌尿素溶液处理，调查结果显示，R15的定殖数量比未浇尿素组相比下降慢，并且防治效果比未处理组有所增加。分析认为氮素对R15菌株的定殖数量有影响。
Ledger等研究发现Cupriavidus pinatubonensis JMP134能利用拟南芥和洋槐根系的分泌物定殖在其根部的表皮以及皮层，且在根部的定殖量随接入量的增加而增大[26]。Liu等研究了E1R-j的接种量与小麦患全蚀病的严重程度的关系，发现接种量越大，患病植株越少，患病程度越低[27]。本试验通过重复灌根接种，相当于逐渐加大了辣椒根际R15菌株的数量，由此使辣椒根内的定殖数量有所增加，且高于 105.61 CFU/g，同时对辣椒疫病的防效高于80%。因此，建议在应用R15菌株进行防治辣椒疫病时，应采用每隔15～20 d进行灌根接种处理1次。但是，本试验仅为在实验室条件下得出的结果，在大田中的效果如何，还需要进一步进行验证。
4小结
本试验在内生细菌R15菌株的定殖数量对辣椒疫病的防治效果的影响研究基础上，探索了R15菌株的接种方法和处理方法。发现不同的处理方法对内生细菌定殖动态以及防效影响的一些规律。在接种1次R15菌株后单纯采用伤根和浇灌尿素处理对R15的定殖数量增加影响有限，同样也不会明显增加对疫病的防效；重复伤根接种虽然能维持R15的定殖数量但对疫病的防效不能保持在较高水平；接种后重复浇灌菌液接种能明显提高R15菌株的定殖数量，对疫病的防效也能维持较高的水平。
参考文献：
[1]Akgül D S，Mirik M. Biocontrol of Phytophthora capsici on pepper plants by Bacillus megaterium strains[J]. Journal of Plant Pathology，2008，90（1）：29-34.
[2]Wang Y，Zeng Q G，Zhang Z B，et al. Antagonistic bioactivity of an endophytic bacterium H-6[J]. African Journal of Biotechnology，2010，9（37）：6140-6145.
[3]Yang M M，Xu L P，Xue Q Y，et al. Screening potential bacterial biocontrol agents towards Phytophthora capsici in pepper[J]. European Journal of Plant Pathology，2012，134（4）：811-820.