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摘要 [目的]探讨云南小粒速溶咖啡中百菌清的最佳提取净化方法。[方法]分别采用石油醚-丙酮萃取法、固相吸附法及二氯甲烷-丙酮萃取法这3种不同的方法提取净化云南小粒速溶咖啡中的百菌清，并利用高效液相色谱进行加标回收测定，根据回收率的大小和净化方式的繁简，确定最适宜的百菌清测定方法。[结果]3种不同方法提取净化百菌清的加标回收率分别为85.3%、111.4%和118.7%。[结论]通过回收率及净化方式的比较可知，可利用固相吸附法对云南小粒速溶咖啡中的百菌清进行提取纯化。
关键词 速溶咖啡；百菌清；提取净化；方法优化
中图分类号 S571.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）32-0092-02
Stndy on Extraction and Purification Method of Chlorothalonil in Yunnan Small Grain Instant Coffee
LIU Dan-dan1， SUN Xiao-shuai1， WANG Zhi-hong2， HE Fei-fei1* et al （1. School of Agriculture， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091； 2. Yunnan Three Standard of Agriculture and Forestry Science and Technology Co. Ltd.， Kunming， Yunnan 650302）
Abstract [Objective] The aim was to explore the optimal extraction and purijication method for chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee. [Method] Three different extraction and purification methods （aether petrolei-acetone extraction， solid-phase adsorption and dichloromethane-acetone extraction） were performed to extract chlorothalonil in instant coffee. Then all of the extractions were tested using high performance liquid chromatography（HPLC）. The most suitable method was determined according to the percentages of recovery measurement. [Result] The results obtained by three different extraction and purification methods showed that the recovery percentages were 85.3%， 111.4% and 118.7%， respectively. [Conclusions] By comparing recovery rate and purification methods， solid-phase adsorption method was the best one for testing chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee.
Key words Instant coffee； Chlorothalonil； Extraction and purification； Method optimization
云南咖啡属阿拉伯原种的变异种，经过长期的栽培驯化，现被称为“云南小粒种咖啡”。由于云南光照时间长，昼夜温差大，有利于咖啡养分的积累，因此，云南小粒咖啡的营养成分高于国内外其他咖啡品种，形成了自己的特色。随着云南咖啡产业的快速发展，速溶咖啡占据了很大市场。在咖啡的生产栽培过程中会使用大量的杀菌剂及杀虫剂，在咖啡豆的加工中也会出现污染。速溶咖啡属于直接饮用的食品，农药残留等成了安全问题中的最大隐患。
农药残留主要是由直接施药引起的，也可以是吸收环境中的农药或通过食物链富集造成。农药的理化性质、作物类型、施药方法、环境因子都是影响残留的因素。在同一区域内施用多种农药，存在农药的同系物、异构体、降解产物或代謝产物的影响[1]，农作物通过根茎吸收、传导等途径，使農药进入其组织内部，从而加大了检测的难度。因此，发展各种新的分析方法，特别是多种类农药残留量的同时分析方法具有重要的意义。目前，对于咖啡的农药残留检测均局限于对咖啡豆的检测[2]，鲜有关于对速溶咖啡检测的报道。农业部NY/T 289—1995在标准中只是规定了六六六、滴滴涕2种农药的残留量及测定方法[3]。
百菌清是非内吸性广谱杀菌剂，该农药残留的测定方法在黄瓜、茶叶及咖啡豆中均有报道[3-4]，检测方法多为气相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等[5-6]。其中，质谱联用方法灵敏度高，但是价格昂贵，运行成本较高。因此，建立快速、高效、易推广的检测方法具有一定的现实意义。笔者通过加标回收使用3种不同的方法对速溶咖啡中的百菌清进行提纯净化，通过比较探讨该农药最适宜的测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
原料：云南产小粒速溶咖啡。
主要仪器：高效液相色谱仪（Waters，e2695-2489），超声波振荡仪器，旋转蒸发仪。 主要试剂：百菌清标准品（99.5%），购自国家标准物质中心；甲醇、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、柠檬酸氢二钠、乙腈、氯化钠、无水硫酸钠、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，均为色谱纯，购自阿拉丁试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制。
在50 mL容量瓶中，精密称取百菌清标准品20 mg，加入40 mL二氯甲烷，放入超声浴中溶解15 min，冷却至室温，用二氯甲烷稀释至刻度，混匀，贮于冰箱中。
1.2.2 色谱条件。
检测器：紫外检测器；检测波长：240 nm；色谱柱：Gemini 5 μm，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇-水（75%∶25%）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量10 μL。
1.2.3 样品前处理及测定。
该试验采用浓度为1.0 mg/L百菌清对云南小粒速溶咖啡进行处理，采用3种不同的方法提取净化百菌清，并进行高效液相色谱法测定。
1.2.3.1 石油醚-丙酮萃取法（处理①）。
称取1 g速溶咖啡，用37 μm（相当于400目）筛选，置于100 mL 具塞三角瓶中。
加入石油醚-丙酮（4∶1）混合溶剂30 mL，超声提取15 min，过滤后取滤液净化。
吸取试样提取液2 mL，注入已淋洗过的层析柱中，用石油醚-乙酸乙酯（95∶5）混合溶剂100 mL 洗脱。
收集洗脱液于蒸馏瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩近干，用少量石油醚多次溶解残渣于刻度离心管中，定容至1.0 mL，在色谱条件下进行分析。
1.2.3.2 固相吸附法（处理②）。
称取1 g速溶咖啡于50 mL具盖离心管中，精确至0.1 mg，加入10 mL水，振荡，直至样品被水充分浸润，静止10 min。
移取10 mL乙腈和1 mL混合内标工作液到离心管中，于旋涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡1 min，分别加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠和5 mL甲苯，立即于旋涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4 000 r/min 离心10 min。
移取5 mL样品提取液上层清液于10 mL离心管中，加入500 mg无水硫酸镁和150 mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，于旋涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以6 000 r/min 离心2 min，上机测定。
1.2.3.3 二氯甲烷-丙酮萃取法（处理③）。
称取1 g速溶咖啡，用37 μm（相当于400目）筛选，置于100 mL 具塞三角瓶中。
加入30 mL二氯甲烷与丙酮混合液（9∶1），在超声浴中提取15 min。
提取液过装有无水硫酸钠的漏斗，用20 mL二氯甲烷洗涤比色管3次，用100 mL蒸馏瓶收集滤液。
30 ℃水浴在旋转蒸发器上蒸发至近5 mL，过弗罗里硅土预柱，用20 mL二氯甲烷分3次洗蒸馏瓶。
再用60 mL二氯甲烷分4次洗涤预柱，收集全部预柱流出液于200 mL蒸发皿中。
置于通风橱内，水浴30 ℃挥发至近干，用二氯甲烷移于5 mL比色管内，定容，过0.45 μm有机相滤膜，仪器自动进样检测。
1.2.4 结果计算。
试样中百菌清的质量分数按下式计算：
式中，W为试样中百菌清的质量分数（mg/kg）；A1为被测定试样各组分的峰值（峰高或面积）；A2为百菌清标准的峰值；m1为百菌清标准溶液的质量（ng）；m2为被测定试样的取样量（g）；V1为被测定试样的稀释体积（mL）；V2为被测定试样的进样体积（μL）。
2 结果与分析
百菌清经3种不同的方法提取、净化后用高效液相色谱法测定，通过对回收率的测定进行比较，选出百菌清高效液相色谱法测定最适宜的方法。
百菌清标准品的出峰时间为3.749 min，如图1所示。用1.0 mg/L百菌清处理速溶咖啡后，经高效液相色谱测定其含量，如图2所示，处理①所测误差较大，处理②、③结果准确。根据回收率的计算，处理①、②、③的平均回收率分别为85.3%、111.4%、118.7%。
3种提取纯化的方法操作复杂，均需经多次纯化才能得到合格净化液，耗时长。其中，处理①为普遍采用的测定方法，但是回收率较低；处理②与处理③的测定方法准确，精密度较高。因此，后2种均可作为测定百草清的方法，比传统检测法更能满足目前的要求。但是，值得注意的是处理③比处理②更为繁琐，操作过程中误差较大，因此，
建立使用固相吸附法对速溶咖啡中百菌清的提取纯化进行萃取。
3 结论与讨论
据有关数据统计，我国咖啡消费者的数量越来越大，安全问题逐渐成为关注的焦点。咖啡中的农业残留主要是在种植过程中使用或从环境中摄入的，常用的杀虫及杀菌剂有六六六、滴滴涕、乐果、百菌清、多菌灵、甲基托布津等[3]。这些农药的种类繁多，性质各异，在食品中的残留量极低，传统的分析方法难以保证其检测精度。目前，测定农药残留主要采用离子-气象色谱-质谱联用的方法[7]，但是测定费用较高并且针对性较差。随着现代检测技术的进步，开发高效准确的农药残留检测方法，以及制定严格的农药限量标准尤其重要。该研究采用3种不同的方法萃取净化速溶咖啡中百菌清，并通过高效液相色谱检测技术对其加标回收率进行了测定，研究了这几种方法对样品中农藥多残留检测的稳定性和适用性，最终确定采用固相吸附法提取纯化速溶咖啡中的百菌清效果最好。
参考文献
[1] 裴志国.吡虫啉在小麦大田中的残留规律及底物固相分散法在农药残留分析中的应用[D].天津：南开大学，2003.
[2] 刘春华，乐渊，阳辛风，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定生咖啡豆中多菌灵等农药残留[J].广东农业科学，2012，39（24）：108-110.
[3] 李维锐，张洪波，李文伟.小粒种咖啡病虫害防治技术规程：NY/T 1698—2009[S].北京：中国农业出版社，2009.
[4] 石键，沈在忠.黄瓜中百菌清残留量的测定：GB/T 5009.105—2003[S].北京：中国标准出版社，2004.
[5] 王涛，贺红武，薛思佳.新颖除草剂研究进展[J].化学世界，2002，43（11）：608-611.
[6] 饶钦雄，曲明清，赵晓燕，等.HPLC法测定常见蔬菜水果中多菌灵、噻菌灵和苯菌灵残留量[J].上海农业学报，2009，25（4）：85-88.
[7] 邱建伟.茶叶和咖啡中农药多残留的检测方法研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2007.
关键词 速溶咖啡；百菌清；提取净化；方法优化
中图分类号 S571.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）32-0092-02
Stndy on Extraction and Purification Method of Chlorothalonil in Yunnan Small Grain Instant Coffee
LIU Dan-dan1， SUN Xiao-shuai1， WANG Zhi-hong2， HE Fei-fei1* et al （1. School of Agriculture， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091； 2. Yunnan Three Standard of Agriculture and Forestry Science and Technology Co. Ltd.， Kunming， Yunnan 650302）
Abstract [Objective] The aim was to explore the optimal extraction and purijication method for chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee. [Method] Three different extraction and purification methods （aether petrolei-acetone extraction， solid-phase adsorption and dichloromethane-acetone extraction） were performed to extract chlorothalonil in instant coffee. Then all of the extractions were tested using high performance liquid chromatography（HPLC）. The most suitable method was determined according to the percentages of recovery measurement. [Result] The results obtained by three different extraction and purification methods showed that the recovery percentages were 85.3%， 111.4% and 118.7%， respectively. [Conclusions] By comparing recovery rate and purification methods， solid-phase adsorption method was the best one for testing chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee.
Key words Instant coffee； Chlorothalonil； Extraction and purification； Method optimization
云南咖啡属阿拉伯原种的变异种，经过长期的栽培驯化，现被称为“云南小粒种咖啡”。由于云南光照时间长，昼夜温差大，有利于咖啡养分的积累，因此，云南小粒咖啡的营养成分高于国内外其他咖啡品种，形成了自己的特色。随着云南咖啡产业的快速发展，速溶咖啡占据了很大市场。在咖啡的生产栽培过程中会使用大量的杀菌剂及杀虫剂，在咖啡豆的加工中也会出现污染。速溶咖啡属于直接饮用的食品，农药残留等成了安全问题中的最大隐患。
农药残留主要是由直接施药引起的，也可以是吸收环境中的农药或通过食物链富集造成。农药的理化性质、作物类型、施药方法、环境因子都是影响残留的因素。在同一区域内施用多种农药，存在农药的同系物、异构体、降解产物或代謝产物的影响[1]，农作物通过根茎吸收、传导等途径，使農药进入其组织内部，从而加大了检测的难度。因此，发展各种新的分析方法，特别是多种类农药残留量的同时分析方法具有重要的意义。目前，对于咖啡的农药残留检测均局限于对咖啡豆的检测[2]，鲜有关于对速溶咖啡检测的报道。农业部NY/T 289—1995在标准中只是规定了六六六、滴滴涕2种农药的残留量及测定方法[3]。
百菌清是非内吸性广谱杀菌剂，该农药残留的测定方法在黄瓜、茶叶及咖啡豆中均有报道[3-4]，检测方法多为气相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等[5-6]。其中，质谱联用方法灵敏度高，但是价格昂贵，运行成本较高。因此，建立快速、高效、易推广的检测方法具有一定的现实意义。笔者通过加标回收使用3种不同的方法对速溶咖啡中的百菌清进行提纯净化，通过比较探讨该农药最适宜的测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
原料：云南产小粒速溶咖啡。
主要仪器：高效液相色谱仪（Waters，e2695-2489），超声波振荡仪器，旋转蒸发仪。 主要试剂：百菌清标准品（99.5%），购自国家标准物质中心；甲醇、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、柠檬酸氢二钠、乙腈、氯化钠、无水硫酸钠、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，均为色谱纯，购自阿拉丁试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制。
在50 mL容量瓶中，精密称取百菌清标准品20 mg，加入40 mL二氯甲烷，放入超声浴中溶解15 min，冷却至室温，用二氯甲烷稀释至刻度，混匀，贮于冰箱中。
1.2.2 色谱条件。
检测器：紫外检测器；检测波长：240 nm；色谱柱：Gemini 5 μm，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇-水（75%∶25%）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量10 μL。
1.2.3 样品前处理及测定。
该试验采用浓度为1.0 mg/L百菌清对云南小粒速溶咖啡进行处理，采用3种不同的方法提取净化百菌清，并进行高效液相色谱法测定。
1.2.3.1 石油醚-丙酮萃取法（处理①）。
称取1 g速溶咖啡，用37 μm（相当于400目）筛选，置于100 mL 具塞三角瓶中。
加入石油醚-丙酮（4∶1）混合溶剂30 mL，超声提取15 min，过滤后取滤液净化。
吸取试样提取液2 mL，注入已淋洗过的层析柱中，用石油醚-乙酸乙酯（95∶5）混合溶剂100 mL 洗脱。
收集洗脱液于蒸馏瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩近干，用少量石油醚多次溶解残渣于刻度离心管中，定容至1.0 mL，在色谱条件下进行分析。
1.2.3.2 固相吸附法（处理②）。
称取1 g速溶咖啡于50 mL具盖离心管中，精确至0.1 mg，加入10 mL水，振荡，直至样品被水充分浸润，静止10 min。
移取10 mL乙腈和1 mL混合内标工作液到离心管中，于旋涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡1 min，分别加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠和5 mL甲苯，立即于旋涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4 000 r/min 离心10 min。
移取5 mL样品提取液上层清液于10 mL离心管中，加入500 mg无水硫酸镁和150 mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，于旋涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以6 000 r/min 离心2 min，上机测定。
1.2.3.3 二氯甲烷-丙酮萃取法（处理③）。
称取1 g速溶咖啡，用37 μm（相当于400目）筛选，置于100 mL 具塞三角瓶中。
加入30 mL二氯甲烷与丙酮混合液（9∶1），在超声浴中提取15 min。
提取液过装有无水硫酸钠的漏斗，用20 mL二氯甲烷洗涤比色管3次，用100 mL蒸馏瓶收集滤液。
30 ℃水浴在旋转蒸发器上蒸发至近5 mL，过弗罗里硅土预柱，用20 mL二氯甲烷分3次洗蒸馏瓶。
再用60 mL二氯甲烷分4次洗涤预柱，收集全部预柱流出液于200 mL蒸发皿中。
置于通风橱内，水浴30 ℃挥发至近干，用二氯甲烷移于5 mL比色管内，定容，过0.45 μm有机相滤膜，仪器自动进样检测。
1.2.4 结果计算。
试样中百菌清的质量分数按下式计算：
式中，W为试样中百菌清的质量分数（mg/kg）；A1为被测定试样各组分的峰值（峰高或面积）；A2为百菌清标准的峰值；m1为百菌清标准溶液的质量（ng）；m2为被测定试样的取样量（g）；V1为被测定试样的稀释体积（mL）；V2为被测定试样的进样体积（μL）。
2 结果与分析
百菌清经3种不同的方法提取、净化后用高效液相色谱法测定，通过对回收率的测定进行比较，选出百菌清高效液相色谱法测定最适宜的方法。
百菌清标准品的出峰时间为3.749 min，如图1所示。用1.0 mg/L百菌清处理速溶咖啡后，经高效液相色谱测定其含量，如图2所示，处理①所测误差较大，处理②、③结果准确。根据回收率的计算，处理①、②、③的平均回收率分别为85.3%、111.4%、118.7%。
3种提取纯化的方法操作复杂，均需经多次纯化才能得到合格净化液，耗时长。其中，处理①为普遍采用的测定方法，但是回收率较低；处理②与处理③的测定方法准确，精密度较高。因此，后2种均可作为测定百草清的方法，比传统检测法更能满足目前的要求。但是，值得注意的是处理③比处理②更为繁琐，操作过程中误差较大，因此，
建立使用固相吸附法对速溶咖啡中百菌清的提取纯化进行萃取。
3 结论与讨论
据有关数据统计，我国咖啡消费者的数量越来越大，安全问题逐渐成为关注的焦点。咖啡中的农业残留主要是在种植过程中使用或从环境中摄入的，常用的杀虫及杀菌剂有六六六、滴滴涕、乐果、百菌清、多菌灵、甲基托布津等[3]。这些农药的种类繁多，性质各异，在食品中的残留量极低，传统的分析方法难以保证其检测精度。目前，测定农药残留主要采用离子-气象色谱-质谱联用的方法[7]，但是测定费用较高并且针对性较差。随着现代检测技术的进步，开发高效准确的农药残留检测方法，以及制定严格的农药限量标准尤其重要。该研究采用3种不同的方法萃取净化速溶咖啡中百菌清，并通过高效液相色谱检测技术对其加标回收率进行了测定，研究了这几种方法对样品中农藥多残留检测的稳定性和适用性，最终确定采用固相吸附法提取纯化速溶咖啡中的百菌清效果最好。
参考文献
[1] 裴志国.吡虫啉在小麦大田中的残留规律及底物固相分散法在农药残留分析中的应用[D].天津：南开大学，2003.
[2] 刘春华，乐渊，阳辛风，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定生咖啡豆中多菌灵等农药残留[J].广东农业科学，2012，39（24）：108-110.
[3] 李维锐，张洪波，李文伟.小粒种咖啡病虫害防治技术规程：NY/T 1698—2009[S].北京：中国农业出版社，2009.
[4] 石键，沈在忠.黄瓜中百菌清残留量的测定：GB/T 5009.105—2003[S].北京：中国标准出版社，2004.
[5] 王涛，贺红武，薛思佳.新颖除草剂研究进展[J].化学世界，2002，43（11）：608-611.
[6] 饶钦雄，曲明清，赵晓燕，等.HPLC法测定常见蔬菜水果中多菌灵、噻菌灵和苯菌灵残留量[J].上海农业学报，2009，25（4）：85-88.
[7] 邱建伟.茶叶和咖啡中农药多残留的检测方法研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2007.