论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨改良椎动脉阻断法建立四血管阻塞全脑缺血模型的可行性。方法：健康成年雄性Wistar大鼠68只，随机分为假手术组（S组）8只、传统模型组（T组）及改良模型组（I组）各30只。传统组采用三步制模法：第1步暴露第1颈椎双翼孔，在显微镜下磨钻暴露椎动脉后用双极电凝器烧闭双侧椎动脉；第2步游离双侧颈总动脉，放入线扣；第3步24 h后夹闭双侧颈总动脉，建立全脑缺血再灌注模型；改良组在第1步用自制改良电烙铁直接插入翼孔将椎动脉烧闭，其余步骤同传统组；假手术组不凝闭椎动脉和不夹闭颈总动脉。观察改良组和传统组模型制作耗费时间、成功率、操作复杂度、设备费用。比较改良组、传统组与假手术组在行为学和病理学上的差异。结果：与传统组比较，改良组模型制作时间明显减少（P<0.05），成功率明显提高，设备费用大幅减少。HE染色及Morris水迷宫显示模型组与假手术组在病理学和行为学比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：改良组与传统组均成功制模，改良后的制作方法成功率高，制模时间短，无需特殊设备，方法简便可靠。
【关键词】 全脑缺血模型； 四血管阻塞法； 椎动脉
缺血性脑损伤严重危害人类健康。在缺血性脑血管病基础研究中，建立稳定、可靠及操作简便的动物模型是开展各项研究的基础。目前公认的Pulsinelli[1]大鼠全脑缺血四血管模型是研究多种缺血性脑疾病经典模型之一。由于该方法具有可较好地模拟临床上因低血压休克、心肺脑复苏等造成的全脑缺血性损伤过程及易于大宗实验等优点，因此近年来经典的Pulsinelli四动脉结扎法被许多学者所使用[2-3]。但此模型也存在制备复杂，成功率低，仪器设备昂贵等缺点。参考此法，在保证模型质量的前提下，通过反复实践和摸索，积累了一些经验。本文旨在设计一种新型简捷的制作方法，可显著提高模型制作的成功率及缩短制作时间。
1 材料与方法
1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠68只（省动物中心提供，许可证号：slxk20080002），体质量250～300 g，随机分为假手术组8只，传统模型组及改良模型组各30只。
1.2 模型制作方法
1.2.1 改良组 大鼠用质量分数10%水合氯醛进行腹腔麻醉（3 ml/kg）[4]，俯卧位固定于操作台上，消毒后剪开颈后正中皮肤约2 cm，沿正中切口钝性逐层分离组织直到暴露第1颈椎；后再沿第1颈椎斜向内上寻找翼孔；翼孔完全显露后，插入自制烧灼器烧灼翼孔5～6次，2～3 s/次，造成双侧椎动脉永久闭塞[5]，后消毒缝合组织。再将大鼠仰卧位固定，消毒后切开颈前区皮肤2 cm，沿气管两侧逐步分离暴露双侧颈动脉鞘，游离双侧颈总动脉，后置线系活结，消毒缝合组织，自由饮食。24 h后将大鼠仰卧位固定于操作台上，于清醒状态下拆开颈部缝合线，提取线结，同时夹闭双侧颈总动脉；夹闭10 min后松开动脉夹造成复灌，缝合组织自由饮食。
1.2.2 传统组 大鼠充分显露翼孔后，磨钻仔细地沿翼孔表面逐层打磨骨面，直至完全显露穿行其中的椎动脉，后接双极电凝器，在显微镜直视下用双极电凝充分烧灼双侧椎动脉，造成椎动脉永久闭塞，其余步骤同改良组。
1.2.3 假手术组 大鼠充分暴露翼孔后不烧灼，大鼠游离颈总动脉后不系线，其余步骤同改良组。
1.3 实验条件 整个实验过程中用白炽灯照射使大鼠肛温保持在（37.0±0.5）℃及每批大鼠缺血及复灌都在同一时间。
1.4 观察指标与方法
1.4.1 生理指征 双侧颈总动脉夹闭后1 min内出现动物意识丧失，眼球变白，双侧瞳孔对光反射消失，翻正反射消失，自主呼吸加快。实验过程中凡不符合上述标准或大鼠出现抽搐及死亡视为失败。
1.4.2 行为学检测 模型建立7 d后用Morris水迷宫进行大鼠空间定向能力检测。Morris水迷宫是由圆形水池，自动摄像机及电脑分析系统组成。测试前将水注入池内，水深30 cm（即水面高出站臺1 cm，使大鼠看不见站台），水温控制在（25±1）℃。T组、I组各随机选出造模成功的8只大鼠与S组大鼠用于测试。整个测试过程分为两部分：第1阶段为学习阶段，第1天训练先将大鼠放在人工平台上适应1 min，然后让大鼠自由游泳寻找平台，120 s内未找到平台者，实验者将其引至平台。从第2天起，将大鼠从一个象限的固定位置面向池壁放入水中，让其进行定向航行寻找平台。若在120 s内未找到平台，实验者将大鼠引致平台停留10 s，记录寻台时间，超过120 s按120 s计算。每天上下午固定时间各训练1次，将两次寻台时间的平均值作为当日空间学习测试的成绩，共持续4 d。第2阶段为测试阶段，即在第5天同一时间撤去平台，固定位置面向池壁放入大鼠，记录大鼠第1次跨越平台的时间即潜伏期，超过120 s按120 s计算。
1.4.3 HE染色 各组大鼠于再灌后相应时间取大鼠麻醉后，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液透心灌注，断头后取脑于视交叉后冠状面1～4 mm之间脑组织，后固定2 h，洗涤4 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。在海马平面冠状切片，切片厚5 μm，室温保存。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件分析，计量资料用（x±s）表示，均数间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠制模成功率、制模时间及仪器费用 在充分预实验的基础上，实验组大鼠I组大鼠造模成功25只，成功率83%（25/30）；T组大鼠造模成功20只，成功率67%（20/30）；从翼孔完全暴露开始计时，到烧灼椎动脉结束为止，I组平均烧灼时间约为31 s，T组平均烧灼时间约为612 s，两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。T组仪器显微镜75万，磨钻15万，电凝器10万；I组电烙铁系市场普通电烙铁，约15元。 2.2 行为学及病理组织学指标判定
2.2.1 Morris水迷宫测试 与S组相比，模型组大鼠学习阶段寻台时间明显延长，而其记忆测试潜伏期也明显长于S组，I组与T组比较差异无统计学意义。见表1。
2.2.2 HE染色 海马组织病理学改变，S组神经元结构正常，细胞核圆而规则，核膜清楚，有明显的核仁，核膜境界清楚。模型组大量锥体细胞核不规则并固缩深染，胞浆嗜伊红，细胞间隙明显增大，胞浆呈空泡样变，正常神经元数量显著减少（图1）。
3 讨论
全脑缺血损伤在临床实践中常见，因此全脑缺血再灌注模型的建立是缺血性脑损伤实验研究的一个重要方法。它比体外或局灶模型能够更好地模拟临床中出现的低血压及心脏骤停等缺血模式，也更符合麻醉手术中的临床实际。Pulisinelli等[1]在1979年首先报告了大鼠前脑缺血模型的制备，可在动物清醒状态下且不改变全身血流动力学造成大脑缺血而被广泛重视。1984年Told采用钻透环椎翼小孔的方法，充分暴露椎动脉后直视下烧杓椎动脉，其成功率几乎达100%[6]。
在实际模型建立过程中发现，虽然参考了Pulsinelli的经典方法，但利用该方法制作模型仍存在一些缺点，主要表现在：（1）为闭塞双侧椎动脉，需要对大鼠第1颈椎内后方的翼孔进行研磨以暴露其中穿行的椎动脉进行烧灼；由于翼孔存在变异（有些大鼠开口较小或存在两个开口），直接烧灼往往不能完全闭塞椎动脉；且翼孔壁薄研磨，钻透翼小孔极易伤及椎动脉造成大出血而导致模型制作失败。（2）椎动脉阻断方法中，电凝法需要手术显微镜和单极电凝，电流不易控制，过低不能烧灼椎动脉，过高则会可损伤脑干，对动物损伤大，还可能电伤操作者[7]；热凝固法中需要不断用酒精灯对针进行加热，如果烧灼动作太慢，热能散失，反而烧针会粘破椎动脉，引起动物大量失血死亡。（3）经典的Pulsinelli 4 d后分离双侧颈总动脉，实验周期长，易造成大鼠缺血缺水死亡。针对上述缺点，我们对传统的4-VO制作大鼠全脑缺血模型的方法进行了改进。首先，采用自制烧灼器直接插入翼孔反复烧灼，无需研磨骨面，仪器制作简单且损伤小。其次，自制烧灼器可持续加热，热量恒定，避免了热能散失而粘破椎动脉。再次，在动物存活24 h后夹闭双侧颈总动脉，从而避免了主观因素的影响，缩短模型制作的周期。
实验证明，大脑区海马组织对缺血性损伤十分敏感，尤其是CA1区神经元，因此，在全脑缺血模型中，CA1区神经元成为相对独立于其他脑区的理想的实验观察对象。本实验结果显示，全脑缺血再灌注后大鼠空间学习记忆能力明显减退。两侧海马组织CA1区出现不同程度的神经元核固缩和神经细胞丢失。这些行为学和组织病理学的变化证明我们采用的全脑缺血/再灌注损伤大鼠模型的复制是成功的。传统组及改良组大鼠均成功复制全脑缺血再灌注模型。相比之下，改良组手术方法成功率高，缩短制模时间，方法简便可靠，无需特殊仪器，值得推广。
参考文献
[1] Pulsineli W A，Brierley J B.A new model of biateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke，1979，10（3）：267-272.
[2] 張华，任朝胜.大鼠四血管脑缺血模型建立方法的改进[J].郑州大学学报：医学版，2005，40（1）：115-116.
[3] 潘登，谭军，孙兆印.葛根素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织钙含量的影响[J].新乡医学院学报，2008，25（3）：210-221.
[4] 陈玲，陈海滨，吴莹，等.建立大鼠全脑缺血模型的方法与体会[J].汕头大学医学院学报，2000，13（1）：59-60.
[5] 范圣登，王琛，谢红.Pulsineli四血管大鼠全脑缺血模型制作的改进[J].苏州大学学报：医学版，2003，23（4）：416-417.
[6] Ohtsu H.Central role of Gq in the hypertrophic signal transduction of angiotensin Ⅱ in vasuclar smooth muscle cells[J].Endocrinology， 2008， 149（7）：3539.
[7] Pulsineli W A，Buchan A M.The four-vessel occlusion of vertebralarteries and control of collateral circulation[J].Stroke，1988，19（7）：913-914.
（收稿日期：2012-09-24） （本文编辑：李静）
【关键词】 全脑缺血模型； 四血管阻塞法； 椎动脉
缺血性脑损伤严重危害人类健康。在缺血性脑血管病基础研究中，建立稳定、可靠及操作简便的动物模型是开展各项研究的基础。目前公认的Pulsinelli[1]大鼠全脑缺血四血管模型是研究多种缺血性脑疾病经典模型之一。由于该方法具有可较好地模拟临床上因低血压休克、心肺脑复苏等造成的全脑缺血性损伤过程及易于大宗实验等优点，因此近年来经典的Pulsinelli四动脉结扎法被许多学者所使用[2-3]。但此模型也存在制备复杂，成功率低，仪器设备昂贵等缺点。参考此法，在保证模型质量的前提下，通过反复实践和摸索，积累了一些经验。本文旨在设计一种新型简捷的制作方法，可显著提高模型制作的成功率及缩短制作时间。
1 材料与方法
1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠68只（省动物中心提供，许可证号：slxk20080002），体质量250～300 g，随机分为假手术组8只，传统模型组及改良模型组各30只。
1.2 模型制作方法
1.2.1 改良组 大鼠用质量分数10%水合氯醛进行腹腔麻醉（3 ml/kg）[4]，俯卧位固定于操作台上，消毒后剪开颈后正中皮肤约2 cm，沿正中切口钝性逐层分离组织直到暴露第1颈椎；后再沿第1颈椎斜向内上寻找翼孔；翼孔完全显露后，插入自制烧灼器烧灼翼孔5～6次，2～3 s/次，造成双侧椎动脉永久闭塞[5]，后消毒缝合组织。再将大鼠仰卧位固定，消毒后切开颈前区皮肤2 cm，沿气管两侧逐步分离暴露双侧颈动脉鞘，游离双侧颈总动脉，后置线系活结，消毒缝合组织，自由饮食。24 h后将大鼠仰卧位固定于操作台上，于清醒状态下拆开颈部缝合线，提取线结，同时夹闭双侧颈总动脉；夹闭10 min后松开动脉夹造成复灌，缝合组织自由饮食。
1.2.2 传统组 大鼠充分显露翼孔后，磨钻仔细地沿翼孔表面逐层打磨骨面，直至完全显露穿行其中的椎动脉，后接双极电凝器，在显微镜直视下用双极电凝充分烧灼双侧椎动脉，造成椎动脉永久闭塞，其余步骤同改良组。
1.2.3 假手术组 大鼠充分暴露翼孔后不烧灼，大鼠游离颈总动脉后不系线，其余步骤同改良组。
1.3 实验条件 整个实验过程中用白炽灯照射使大鼠肛温保持在（37.0±0.5）℃及每批大鼠缺血及复灌都在同一时间。
1.4 观察指标与方法
1.4.1 生理指征 双侧颈总动脉夹闭后1 min内出现动物意识丧失，眼球变白，双侧瞳孔对光反射消失，翻正反射消失，自主呼吸加快。实验过程中凡不符合上述标准或大鼠出现抽搐及死亡视为失败。
1.4.2 行为学检测 模型建立7 d后用Morris水迷宫进行大鼠空间定向能力检测。Morris水迷宫是由圆形水池，自动摄像机及电脑分析系统组成。测试前将水注入池内，水深30 cm（即水面高出站臺1 cm，使大鼠看不见站台），水温控制在（25±1）℃。T组、I组各随机选出造模成功的8只大鼠与S组大鼠用于测试。整个测试过程分为两部分：第1阶段为学习阶段，第1天训练先将大鼠放在人工平台上适应1 min，然后让大鼠自由游泳寻找平台，120 s内未找到平台者，实验者将其引至平台。从第2天起，将大鼠从一个象限的固定位置面向池壁放入水中，让其进行定向航行寻找平台。若在120 s内未找到平台，实验者将大鼠引致平台停留10 s，记录寻台时间，超过120 s按120 s计算。每天上下午固定时间各训练1次，将两次寻台时间的平均值作为当日空间学习测试的成绩，共持续4 d。第2阶段为测试阶段，即在第5天同一时间撤去平台，固定位置面向池壁放入大鼠，记录大鼠第1次跨越平台的时间即潜伏期，超过120 s按120 s计算。
1.4.3 HE染色 各组大鼠于再灌后相应时间取大鼠麻醉后，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液透心灌注，断头后取脑于视交叉后冠状面1～4 mm之间脑组织，后固定2 h，洗涤4 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。在海马平面冠状切片，切片厚5 μm，室温保存。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件分析，计量资料用（x±s）表示，均数间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠制模成功率、制模时间及仪器费用 在充分预实验的基础上，实验组大鼠I组大鼠造模成功25只，成功率83%（25/30）；T组大鼠造模成功20只，成功率67%（20/30）；从翼孔完全暴露开始计时，到烧灼椎动脉结束为止，I组平均烧灼时间约为31 s，T组平均烧灼时间约为612 s，两组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。T组仪器显微镜75万，磨钻15万，电凝器10万；I组电烙铁系市场普通电烙铁，约15元。 2.2 行为学及病理组织学指标判定
2.2.1 Morris水迷宫测试 与S组相比，模型组大鼠学习阶段寻台时间明显延长，而其记忆测试潜伏期也明显长于S组，I组与T组比较差异无统计学意义。见表1。
2.2.2 HE染色 海马组织病理学改变，S组神经元结构正常，细胞核圆而规则，核膜清楚，有明显的核仁，核膜境界清楚。模型组大量锥体细胞核不规则并固缩深染，胞浆嗜伊红，细胞间隙明显增大，胞浆呈空泡样变，正常神经元数量显著减少（图1）。
3 讨论
全脑缺血损伤在临床实践中常见，因此全脑缺血再灌注模型的建立是缺血性脑损伤实验研究的一个重要方法。它比体外或局灶模型能够更好地模拟临床中出现的低血压及心脏骤停等缺血模式，也更符合麻醉手术中的临床实际。Pulisinelli等[1]在1979年首先报告了大鼠前脑缺血模型的制备，可在动物清醒状态下且不改变全身血流动力学造成大脑缺血而被广泛重视。1984年Told采用钻透环椎翼小孔的方法，充分暴露椎动脉后直视下烧杓椎动脉，其成功率几乎达100%[6]。
在实际模型建立过程中发现，虽然参考了Pulsinelli的经典方法，但利用该方法制作模型仍存在一些缺点，主要表现在：（1）为闭塞双侧椎动脉，需要对大鼠第1颈椎内后方的翼孔进行研磨以暴露其中穿行的椎动脉进行烧灼；由于翼孔存在变异（有些大鼠开口较小或存在两个开口），直接烧灼往往不能完全闭塞椎动脉；且翼孔壁薄研磨，钻透翼小孔极易伤及椎动脉造成大出血而导致模型制作失败。（2）椎动脉阻断方法中，电凝法需要手术显微镜和单极电凝，电流不易控制，过低不能烧灼椎动脉，过高则会可损伤脑干，对动物损伤大，还可能电伤操作者[7]；热凝固法中需要不断用酒精灯对针进行加热，如果烧灼动作太慢，热能散失，反而烧针会粘破椎动脉，引起动物大量失血死亡。（3）经典的Pulsinelli 4 d后分离双侧颈总动脉，实验周期长，易造成大鼠缺血缺水死亡。针对上述缺点，我们对传统的4-VO制作大鼠全脑缺血模型的方法进行了改进。首先，采用自制烧灼器直接插入翼孔反复烧灼，无需研磨骨面，仪器制作简单且损伤小。其次，自制烧灼器可持续加热，热量恒定，避免了热能散失而粘破椎动脉。再次，在动物存活24 h后夹闭双侧颈总动脉，从而避免了主观因素的影响，缩短模型制作的周期。
实验证明，大脑区海马组织对缺血性损伤十分敏感，尤其是CA1区神经元，因此，在全脑缺血模型中，CA1区神经元成为相对独立于其他脑区的理想的实验观察对象。本实验结果显示，全脑缺血再灌注后大鼠空间学习记忆能力明显减退。两侧海马组织CA1区出现不同程度的神经元核固缩和神经细胞丢失。这些行为学和组织病理学的变化证明我们采用的全脑缺血/再灌注损伤大鼠模型的复制是成功的。传统组及改良组大鼠均成功复制全脑缺血再灌注模型。相比之下，改良组手术方法成功率高，缩短制模时间，方法简便可靠，无需特殊仪器，值得推广。
参考文献
[1] Pulsineli W A，Brierley J B.A new model of biateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke，1979，10（3）：267-272.
[2] 張华，任朝胜.大鼠四血管脑缺血模型建立方法的改进[J].郑州大学学报：医学版，2005，40（1）：115-116.
[3] 潘登，谭军，孙兆印.葛根素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织钙含量的影响[J].新乡医学院学报，2008，25（3）：210-221.
[4] 陈玲，陈海滨，吴莹，等.建立大鼠全脑缺血模型的方法与体会[J].汕头大学医学院学报，2000，13（1）：59-60.
[5] 范圣登，王琛，谢红.Pulsineli四血管大鼠全脑缺血模型制作的改进[J].苏州大学学报：医学版，2003，23（4）：416-417.
[6] Ohtsu H.Central role of Gq in the hypertrophic signal transduction of angiotensin Ⅱ in vasuclar smooth muscle cells[J].Endocrinology， 2008， 149（7）：3539.
[7] Pulsineli W A，Buchan A M.The four-vessel occlusion of vertebralarteries and control of collateral circulation[J].Stroke，1988，19（7）：913-914.
（收稿日期：2012-09-24） （本文编辑：李静）