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摘 要：生物传感分析仪广泛应用于食品发酵工业和实验室研究中，为了使其更好地应用于发酵工业和实验室检测，本研究考察了pH、无机盐的种类和浓度对 SBA-40C型生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸准确性的影响，同时还考察了葡萄糖和乳酸测定的重复性及二者对测定是否存在相互干扰。结果表明：pH条件会严重影响测定结果，特别是影响L-乳酸测定的准确性；另外，当样品中的 NaCl和NH4Cl浓度≥0.06mol/L时会使葡萄糖和L-乳酸测定值明显偏低。
关键词：测定；L-乳酸；葡萄糖；生物传感分析仪
中图分类号：TP212.3文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）09-0005-03
葡萄糖和乳酸是食品及微生物发酵工业的两个重要检测指标［1~2］。目前还原糖分析常用的斐林(Fehling) 法、碘量法和葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法等在一定程度上存在着操作繁琐、费时费力、不准确及无法适应生产过程监控等弊端［3］。发酵液中乳酸含量的定量方法有比色法［4］、EDTA 滴定法［5］、HPLC 分析法［6］和酶法等。HPLC 法仪器昂贵，比色法测定耗时多、 误差大，EDTA法虽快速,但测定的是发酵液中的总酸。此外,比色法及EDTA 法均不能用于D-型、L-型乳酸的分别定量。 因此, 基于酶法测定葡萄糖和L-乳酸的生物传感分析仪为发酵工业测定带来了极大的方便，其特点是方便、准确、快速、专一性强、价格低廉、便于自动控制［7］。然而，在食品和发酵液检测中常存在一些干扰因素，严重影响了测定的准确性。本研究考察了pH、L-乳酸浓度/葡萄糖浓度、离子种类和强度等工业发酵中常见因素对 SBA-40C型生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸的影响，以便使生物传感分析仪能更好地应用于发酵工业。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
SBA-40C型生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所研制。其测定葡萄糖和L-乳酸的原理分别是： D-葡萄糖+H2O葡萄糖氧化酶D-葡萄糖酸+H2O2,L-乳酸+O2乳酸氧化酶 -酮戊二酸+H2O2。
FA1004N型电子天平（0.0001g)：上海天谱分析仪器有限公司生产。
含0.100%葡萄糖和 0.050%L-乳酸的标准液，随SBA-40C型生物传感分析仪配给；反应标准缓冲液（生物传感分析仪专用）； 随SBA-40C型生物传感分析仪配给。磷酸缓冲液：参照有关文献配制［8］；其它试剂均是分析纯。
1.2 实验程序和方法
实验操作严格按照生物传感分析仪操作手册执行，新酶膜
的酶活性单位是4500u，工作酶膜酶活性单位最低限是100u。实验中葡萄糖的浓度≤0.100%，乳酸的浓度≤0.050%，二者均在仪器的测量范围内。
1.2.1 重复性实验
用标准液每隔2min测定1次，连续测定20次。
1.2.2 线性关系试验
由0.100%的葡萄糖溶液和0.050%的L-乳酸标准溶液稀释得到各自不同浓度的溶液，用pH7.0的 0.1mol/L磷酸缓冲液稀释。
1.2.3 pH对L-乳酸和葡萄糖测定的影响
通过高浓度磷酸缓冲液改变仪器测定
时的pH值。用不同pH值的1mol/L磷酸缓冲液稀释得到0.050%葡萄糖和0.020%L-
乳酸进行测定。
1.2.4 无机盐对葡萄糖和L-乳酸测定的影响
通过改变溶液中NaCl和NH4Cl的浓度，测定0.100%葡萄糖和0.050%的L-乳酸标准品的变化。
1.2.5 葡萄糖和L-乳酸相互干扰实验
在L-乳酸溶液中添加葡萄糖配成含不同
浓度葡萄糖（0~0.100%）的0.040%的L-乳酸溶液，考察葡萄糖对L-乳酸测定
的影响。在葡萄糖溶液中添加L-乳酸配成含不同浓度（0～0. 050%）L-乳酸的
0.100%葡萄糖的溶液，考察L-乳酸对葡萄糖测定的影响。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖与L-乳酸测定的重复性
葡萄糖与L-乳酸测定的重复性见图1。结果表明，十几分钟后葡萄糖的测定值有上升的趋势，到30min才稳定。这一阶段的最大误差约为5%；乳酸的测定一直都很稳定。连续测定葡萄糖读数走高可能与酶膜的扩散性能较差有关。
图1 重复性实验
2.2 线性关系实验
葡萄糖的测定呈现良好的线性关系，结果见图2。乳酸在浓度≤0.030%时呈线性，在高浓度时曲线出现弯曲，呈饱和趋势，结果见图3。测定时乳酸氧化酶活性单位是176，曲线弯曲反映了酶量不足，提示仪器规定的酶活性单位最低限（≥100）可能需要上调。
图2 葡萄糖测定的线性关系
图3 乳酸测定的线性关系
2.3 pH对L-乳酸和葡萄糖测定的影响
pH对葡萄糖测定的影响结果见图4。当用pH=7.0~8.0的1mol/L磷酸缓冲液稀释时，测定值偏高；而当用pH=5.5～7.0的1mol/L磷酸缓冲液稀释样品时测定值偏低。即样品实际pH 在6.0~7.9 范围波动时，含量为0.050%的葡萄糖测定值在0.045%~0.055%范围内波动。对于乳酸的测定，pH影响则更为显著，随着pH降低，L-乳酸测定值显著下降，当用pH为5.75的1mol/L磷酸缓冲液稀释样品时，0.020%的乳酸测定值仅为0.009%， 当用pH 为7.491mol/L磷酸缓冲液稀释样品时，0.020%的乳酸测定值为0.023%，结果见图5。说明乳酸测定对pH极为敏感。因此，在使用中要注意样品的缓冲能力。样品的缓冲能力愈强，愈要精确调整样品pH, 以保证测定结果的准确。
图4 pH对葡萄糖（0.050%）测定的影响
图5 pH对乳酸(0.020%)测定的影响
2.4 无机盐对葡萄糖和L-乳酸测定的影响
不同浓度NaCl或NH4Cl（0～0.1mol/L）对葡萄糖测定的影响结果分别见图6、图7。结果表明，当NaCl≥0.06mol/L或NH4Cl≥0.05mol/L时，葡萄糖测定值显著降低。在实验浓度范围内 NaCl对乳酸测定无显著影响，见图6；而NH4Cl对乳酸测定影响也较大，当浓度≥0.05mol/L 时，乳酸测定值呈下降趋势，见图7。这可能与酶活性受到影响有关。
图6 NaCl对葡萄糖（0.100%）和乳酸（0.040%）测定的影响
图7 NH4Cl对葡萄糖（0.100%）和乳酸（0.040%）测定的影响
2.5 葡萄糖和L-乳酸相互干扰实验
乳酸和葡萄糖测定相互影响的结果表明，当样品乳酸和葡萄糖的浓度均在仪器的正常测定范围时，葡萄糖对乳酸测定及乳酸对葡萄糖测定均影响不大，误差不超过3%(数据略)。
3 讨论
（1）在葡萄糖和L-乳酸的测定中，如果样品的缓冲能力较强，使测定pH发生较大偏离时，会严重影响测定结果，尤其对乳酸更是这样。
（2）较高浓度的NaCl和NH4Cl 对葡萄糖的测定影响较大，在0.1mol/L时误差高达10%；0.1mol/L NH4Cl对L-乳酸测定影响也可达10%。
（3）葡萄糖测定的线性很好，但连续高浓度测定时，数值会略有偏高。乳酸的线性相对较差，尤其是乳酸氧化酶活性较低时。测定时L-乳酸在0.030%以下线性较好。
（4）实验中我们还发现当用固体葡萄糖新鲜配制的溶液，即使调过pH，测定结果也会与实际值存在很大的差异，最低甚至只有称量值的30%，并且随着时间延长测定值在不断增大。当溶液放置1h后，测定结果才会同称量值吻合。这可能是由于葡萄糖在水溶液中存在的旋光异构互变现象，而酶仅识别其中一种而造成的。因此，在用固体葡萄糖配制溶液时，应注意要放置平衡后再测定。
以上结果提示我们，要充分认识酶传感器的优势与局限性，尽量避免影响酶活性的因素进入到测定系统中，或通过设置相应对照的方法进行校正，才能取得准确的结果。
参考文献：
［1］ 史建国，杨俊慧，孟庆军，等. 发酵生产中还原糖和葡萄糖检测指标的分析［J］.食品与发酵工业,2006,32(10):165-166.
［2］ 陈碧娥.单酶法快速测定发酵液中的L-乳酸［J］.华侨大学学报(自然科学版), 1998, 19(3): 311-313.
［3］ 周娟, 陈滋青, 胡军. 葡萄糖测定方法的比较研究［J］. 工业微生物, 1999, 29(4): 34-36.
［4］ 化学工业部上海医药工业研究所. 抗菌素工业分析［M］. 北京: 化学工业出版社, 1960.
［5］ 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典(第二部)［M］. 北京: 化学工业出版社, 1985.
［6］ Hang Y D. Direct formentation of corn to L (+) -lacitic acid by Rhizopus oryzae［J］.Biotechno- logy Leters，1989, 11(4)： 299-300.
［7］ 孙士清, 王宁, 何伟，等. 酶电极法测定葡萄糖注射液中葡萄糖含量的研究［J］.中国药学, 1994,29(9): 546-547.
［8］ 吴冠芸，潘华珍，吴锡.生物化学与分子生物学实验常用数据手册［M］. 北京: 科学出版社, 1999.
（责任编辑：姜付平）
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关键词：测定；L-乳酸；葡萄糖；生物传感分析仪
中图分类号：TP212.3文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）09-0005-03
葡萄糖和乳酸是食品及微生物发酵工业的两个重要检测指标［1~2］。目前还原糖分析常用的斐林(Fehling) 法、碘量法和葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法等在一定程度上存在着操作繁琐、费时费力、不准确及无法适应生产过程监控等弊端［3］。发酵液中乳酸含量的定量方法有比色法［4］、EDTA 滴定法［5］、HPLC 分析法［6］和酶法等。HPLC 法仪器昂贵，比色法测定耗时多、 误差大，EDTA法虽快速,但测定的是发酵液中的总酸。此外,比色法及EDTA 法均不能用于D-型、L-型乳酸的分别定量。 因此, 基于酶法测定葡萄糖和L-乳酸的生物传感分析仪为发酵工业测定带来了极大的方便，其特点是方便、准确、快速、专一性强、价格低廉、便于自动控制［7］。然而，在食品和发酵液检测中常存在一些干扰因素，严重影响了测定的准确性。本研究考察了pH、L-乳酸浓度/葡萄糖浓度、离子种类和强度等工业发酵中常见因素对 SBA-40C型生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸的影响，以便使生物传感分析仪能更好地应用于发酵工业。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
SBA-40C型生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所研制。其测定葡萄糖和L-乳酸的原理分别是： D-葡萄糖+H2O葡萄糖氧化酶D-葡萄糖酸+H2O2,L-乳酸+O2乳酸氧化酶 -酮戊二酸+H2O2。
FA1004N型电子天平（0.0001g)：上海天谱分析仪器有限公司生产。
含0.100%葡萄糖和 0.050%L-乳酸的标准液，随SBA-40C型生物传感分析仪配给；反应标准缓冲液（生物传感分析仪专用）； 随SBA-40C型生物传感分析仪配给。磷酸缓冲液：参照有关文献配制［8］；其它试剂均是分析纯。
1.2 实验程序和方法
实验操作严格按照生物传感分析仪操作手册执行，新酶膜
的酶活性单位是4500u，工作酶膜酶活性单位最低限是100u。实验中葡萄糖的浓度≤0.100%，乳酸的浓度≤0.050%，二者均在仪器的测量范围内。
1.2.1 重复性实验
用标准液每隔2min测定1次，连续测定20次。
1.2.2 线性关系试验
由0.100%的葡萄糖溶液和0.050%的L-乳酸标准溶液稀释得到各自不同浓度的溶液，用pH7.0的 0.1mol/L磷酸缓冲液稀释。
1.2.3 pH对L-乳酸和葡萄糖测定的影响
通过高浓度磷酸缓冲液改变仪器测定
时的pH值。用不同pH值的1mol/L磷酸缓冲液稀释得到0.050%葡萄糖和0.020%L-
乳酸进行测定。
1.2.4 无机盐对葡萄糖和L-乳酸测定的影响
通过改变溶液中NaCl和NH4Cl的浓度，测定0.100%葡萄糖和0.050%的L-乳酸标准品的变化。
1.2.5 葡萄糖和L-乳酸相互干扰实验
在L-乳酸溶液中添加葡萄糖配成含不同
浓度葡萄糖（0~0.100%）的0.040%的L-乳酸溶液，考察葡萄糖对L-乳酸测定
的影响。在葡萄糖溶液中添加L-乳酸配成含不同浓度（0～0. 050%）L-乳酸的
0.100%葡萄糖的溶液，考察L-乳酸对葡萄糖测定的影响。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖与L-乳酸测定的重复性
葡萄糖与L-乳酸测定的重复性见图1。结果表明，十几分钟后葡萄糖的测定值有上升的趋势，到30min才稳定。这一阶段的最大误差约为5%；乳酸的测定一直都很稳定。连续测定葡萄糖读数走高可能与酶膜的扩散性能较差有关。
图1 重复性实验
2.2 线性关系实验
葡萄糖的测定呈现良好的线性关系，结果见图2。乳酸在浓度≤0.030%时呈线性，在高浓度时曲线出现弯曲，呈饱和趋势，结果见图3。测定时乳酸氧化酶活性单位是176，曲线弯曲反映了酶量不足，提示仪器规定的酶活性单位最低限（≥100）可能需要上调。
图2 葡萄糖测定的线性关系
图3 乳酸测定的线性关系
2.3 pH对L-乳酸和葡萄糖测定的影响
pH对葡萄糖测定的影响结果见图4。当用pH=7.0~8.0的1mol/L磷酸缓冲液稀释时，测定值偏高；而当用pH=5.5～7.0的1mol/L磷酸缓冲液稀释样品时测定值偏低。即样品实际pH 在6.0~7.9 范围波动时，含量为0.050%的葡萄糖测定值在0.045%~0.055%范围内波动。对于乳酸的测定，pH影响则更为显著，随着pH降低，L-乳酸测定值显著下降，当用pH为5.75的1mol/L磷酸缓冲液稀释样品时，0.020%的乳酸测定值仅为0.009%， 当用pH 为7.491mol/L磷酸缓冲液稀释样品时，0.020%的乳酸测定值为0.023%，结果见图5。说明乳酸测定对pH极为敏感。因此，在使用中要注意样品的缓冲能力。样品的缓冲能力愈强，愈要精确调整样品pH, 以保证测定结果的准确。
图4 pH对葡萄糖（0.050%）测定的影响
图5 pH对乳酸(0.020%)测定的影响
2.4 无机盐对葡萄糖和L-乳酸测定的影响
不同浓度NaCl或NH4Cl（0～0.1mol/L）对葡萄糖测定的影响结果分别见图6、图7。结果表明，当NaCl≥0.06mol/L或NH4Cl≥0.05mol/L时，葡萄糖测定值显著降低。在实验浓度范围内 NaCl对乳酸测定无显著影响，见图6；而NH4Cl对乳酸测定影响也较大，当浓度≥0.05mol/L 时，乳酸测定值呈下降趋势，见图7。这可能与酶活性受到影响有关。
图6 NaCl对葡萄糖（0.100%）和乳酸（0.040%）测定的影响
图7 NH4Cl对葡萄糖（0.100%）和乳酸（0.040%）测定的影响
2.5 葡萄糖和L-乳酸相互干扰实验
乳酸和葡萄糖测定相互影响的结果表明，当样品乳酸和葡萄糖的浓度均在仪器的正常测定范围时，葡萄糖对乳酸测定及乳酸对葡萄糖测定均影响不大，误差不超过3%(数据略)。
3 讨论
（1）在葡萄糖和L-乳酸的测定中，如果样品的缓冲能力较强，使测定pH发生较大偏离时，会严重影响测定结果，尤其对乳酸更是这样。
（2）较高浓度的NaCl和NH4Cl 对葡萄糖的测定影响较大，在0.1mol/L时误差高达10%；0.1mol/L NH4Cl对L-乳酸测定影响也可达10%。
（3）葡萄糖测定的线性很好，但连续高浓度测定时，数值会略有偏高。乳酸的线性相对较差，尤其是乳酸氧化酶活性较低时。测定时L-乳酸在0.030%以下线性较好。
（4）实验中我们还发现当用固体葡萄糖新鲜配制的溶液，即使调过pH，测定结果也会与实际值存在很大的差异，最低甚至只有称量值的30%，并且随着时间延长测定值在不断增大。当溶液放置1h后，测定结果才会同称量值吻合。这可能是由于葡萄糖在水溶液中存在的旋光异构互变现象，而酶仅识别其中一种而造成的。因此，在用固体葡萄糖配制溶液时，应注意要放置平衡后再测定。
以上结果提示我们，要充分认识酶传感器的优势与局限性，尽量避免影响酶活性的因素进入到测定系统中，或通过设置相应对照的方法进行校正，才能取得准确的结果。
参考文献：
［1］ 史建国，杨俊慧，孟庆军，等. 发酵生产中还原糖和葡萄糖检测指标的分析［J］.食品与发酵工业,2006,32(10):165-166.
［2］ 陈碧娥.单酶法快速测定发酵液中的L-乳酸［J］.华侨大学学报(自然科学版), 1998, 19(3): 311-313.
［3］ 周娟, 陈滋青, 胡军. 葡萄糖测定方法的比较研究［J］. 工业微生物, 1999, 29(4): 34-36.
［4］ 化学工业部上海医药工业研究所. 抗菌素工业分析［M］. 北京: 化学工业出版社, 1960.
［5］ 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典(第二部)［M］. 北京: 化学工业出版社, 1985.
［6］ Hang Y D. Direct formentation of corn to L (+) -lacitic acid by Rhizopus oryzae［J］.Biotechno- logy Leters，1989, 11(4)： 299-300.
［7］ 孙士清, 王宁, 何伟，等. 酶电极法测定葡萄糖注射液中葡萄糖含量的研究［J］.中国药学, 1994,29(9): 546-547.
［8］ 吴冠芸，潘华珍，吴锡.生物化学与分子生物学实验常用数据手册［M］. 北京: 科学出版社, 1999.
（责任编辑：姜付平）
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