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摘 要 目的：优选苗药新药舒儿腹贴中处方药材的最佳挥发油提取工艺及提取液的纯化工艺。方法：以挥发油的收率为测评指标优选舒腹儿贴处方药材的挥发油提取工艺；以浸膏中的胡椒碱的含量为测评指标，采用正交试验设计法优选提取挥发油后获取的水提液进行醇沉的纯化工艺。结果：最佳挥发油提取工艺为加入10倍量的水浸泡2h后采用水蒸气蒸馏法提取8h；最佳的纯化工艺采用水提醇沉的纯化方法，将药液浓缩至1g原药材/mL，体系醇浓度调至70％，4℃冷藏8h。结论：优化后提取工艺获取的挥发油收率高 ,最佳的纯化工艺有效成分胡椒碱得到最大限度的保留与富集，验证试验表明该提取纯化工艺稳定、可行。
关键词 舒儿腹贴 挥发油 胡椒碱 提取工艺 纯化工艺 水提醇沉工艺
苗药新药——舒儿腹贴是由贵阳中医学院苗医药专家邱德文教授多年的经验方经剂型改进而成的现代制剂，主要由大果木姜子油、胡椒、丁香、白术、吴茱萸、肉桂、冰片7苗药及中药组成。舒儿腹贴具有温中健脾，助阳止泻，行气止痛的功效，临床主要应用于小儿脾胃虚寒所致泄泻、腹痛及消化不良等证，疗效显著。因挥发油是方中各药材共有的有效部位，而胡椒碱作为方中主药胡椒的有效成分［1］，具有镇静、止痛的作用［2］。故本实验以挥发油得率为指标，采用单因素考察的方法优选挥发油提取的最佳工艺；以浸膏中胡椒碱的含量为测评指标，采用正交试验设计法优选水提液的最佳纯化工艺。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪Waters600型（美国Waters公司）；Diamonsil C18色谱柱(美国迪马公司)；KQ3200DE型医用数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司 )；DZF-6000型真空干燥箱（上海基玮试验仪器设备有限公司）；DFY-300型摇摆式中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；AUW120D电子分析天平（日本岛津公司）；药材均购于贵州济仁堂药业有限公司 ,经贵阳中医学院中药鉴定教研室刘芃教授鉴定为正品,均符合2005版《中国药典》一部［3］的有关规定；色谱甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20060614）；胡椒碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号:0775—9702）；水为重蒸馏水；其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2．1 挥发油提取工艺的优选
2．1．1 粉碎粒度确定 该处方中药材均含挥发性成份，提取过程中粉碎粒度过细常会发生糊化现象，为了能更有效提取而又不造成药材糊化，我们选择将药材制成粗粉后进行提取。
2．1．2 浸泡时间研究 按处方称取吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术总计31．5g药材，置于500mL烧杯中，加入315mL水后密封，分5组。分别标识为浸泡0．5h, 1h, 1．5h, 2h, 2．5 h组,称取并记录吸水后药材重量。结果见表1，浸泡2小时后药材的吸水率不再有明显增加，故选择2h为最佳浸泡时间。
2．1．3 挥发油提取时间的研究 按处方称取吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术总计700g药材，置于5000mL圆底烧瓶中，加10倍量体积的水，浸泡2h,分别采用水蒸气蒸馏法提取挥发油至油量不再增加,每隔1h量取挥发油体积。结果见表2,结果表明提取到8h后挥发油的量不再增加，因此选择8h为挥发油最佳提取时间。
2．1．4 加水量的确定 按处方称取吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术总计31．5g药材3份，分别加入6倍、8倍、10倍水,浸泡2h，提取挥发油8 h后量取挥发油体积，计算挥发油得率=挥发油量/药材量×100﹪。结果见表3，结果表明加入10倍量水的提取挥发油的收率最大，故选择加入10倍量的水为最佳工艺参数。
综合上述结果，以挥发油量为考察指标，通过单因素考察合并综合分析，舒儿腹贴挥发油最佳的提取工艺为将药材粉成粗粉，加10倍量水，浸泡2h，水蒸气蒸馏法提取8h。
2．2 胡椒碱含量测定方法的建立
2．2．1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇︰水(77∶23)为流动相;流速为1．0 mL/min检测波长 434 nm;柱温30 ℃。
2．2．2 对照品溶液配制 取胡椒碱对照品加甲醇制成浓度为0．1632 mg/mL的对照品溶液。
2．2．3 样品溶液制备 精密称取0．05g浸膏粉，置于25mL棕色容量瓶中，加入甲醇约20mL，超声30min,放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用0．45μm微孔滤膜滤过，即可。
2．2．4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液（醇沉供试品10μl，醇提供试品5 μl），注入液相色谱仪。
2．2．5 线性化范围考察 精密称取减压干燥后的胡椒碱对照品，用甲醇溶解制成浓度为0．1632 mg/mL对照品溶液。精密吸取胡椒碱对照品溶液 1, 1．5, 2,2．5, 3,3．5,4 μl注入液相色谱仪，按以上条件进行测定。其回归方程为y=2771016．0714x+101765．0714, r = 0．9997；胡椒碱在0．1632～0．6528μg之间呈良好的线性关系。2．2．6 精密度实验 精密吸取同一对照品溶10μl，注入液相色谱仪，按上述条件进行测定重复测定6次。结果表明精密度良好，RSD %为0．38％。
2．2．7 稳定性试验 取同一样品溶液,每隔1 h进样测试,结果表明样品溶液中被测组分在8 h内基本稳定。
2．2．8 回收率试验 精密称取样品6份，分别精密加入标准品溶液1mL，制备6份供试品溶液，进行测定。结果平均回收率为100．18％，RSD＝1．39％，本方法具有良好的回收率。
2．3 纯化工艺优选
2．3．1 实验设计 组方药材提取挥发油后获取的水提液作为该制剂的重要组成部分应给予保留，但其中所溶解的蛋白质和纤维素等杂质较多，为了提高单位质量的药物有效成分含量，最大限度的保留并富集有效物质，应对挥发油提取后的水提液进行纯化处理。根据文献及处方分析研究，为保留胡椒碱等中等极性的有效成分并利于在制剂中透过皮肤产生治疗作用，本文采用水提醇沉的纯化工艺。醇沉工艺研究中选取体系最终醇浓度（﹪），药液浓缩程度（每毫升药液相当于原药材的量，g/ml），醇沉时间（h）为重要考察因素，用提取液中胡椒碱含量为评价指标，采用正交试验设计方法［4］优选最佳纯化工艺，各因素水平见表4。
2．3．2 实验安排及结果分析 称取药材吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术9份，70g/份，分别按2．1以确定的挥发油提取工艺进行提取，分别收集各实验提取液进行醇沉。将所得药液进行浓缩醇沉,分别置于4℃冰箱中冷藏至规定时间,进行抽滤,干燥,称量所得固型物质量和并按2．2建立的胡椒碱的含量测定方法对浸膏进行胡椒碱的检测。采用L9（34）表安排实验，结果见表5及表6。经直观分析，醇沉工艺各因素对胡椒碱含量影响大小为B＞C＞A，即药液的浓缩程度为最大影响因素，其次为醇沉时间和醇浓度，故最佳组合为A1B1C1 。
2．3．3 工艺验证 按上述优选的工艺A1B1C1制备三批样品，并以胡椒碱含量为指标，按2．2项下色谱条件进行含量测定，结果见表7，结果表明该提取工艺稳定可行，因此优选出的最佳纯化工艺为采用水提醇沉的纯化方法，将药液浓缩至1g原药材/mL，体系醇浓度调至70％时，冷藏8h。
3 讨论
本研究是将传统疗效确切的散剂改进制成现代制剂——巴布膏剂，而该制剂中药材有效物质最大限度的提取和富集的同时最大限度的减少无效物质的溶出将成为重点解决的问题。方中各药材都富含挥发性成分，挥发油在制剂处方中既是主要药效的物质基础，同时挥发油在巴布膏剂中又发挥了透皮促进剂的作用，因此本文重点考察了挥发油的提取工艺，优化了提取工艺参数，得到了较高的挥发油收得率。虽然超临界流体萃取法能提高挥发油的收得率，但是成本较高，规模化难度较大，所以我们依然采用传统的水蒸气蒸馏法来提取挥发油。研究中我们发现在提取挥发油时药材粉碎粒度不能过细，由于该制剂中多为含挥发油类药材，过细易使局部散热不畅，温度过高引起糊化，药粉过细对于水提液来说也难于过滤，选择将药材粉碎成粗粉更宜于挥发油的提取。
而纯化工艺采用了传统经典的水提醇沉的工艺，该工艺能在最大限度保留和富集有效物质的基础上，尽可能的去除无效物质，本文在选取了重要的影响因素基础上通过正交试验设计法优选出了最佳的醇沉工艺，验证试验也说明了优选出的提取及纯化工艺是稳定、可行的。
参考文献
［1］苗明三,李振国．现代实用中药质量控制技术［M］．北京:人民卫生出版社,2000:721
［2］韦琨，窦德强,裴玉萍等．胡椒的化学成分、药理作用及与卡瓦胡椒的对比,中国中药杂志［J］．2002,27(5):333
［3］国家药典委员会．中国药典,Ⅰ部［S］．北京:化学工业出版社，2005
［4］林亚平．药物研究常用数学方法及计算机程序［M］．贵州:贵州科技出版社,1997:126
（收稿日期：2007年9月12日）
关键词 舒儿腹贴 挥发油 胡椒碱 提取工艺 纯化工艺 水提醇沉工艺
苗药新药——舒儿腹贴是由贵阳中医学院苗医药专家邱德文教授多年的经验方经剂型改进而成的现代制剂，主要由大果木姜子油、胡椒、丁香、白术、吴茱萸、肉桂、冰片7苗药及中药组成。舒儿腹贴具有温中健脾，助阳止泻，行气止痛的功效，临床主要应用于小儿脾胃虚寒所致泄泻、腹痛及消化不良等证，疗效显著。因挥发油是方中各药材共有的有效部位，而胡椒碱作为方中主药胡椒的有效成分［1］，具有镇静、止痛的作用［2］。故本实验以挥发油得率为指标，采用单因素考察的方法优选挥发油提取的最佳工艺；以浸膏中胡椒碱的含量为测评指标，采用正交试验设计法优选水提液的最佳纯化工艺。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪Waters600型（美国Waters公司）；Diamonsil C18色谱柱(美国迪马公司)；KQ3200DE型医用数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司 )；DZF-6000型真空干燥箱（上海基玮试验仪器设备有限公司）；DFY-300型摇摆式中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；AUW120D电子分析天平（日本岛津公司）；药材均购于贵州济仁堂药业有限公司 ,经贵阳中医学院中药鉴定教研室刘芃教授鉴定为正品,均符合2005版《中国药典》一部［3］的有关规定；色谱甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20060614）；胡椒碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号:0775—9702）；水为重蒸馏水；其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2．1 挥发油提取工艺的优选
2．1．1 粉碎粒度确定 该处方中药材均含挥发性成份，提取过程中粉碎粒度过细常会发生糊化现象，为了能更有效提取而又不造成药材糊化，我们选择将药材制成粗粉后进行提取。
2．1．2 浸泡时间研究 按处方称取吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术总计31．5g药材，置于500mL烧杯中，加入315mL水后密封，分5组。分别标识为浸泡0．5h, 1h, 1．5h, 2h, 2．5 h组,称取并记录吸水后药材重量。结果见表1，浸泡2小时后药材的吸水率不再有明显增加，故选择2h为最佳浸泡时间。
2．1．3 挥发油提取时间的研究 按处方称取吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术总计700g药材，置于5000mL圆底烧瓶中，加10倍量体积的水，浸泡2h,分别采用水蒸气蒸馏法提取挥发油至油量不再增加,每隔1h量取挥发油体积。结果见表2,结果表明提取到8h后挥发油的量不再增加，因此选择8h为挥发油最佳提取时间。
2．1．4 加水量的确定 按处方称取吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术总计31．5g药材3份，分别加入6倍、8倍、10倍水,浸泡2h，提取挥发油8 h后量取挥发油体积，计算挥发油得率=挥发油量/药材量×100﹪。结果见表3，结果表明加入10倍量水的提取挥发油的收率最大，故选择加入10倍量的水为最佳工艺参数。
综合上述结果，以挥发油量为考察指标，通过单因素考察合并综合分析，舒儿腹贴挥发油最佳的提取工艺为将药材粉成粗粉，加10倍量水，浸泡2h，水蒸气蒸馏法提取8h。
2．2 胡椒碱含量测定方法的建立
2．2．1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇︰水(77∶23)为流动相;流速为1．0 mL/min检测波长 434 nm;柱温30 ℃。
2．2．2 对照品溶液配制 取胡椒碱对照品加甲醇制成浓度为0．1632 mg/mL的对照品溶液。
2．2．3 样品溶液制备 精密称取0．05g浸膏粉，置于25mL棕色容量瓶中，加入甲醇约20mL，超声30min,放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用0．45μm微孔滤膜滤过，即可。
2．2．4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液（醇沉供试品10μl，醇提供试品5 μl），注入液相色谱仪。
2．2．5 线性化范围考察 精密称取减压干燥后的胡椒碱对照品，用甲醇溶解制成浓度为0．1632 mg/mL对照品溶液。精密吸取胡椒碱对照品溶液 1, 1．5, 2,2．5, 3,3．5,4 μl注入液相色谱仪，按以上条件进行测定。其回归方程为y=2771016．0714x+101765．0714, r = 0．9997；胡椒碱在0．1632～0．6528μg之间呈良好的线性关系。2．2．6 精密度实验 精密吸取同一对照品溶10μl，注入液相色谱仪，按上述条件进行测定重复测定6次。结果表明精密度良好，RSD %为0．38％。
2．2．7 稳定性试验 取同一样品溶液,每隔1 h进样测试,结果表明样品溶液中被测组分在8 h内基本稳定。
2．2．8 回收率试验 精密称取样品6份，分别精密加入标准品溶液1mL，制备6份供试品溶液，进行测定。结果平均回收率为100．18％，RSD＝1．39％，本方法具有良好的回收率。
2．3 纯化工艺优选
2．3．1 实验设计 组方药材提取挥发油后获取的水提液作为该制剂的重要组成部分应给予保留，但其中所溶解的蛋白质和纤维素等杂质较多，为了提高单位质量的药物有效成分含量，最大限度的保留并富集有效物质，应对挥发油提取后的水提液进行纯化处理。根据文献及处方分析研究，为保留胡椒碱等中等极性的有效成分并利于在制剂中透过皮肤产生治疗作用，本文采用水提醇沉的纯化工艺。醇沉工艺研究中选取体系最终醇浓度（﹪），药液浓缩程度（每毫升药液相当于原药材的量，g/ml），醇沉时间（h）为重要考察因素，用提取液中胡椒碱含量为评价指标，采用正交试验设计方法［4］优选最佳纯化工艺，各因素水平见表4。
2．3．2 实验安排及结果分析 称取药材吴茱萸，胡椒，肉桂，丁香，白术9份，70g/份，分别按2．1以确定的挥发油提取工艺进行提取，分别收集各实验提取液进行醇沉。将所得药液进行浓缩醇沉,分别置于4℃冰箱中冷藏至规定时间,进行抽滤,干燥,称量所得固型物质量和并按2．2建立的胡椒碱的含量测定方法对浸膏进行胡椒碱的检测。采用L9（34）表安排实验，结果见表5及表6。经直观分析，醇沉工艺各因素对胡椒碱含量影响大小为B＞C＞A，即药液的浓缩程度为最大影响因素，其次为醇沉时间和醇浓度，故最佳组合为A1B1C1 。
2．3．3 工艺验证 按上述优选的工艺A1B1C1制备三批样品，并以胡椒碱含量为指标，按2．2项下色谱条件进行含量测定，结果见表7，结果表明该提取工艺稳定可行，因此优选出的最佳纯化工艺为采用水提醇沉的纯化方法，将药液浓缩至1g原药材/mL，体系醇浓度调至70％时，冷藏8h。
3 讨论
本研究是将传统疗效确切的散剂改进制成现代制剂——巴布膏剂，而该制剂中药材有效物质最大限度的提取和富集的同时最大限度的减少无效物质的溶出将成为重点解决的问题。方中各药材都富含挥发性成分，挥发油在制剂处方中既是主要药效的物质基础，同时挥发油在巴布膏剂中又发挥了透皮促进剂的作用，因此本文重点考察了挥发油的提取工艺，优化了提取工艺参数，得到了较高的挥发油收得率。虽然超临界流体萃取法能提高挥发油的收得率，但是成本较高，规模化难度较大，所以我们依然采用传统的水蒸气蒸馏法来提取挥发油。研究中我们发现在提取挥发油时药材粉碎粒度不能过细，由于该制剂中多为含挥发油类药材，过细易使局部散热不畅，温度过高引起糊化，药粉过细对于水提液来说也难于过滤，选择将药材粉碎成粗粉更宜于挥发油的提取。
而纯化工艺采用了传统经典的水提醇沉的工艺，该工艺能在最大限度保留和富集有效物质的基础上，尽可能的去除无效物质，本文在选取了重要的影响因素基础上通过正交试验设计法优选出了最佳的醇沉工艺，验证试验也说明了优选出的提取及纯化工艺是稳定、可行的。
参考文献
［1］苗明三,李振国．现代实用中药质量控制技术［M］．北京:人民卫生出版社,2000:721
［2］韦琨，窦德强,裴玉萍等．胡椒的化学成分、药理作用及与卡瓦胡椒的对比,中国中药杂志［J］．2002,27(5):333
［3］国家药典委员会．中国药典,Ⅰ部［S］．北京:化学工业出版社，2005
［4］林亚平．药物研究常用数学方法及计算机程序［M］．贵州:贵州科技出版社,1997:126
（收稿日期：2007年9月12日）