【摘 要】
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目的: 构建肌酸激酶MM同工酶原核表达系统,纯化重组酶蛋白并对其稳定性进行研究,为其作为参考品或校准品应用于临床奠定基础.
方法: 提取胎儿心肌组织总RNA,反转录扩增人
【机 构】
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北京大学第一医院检验科100034
【出 处】
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中国生物化学与分子生物学会临床应用生物化学与分子生物学分会成立大会暨第一届临床应用生物化学与分子生物学学术大会
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目的: 构建肌酸激酶MM同工酶原核表达系统,纯化重组酶蛋白并对其稳定性进行研究,为其作为参考品或校准品应用于临床奠定基础.
方法: 提取胎儿心肌组织总RNA,反转录扩增人肌酸激酶M亚基基因,构建pET-15b-CK、E.coli.BL21(DE3)pLysS原核表达系统,以用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达.利用重组蛋白中的组氨酸标签(His-tag)进行金属蝥合亲和层析纯化,观察重组酶在不同保存条件下的稳定性.
结果: 重组质粒经酶切及测序鉴定与预期相符,诱导表达后细菌裂解液上清酶活性可达28X10(4)U/L.纯化后SDS-PAGE在45kD处显示单-蛋白条带,在-20℃加入7％BSA、1mMDTT、2mMEDTA的PBS(pH7.2)的保存体系中,重组酶活性在30天观察期内基本不变.
结论: 成功表达并纯化了人肌酸激酶删同工酶,重组酶稳定性良好,初步具备了作为基因工程人源酶校准品的基本特点.
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