【摘 要】
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外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,OmpT)是定位于大肠杆菌外膜,具有高度底物特异性的蛋白水解酶。本文旨在建立克隆表达膜蛋白OmpT和体外复性的方法,考察其蛋白酶活性
【机 构】
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南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系; 南加州大学洛杉矶儿童医院;
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(No.30972637)
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外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,OmpT)是定位于大肠杆菌外膜,具有高度底物特异性的蛋白水解酶。本文旨在建立克隆表达膜蛋白OmpT和体外复性的方法,考察其蛋白酶活性。首先以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增ompT基因,连接至pET28a(pET-ompT),引入点突变Asp85Ala,构建表达质粒pET-ompT85。然后将两种重组质粒转化入BL21(DE3),均以包涵体形式大量表达。纯化后的蛋白经稀释法复性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢复蛋白酶活性。通过SDS-PAGE、鱼精蛋白水解试验及生长曲线观察表明,重组蛋白OmpT在体外能水解抗菌肽鱼精蛋白和兔肌肉肌酸激酶,而OmpT突变体则无上述功能。上述结果表明本文获得了具有蛋白水解酶功能的重组蛋白OmpT,该蛋白在体外可保护大肠杆菌抵抗鱼精蛋白的杀菌作用。
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