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关键词黄瓜霜霉病;室内药效;田间药效测试;多黏类芽胞杆菌;生防菌
黄瓜Cucumis sativus L是一种重要的经济作物，全球每年产量高达8300万t。霜霉病、白粉病和角斑病是黄瓜生产上最为严重的3种病害，其中由古巴假霜霉Pseudoperonospora cubensis引起的霜霉病最具毁灭性，可导致30%左右的减产，病情严重时可造成50%～70%的减产，甚至是绝收。目前，防治黄瓜霜霉病主要依靠化学药剂，但由于霜霉的侵染能力极强，在适合的环境条件下，病害可频繁连续发生，迫使化学农药的使用频率增加，进而加快了病原菌对多种化学农药产生抗性的速度。同时，长期使用化学农药会造成食品安全、环境污染及高残留等问题。
为了降低化学农药的使用频率，提高对环境和食品安全的保护力度，许多研究者尝试用植物提取液、微生物和生物诱抗剂等生物制剂防治黄瓜霜霉病。生物防治对环境友好，不易产生抗药性，在黄瓜的安全生产中可起到重要作用。王玉全选用中草药制剂ZY、苯丙噻二唑BTH和侧柏叶提取液CB3种药剂进行盆栽试验评估对黄瓜霜霉病的防效，其中侧柏叶提取液CB的效果最佳（61.6%）。张淑梅等分离得到1株在叶面有较强定殖能力的枯草芽胞杆菌ZH-8，对黄瓜霜霉病的室内防效为75.61%。李星等研究发现枯草芽胞杆菌Z-X-3和Z-X-10對黄瓜霜霉病有预防和治疗效果。郑丽等用青枯菌的Harpin蛋白PopW诱导黄瓜获得系统抗性抵抗霜霉病，温室防效达42.85%，并能增加黄瓜生物量26.92%。本研究通过离体叶片法筛选得到1株对黄瓜霜霉病原菌有较强抑制作用的多黏类芽胞杆菌P.polymyxa P1，通过室内生测和田间药效试验测定P1菌株对黄瓜霜霉病的防治效果。
1材料与方法
1.1供试材料
生防菌：30株生防细菌，由上海万力华生物科技有限公司分离、保存。
供试黄瓜：品种为‘颜如玉’，沈阳市九农高科种苗有限公司生产。
试验药剂：2×10cfu/mL P1悬浮剂（P1-SC），上海万力华生物科技有限公司;250g/L嘧菌酯悬浮剂（SC），先正达南通作物保护有限公司。
1.2生防菌菌液制备
用接种针分别将培养于营养琼脂培养基（NA）平板上的30株生防菌接种至装有100mL营养肉汤（NB）培养基的500mL三角瓶中，置于30℃，180 r/min摇床上培养48h。用Petrroff-Hauser细菌计数板将30株生防菌发酵液分别稀释成1×10cfu/mL的菌体悬浮液备用。
1.3霜霉病菌孢子囊悬浮液制备
采集黄瓜霜霉病叶，清水冲净，置于含有2层湿滤纸片的培养皿中，在24℃保湿培养24h，促进其产生新的孢子囊。用无菌水冲洗霉层收集孢子囊，通过2层纱布过滤杂质，加无菌水稀释后配制成1×10cfu/mL孢子囊悬浮液备用。
1.4离体叶片法筛选
在盆栽黄瓜苗上选择相同叶位、长势一致的叶片，从叶柄1～2cm处剪下，用湿脱脂棉包裹叶柄，将叶片在1.2制备的30株生防菌菌液中各自充分浸润30s，沥去多余菌液，待药液被吸收干后，将各处理叶片叶背向上，按处理标记排放在培养皿内，并置于支架上培养24h，用喉头喷雾器喷头（压力0.1MPa）将霜霉病菌孢子囊悬浮液接种至黄瓜叶片背面，然后在培养皿内加9mL无菌水，设置病原对照和无菌空白培养对照，每个处理3片叶，3次重复。加盖保湿22℃培养5 d后调查发病情况。
1.5生防菌株P1的鉴定
生理生化鉴定：生防菌株P1参考《常见细菌鉴定手册》进行显微镜形态观察、革兰氏染色、芽胞染色以及厌氧生长试验、接触酶试验、氧化酶等生理生化项目测定。
分子鉴定：采用CTAB法提取菌株基因组DNA，扩增其16S rDNA序列。采用通用引物进行序列扩增。正向引物27F（5，-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3’）;反向引物1492R（5’-ACGGC-TACCTTGTTACGACT-3’）。PCR扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST分析，采用MEGA 5.0软件neighbor-joining法构建系统发育树，根据菌株间的亲缘关系确定菌株P1的种属。
1.6室内药效生测
挑选4叶期长势一致的‘颜如玉’黄瓜苗移栽至营养钵（直径10cm），钵内装有3/4的营养土（草炭：蛭石：珍珠岩=7：2：1）。先将试验药剂P1-SC配制成5个浓度：2.0×10、7.8×10、3.12×10、1.25×10、5×10cfu/mL。化学对照药剂：250g/L嘧菌酯SC125mg/L。再用喉头喷雾器喷头（压力0.1MPa）将药液均匀喷施于叶片两面至全部润湿，4次重复，设清水为空白对照。喷药后24h进行病原接种（方法同1.4），然后将黄瓜苗移至温室（20～22℃）保湿箱中，RH 90%以上条件下培养。
待空白对照充分发病，调查各处理每株黄瓜苗病斑数，根据调查数据，计算各处理的防治效果。防治效果=（对照病斑数一处理病斑数）/对照病斑数×100%。
1.7田间药效测试
田间药效试验在上海浦东张江镇卉绿农场（2017年-2018年）进行，品种为‘颜如玉’。试验设5个处理，均为制剂用量。P1-SC 1500、2250mL/hm2和3000 mL/hm2，250g/L嘧菌酯SC600mL/hm2，空白对照。黄瓜霜霉病病发初期开始用药，后续每隔7d施用1次，连施3次。采用春丰8HA电动喷雾器对黄瓜进行茎叶喷雾施药，用水量为750L/hm2。每处理试验面积为20m2，4次重复，各处理随机排列。末次用药7d后，统计病情指数并计算防效，病指调查与防效计算方法参考文献。
1.8数据处理 试验数据使用Excel整理，采用SPSS20.0对数据进行单因素ANOVA分析。
2结果与分析
2.1离体叶片法筛选结果
离体叶片筛选结果（表1）表明，经B-09、B-12、P1和P7菌液處理的黄瓜叶片，病斑数量都少于其他菌液及病原对照处理的叶片，其中经P1处理的叶片未出现病斑。
2.2菌株P1鉴定结果
经对菌株P1进行生理生化测试，鉴定结果（表2）表明，P1是1株能产生芽胞的杆状革兰氏阳性细菌，结合16S rDNA序列分析（图1）菌株P1为多黏类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa。
2.3室内药效测试结果
结果（表3）表明，P1-SC对黄瓜霜霉病的防治效果与用药浓度呈正相关。当使用浓度为1.25×10cfu/mL时，P1-SC对霜霉病的防治效果与化学农药250g/L嘧菌酯SC相似;当使用浓度为5.0×10cfu/mL时，防治效果显著大于（P≤0.05）嘧菌酯。
2.4大田药效测试结果
连续两年大田药效测试结果（表4）表明。经P1-SC处理（2250mL/hm2）的黄瓜植株霜霉病病情指数（4.65，6.00）和防治效果（74.53%，75.66%）分别与经250g/L嘧菌酯SC（600 mL/hm2）处理的植株（4.33、6.22;76.30%、74.95%）相似。而经P1-SC（3000mL/hm2）处理的黄瓜植株霜霉病病情指数（2.53，2.48）和防治效果（86.16%，89.90%）分别显著低于或高于经250g/L嘧菌酯SC（600mL/hm2）处理的植株（P≤0.05）。
3讨论
作为一种生防菌，多黏类芽胞杆菌已在绿色和有机农业生产中得到了广泛的应用。多黏类芽胞杆菌对作物和环境都安全，已被美国环境保护署（EPA）列为可商用的微生物种类之一。该菌对水稻恶苗病菌Fusarium monili forne、人参黑斑病菌Alternaria panax、棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae和番茄青枯病菌Ralstonia solanaceayum等病菌有良好的拮抗效果，但是，应用在黄瓜霜霉病上的研究还鲜有报道。本研究结果显示，P1-SC对黄瓜霜霉病菌有较强的抑菌效果，P1能定殖在黄瓜叶片上，抵御或杀死霜霉病菌。
随着黄瓜种植面积的扩展和农药使用次数的增加，霜霉病菌对化学农药的抗性问题日益严重，已被杀菌剂抗性行动委员会（FRAC）归属为高抗药性风险病原菌。孟润杰等研究发现河北省不同地区的838株黄瓜霜霉病菌对化学农药甲霜灵和嘧菌酯的抗性频率为100%，抗性倍数分别为482.99和354.94倍。路粉等通过叶盘漂浮法检测了2011年一2016年河北、山东2地1821个霜霉病菌对烯酰吗啉和双炔酰菌胺的抗药性，抗性频率分别为88.5%和34.3%。然而多黏类芽胞杆菌主要是通过与病原菌竞争生存空间和营养物质，产生抗生素以及多黏菌素和各种水解酶等抑菌物质，诱导植物获得系统抗性等途径实现对植物病害的防治。P1-SC对植物病害的防治效果独特，具多重作用机制（拮抗作用、形成生物菌膜等），病原菌难以产生抗药性，而且其选择性高，对环境安全，是解决黄瓜霜霉病菌抗性问题的首选。本研究室内及两年田间药效试验表明，当P1-SC的用药剂量为3000 mL/hm2时对黄瓜霜霉病的防效优于250g/L嘧菌酯SC。在黄瓜的安全生产中，P1-SC能减少或代替化学农药的使用，在绿色农业的可持续发展道路上，有良好的应用前景。
黄瓜Cucumis sativus L是一种重要的经济作物，全球每年产量高达8300万t。霜霉病、白粉病和角斑病是黄瓜生产上最为严重的3种病害，其中由古巴假霜霉Pseudoperonospora cubensis引起的霜霉病最具毁灭性，可导致30%左右的减产，病情严重时可造成50%～70%的减产，甚至是绝收。目前，防治黄瓜霜霉病主要依靠化学药剂，但由于霜霉的侵染能力极强，在适合的环境条件下，病害可频繁连续发生，迫使化学农药的使用频率增加，进而加快了病原菌对多种化学农药产生抗性的速度。同时，长期使用化学农药会造成食品安全、环境污染及高残留等问题。
为了降低化学农药的使用频率，提高对环境和食品安全的保护力度，许多研究者尝试用植物提取液、微生物和生物诱抗剂等生物制剂防治黄瓜霜霉病。生物防治对环境友好，不易产生抗药性，在黄瓜的安全生产中可起到重要作用。王玉全选用中草药制剂ZY、苯丙噻二唑BTH和侧柏叶提取液CB3种药剂进行盆栽试验评估对黄瓜霜霉病的防效，其中侧柏叶提取液CB的效果最佳（61.6%）。张淑梅等分离得到1株在叶面有较强定殖能力的枯草芽胞杆菌ZH-8，对黄瓜霜霉病的室内防效为75.61%。李星等研究发现枯草芽胞杆菌Z-X-3和Z-X-10對黄瓜霜霉病有预防和治疗效果。郑丽等用青枯菌的Harpin蛋白PopW诱导黄瓜获得系统抗性抵抗霜霉病，温室防效达42.85%，并能增加黄瓜生物量26.92%。本研究通过离体叶片法筛选得到1株对黄瓜霜霉病原菌有较强抑制作用的多黏类芽胞杆菌P.polymyxa P1，通过室内生测和田间药效试验测定P1菌株对黄瓜霜霉病的防治效果。
1材料与方法
1.1供试材料
生防菌：30株生防细菌，由上海万力华生物科技有限公司分离、保存。
供试黄瓜：品种为‘颜如玉’，沈阳市九农高科种苗有限公司生产。
试验药剂：2×10cfu/mL P1悬浮剂（P1-SC），上海万力华生物科技有限公司;250g/L嘧菌酯悬浮剂（SC），先正达南通作物保护有限公司。
1.2生防菌菌液制备
用接种针分别将培养于营养琼脂培养基（NA）平板上的30株生防菌接种至装有100mL营养肉汤（NB）培养基的500mL三角瓶中，置于30℃，180 r/min摇床上培养48h。用Petrroff-Hauser细菌计数板将30株生防菌发酵液分别稀释成1×10cfu/mL的菌体悬浮液备用。
1.3霜霉病菌孢子囊悬浮液制备
采集黄瓜霜霉病叶，清水冲净，置于含有2层湿滤纸片的培养皿中，在24℃保湿培养24h，促进其产生新的孢子囊。用无菌水冲洗霉层收集孢子囊，通过2层纱布过滤杂质，加无菌水稀释后配制成1×10cfu/mL孢子囊悬浮液备用。
1.4离体叶片法筛选
在盆栽黄瓜苗上选择相同叶位、长势一致的叶片，从叶柄1～2cm处剪下，用湿脱脂棉包裹叶柄，将叶片在1.2制备的30株生防菌菌液中各自充分浸润30s，沥去多余菌液，待药液被吸收干后，将各处理叶片叶背向上，按处理标记排放在培养皿内，并置于支架上培养24h，用喉头喷雾器喷头（压力0.1MPa）将霜霉病菌孢子囊悬浮液接种至黄瓜叶片背面，然后在培养皿内加9mL无菌水，设置病原对照和无菌空白培养对照，每个处理3片叶，3次重复。加盖保湿22℃培养5 d后调查发病情况。
1.5生防菌株P1的鉴定
生理生化鉴定：生防菌株P1参考《常见细菌鉴定手册》进行显微镜形态观察、革兰氏染色、芽胞染色以及厌氧生长试验、接触酶试验、氧化酶等生理生化项目测定。
分子鉴定：采用CTAB法提取菌株基因组DNA，扩增其16S rDNA序列。采用通用引物进行序列扩增。正向引物27F（5，-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3’）;反向引物1492R（5’-ACGGC-TACCTTGTTACGACT-3’）。PCR扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST分析，采用MEGA 5.0软件neighbor-joining法构建系统发育树，根据菌株间的亲缘关系确定菌株P1的种属。
1.6室内药效生测
挑选4叶期长势一致的‘颜如玉’黄瓜苗移栽至营养钵（直径10cm），钵内装有3/4的营养土（草炭：蛭石：珍珠岩=7：2：1）。先将试验药剂P1-SC配制成5个浓度：2.0×10、7.8×10、3.12×10、1.25×10、5×10cfu/mL。化学对照药剂：250g/L嘧菌酯SC125mg/L。再用喉头喷雾器喷头（压力0.1MPa）将药液均匀喷施于叶片两面至全部润湿，4次重复，设清水为空白对照。喷药后24h进行病原接种（方法同1.4），然后将黄瓜苗移至温室（20～22℃）保湿箱中，RH 90%以上条件下培养。
待空白对照充分发病，调查各处理每株黄瓜苗病斑数，根据调查数据，计算各处理的防治效果。防治效果=（对照病斑数一处理病斑数）/对照病斑数×100%。
1.7田间药效测试
田间药效试验在上海浦东张江镇卉绿农场（2017年-2018年）进行，品种为‘颜如玉’。试验设5个处理，均为制剂用量。P1-SC 1500、2250mL/hm2和3000 mL/hm2，250g/L嘧菌酯SC600mL/hm2，空白对照。黄瓜霜霉病病发初期开始用药，后续每隔7d施用1次，连施3次。采用春丰8HA电动喷雾器对黄瓜进行茎叶喷雾施药，用水量为750L/hm2。每处理试验面积为20m2，4次重复，各处理随机排列。末次用药7d后，统计病情指数并计算防效，病指调查与防效计算方法参考文献。
1.8数据处理 试验数据使用Excel整理，采用SPSS20.0对数据进行单因素ANOVA分析。
2结果与分析
2.1离体叶片法筛选结果
离体叶片筛选结果（表1）表明，经B-09、B-12、P1和P7菌液處理的黄瓜叶片，病斑数量都少于其他菌液及病原对照处理的叶片，其中经P1处理的叶片未出现病斑。
2.2菌株P1鉴定结果
经对菌株P1进行生理生化测试，鉴定结果（表2）表明，P1是1株能产生芽胞的杆状革兰氏阳性细菌，结合16S rDNA序列分析（图1）菌株P1为多黏类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa。
2.3室内药效测试结果
结果（表3）表明，P1-SC对黄瓜霜霉病的防治效果与用药浓度呈正相关。当使用浓度为1.25×10cfu/mL时，P1-SC对霜霉病的防治效果与化学农药250g/L嘧菌酯SC相似;当使用浓度为5.0×10cfu/mL时，防治效果显著大于（P≤0.05）嘧菌酯。
2.4大田药效测试结果
连续两年大田药效测试结果（表4）表明。经P1-SC处理（2250mL/hm2）的黄瓜植株霜霉病病情指数（4.65，6.00）和防治效果（74.53%，75.66%）分别与经250g/L嘧菌酯SC（600 mL/hm2）处理的植株（4.33、6.22;76.30%、74.95%）相似。而经P1-SC（3000mL/hm2）处理的黄瓜植株霜霉病病情指数（2.53，2.48）和防治效果（86.16%，89.90%）分别显著低于或高于经250g/L嘧菌酯SC（600mL/hm2）处理的植株（P≤0.05）。
3讨论
作为一种生防菌，多黏类芽胞杆菌已在绿色和有机农业生产中得到了广泛的应用。多黏类芽胞杆菌对作物和环境都安全，已被美国环境保护署（EPA）列为可商用的微生物种类之一。该菌对水稻恶苗病菌Fusarium monili forne、人参黑斑病菌Alternaria panax、棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae和番茄青枯病菌Ralstonia solanaceayum等病菌有良好的拮抗效果，但是，应用在黄瓜霜霉病上的研究还鲜有报道。本研究结果显示，P1-SC对黄瓜霜霉病菌有较强的抑菌效果，P1能定殖在黄瓜叶片上，抵御或杀死霜霉病菌。
随着黄瓜种植面积的扩展和农药使用次数的增加，霜霉病菌对化学农药的抗性问题日益严重，已被杀菌剂抗性行动委员会（FRAC）归属为高抗药性风险病原菌。孟润杰等研究发现河北省不同地区的838株黄瓜霜霉病菌对化学农药甲霜灵和嘧菌酯的抗性频率为100%，抗性倍数分别为482.99和354.94倍。路粉等通过叶盘漂浮法检测了2011年一2016年河北、山东2地1821个霜霉病菌对烯酰吗啉和双炔酰菌胺的抗药性，抗性频率分别为88.5%和34.3%。然而多黏类芽胞杆菌主要是通过与病原菌竞争生存空间和营养物质，产生抗生素以及多黏菌素和各种水解酶等抑菌物质，诱导植物获得系统抗性等途径实现对植物病害的防治。P1-SC对植物病害的防治效果独特，具多重作用机制（拮抗作用、形成生物菌膜等），病原菌难以产生抗药性，而且其选择性高，对环境安全，是解决黄瓜霜霉病菌抗性问题的首选。本研究室内及两年田间药效试验表明，当P1-SC的用药剂量为3000 mL/hm2时对黄瓜霜霉病的防效优于250g/L嘧菌酯SC。在黄瓜的安全生产中，P1-SC能减少或代替化学农药的使用，在绿色农业的可持续发展道路上，有良好的应用前景。