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摘要：结直肠癌是来源于结肠或直肠黏膜上皮的恶性肿瘤。非编码RNA（miRNA和LncRNA）在结直肠癌的发生与发展中起重要作用。本文拟通过对已有的结直肠癌芯片数据进行分析，筛选出结直肠癌组织中特异性表达的基因。本研究获得四个结直肠癌芯片数据：GSE54129、GSE28700、GSE99415和GSE99416。功能富集分析提示差异表达基因主要参与PI3k-Akt信号通路。
关键词：GEO数据库;结直肠癌;差异基因;非编码RNA
结直肠癌（Colorectal cancer）是全球范围内发病率最高的三种癌症之一，因其较高的侵袭和转移特性，结直肠癌导致死亡在癌症相关的死亡中占据第二位[1]。结直肠癌的发生和进展涉及基因调控的巨大变化，包括mRNA、miRNA和IncRNA。提供早期诊断和预后信息的生物标志物在结直肠癌治疗中具有重要意义。竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假说认为mRNA、lncRNA等转录物可以通过miRNA应答元件（miRNA response element，MRE）竞争性结合miRNA，相互联系以及相互调控各自的表达水平，产生大规模的调控网络，进而影响他们功能的发挥[2]。这些研究极大拓展了人类基因组遗传信息的功能，同时也展示了转录后调控的全新模式，为理解肿瘤疾病的发生机制提供了新思路。
在本研究中，我们充分利用GEO在线数据库的数据集，通过分析四个微阵列数据集来比较结直肠癌样本与癌旁组织之间的基因表达差异。对差异表达基因进行功能富集分析。研究结果将对结直肠癌发病机制提供深刻认识。
一、材料与方法
1.表达谱芯片数据来源
本次研究中应用到的基因表达芯片数据都是通过在基因芯片数据库即 GEO
（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索并下载得到的。检索GEO数据库时，检索条件为，关键词：colorectal cancer;研究类型：Expression profiling by array;在检索结果中，按标准筛选出所需的基因表达芯片数据集。
筛选标准：
（1）基因表达芯片所研究的样本，为人类总 RNA。
（2）基因表达数据集得研究目标必须是配对的结直肠癌组织和癌旁组织。
（3）每个基因表达数据集研究的样本数量不少于5对。
（4）基因表达数据集必须能下载到基因表达芯片的原始数据。
2. 数据的标准化、质控与差异表迖基因筛选
2.1数据标准化
采用R软件，利用 Bioconductor及affy包的RMA 算法处理芯片数据，依次对芯片数据进行背景校正、标准化及 log2 处理。利用 MetaQC 包对标准化后的表达数据进行质控处理。
2.2 差异表迖基因筛选
应用稳健的多阵列平均算法对每个序列的原始微阵列数据进行背景校正和四分位数据归一化，并分别根据注释文件将探针名称作为标记基因符号。在筛选了无相应基因符号的探针后，计算了具有多个探针的基因符号的平均值。使用R软件limma软件包对选定的胃肿瘤组织及其匹配的正常样本进行了比较。log2（fold）|>1.585和p值<0.05的 mRNA被认为是差异表达的mRNA（DEMS）， |log2（fold）|>1和p值<0.05 的miRNA和LncRNAs被认为是差异表达的miRNA（DEmis）和LncRNAs（DELs）。
2.3 差异表达基因的功能富集分析
利用 DAVID 数据库（DAVID， https：//david.ncifcrf.gov/） 中的在线分析工具对得到的差异基因进行基因功能注释（GO分析）及KEGG通路富集分析。P值<0.05為统计上有显著差异。
2.4 CeRNA网络构建
利用TargetScanHuman 7.2 （http：//www.targetscan.org/vert_72/） 和LncBase Predicted v.2 （http：//carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/）预测miRNA 与 mRNA， 及miRNA与 lncRNA之间的互作关系。Target Scan Human 参数设置为累计加权分< -0.4。LncBase Predicted v.2参数设置为miTG-score > 0.7。利用Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）对ceRNA网络进行可视化做图。
二、结果
1.芯片数据筛选结果
本研究获得了用于结直肠癌分析的四个芯片数据：GSE54129、GSE28700、GSE99415和GSE99416。GSE54129为基于GPL570 2.0芯片的mRNA数据，其中包含111个手术切除的结直肠癌组织和21个匹配的正常组织。GSE28700为基于GPL9081 1.0 miRNA芯片的数据，含有22个结直肠癌组织和22个匹配的正常组织数据。GSE99415为基于GPL18058 microRNA芯片的数据，含有6个结直肠癌和6个匹配的正常组织数据。GSE99416为基于GPL16956 Agilent-045997 Arraystar human lncRNA 芯片的数据，含6个结直肠癌组织和6个匹配的正常组织数据。 1.差异表达基因的鉴定
以|log2（fold）|>1.585和p值<0.05为阈值，在GSE54129中得到了1867条差异表达的mRNAs（966下调，901上调）。在GSE28700中共筛选了44个差异表达的miRNA（30下调，14上调）。在GSE99416 中，鉴定出4329条差异表达的LncRNAs（1974上调，2355下调）。
2.功能分析
图1显示了应用DAVID在线数据库鉴定的差异表达基因的前20个功能富集分析的结果。最重要的生物过程是细胞外基质组织、血管生成、细胞黏附、表皮细胞分化和上皮细胞分化。此结果结果在KEGG路径分析中得到验证。差异表达基因主要参与癌症的途径，PI3k-Akt途径，局灶性粘连，环受体相互作用和CYP450代谢途径。然后，我们分别用上调和下调的差异表达基因进行了KEGG信号通路分析。值得注意的是，调控基因主要参与局灶性粘连、环受体相互作用和PI3k-Akt信号通路（表1）。
3.ceRNA 网络构建
通过TargetScanHuman和 LncBase Predicted v.2预测的mRNAs 和 lncRNAs 被确定为DEMis目标基因。此外，为了筛选可靠的基因，将目标基因与DEMS和DELS进行了比较，只选取了重叠基因（图2）。
讨论
本研究通过 GEO 数据库检索结直肠癌基因表达芯片数据，利用生物信息学方法深入分析结直肠癌发病相关的差异表达ncRNA。功能富集分析提示差异表达基因主要参与PI3k-Akt信号通路。
研究发现多种lncRNAs在胃癌发生、发展中起重要作用。胃癌组织和胃癌细胞株中存在多种表达异常的lncRNAs， 其表达水平呈现不同的升高或者下降，在胃癌的发生、发展中发挥促癌基因或抑癌基因的作用，参与胃癌的增殖、凋亡、侵袭及转移[3]。在胃癌中起促癌基因作用的lncRNAs主要有H19，HOTAIR，LINC00152，CCAT1等[4]。起抑癌基因作用的主要有MEG3，AC138128.1，RP11-119F7.4等[5]。
TCGA数据集miRNomes数据挖掘显示，miR-133a、miR-133b以及miR-1在GC中持续下调[6]。微阵列法和qPCR法均在结直肠癌细胞株和原代结直肠癌组织中证实了这一结果[7]。三组结直肠癌患者及相应的非肿瘤组织均独立检测miR-133在胃癌中的表达水平。结果进一步显示miR-133的下调更有可能在肿瘤大小、浸润深度和周围器官转移方面表现较差[8]。miR-133功能障碍是影响整体生存的独立预后因素。此外，通过荧光素酶检测，miR-133靶向EGFR和HER-2的3’UTR，可能阻断细胞生长信号，抑制细胞生长，最终促进细胞凋亡[9]。此外，miR-133a在结直肠癌细胞中的表达低，抑制了细胞增殖、侵袭和诱导凋亡。它还可以与多种基因结合，包括结肠COL1A1， FSCN1和泛素特异性蛋白酶39（USP 39）[10]。这些miR-133在结直肠癌中的相关研究结果，阐明了miRNA介导途径抑制癌基因的新机制，为结直肠癌治疗提供了新的途径。
PI3k-Akt途径在细胞入侵和迁移等一系列细胞反应中扮演重要角色，这些反应通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡来促进肿瘤的进展。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-Akt信号通路已被报道在人类癌症中显示出频繁的变化，并被认为与EGFR/ERBB家族受体特异性相互作用。据报道，PI3K-Akt信号通路介导p27的调控，与宫颈癌细胞周期阻滞和凋亡有关[11]。在骨癌中，癌症疼痛与MCP-1密切相关，MCP-1通过PI3K/Akt通路介导刺激脊髓小胶质细胞[12]。
前期研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/（mTOR）信号通路的靶蛋白在结直肠癌的发生发展中起着重要作用，因此可能为治疗提供靶点。该通路在细胞的生长、增殖、代谢、存活和血管生成等多种功能中发挥着重要作用[12]。PI3K介导的生长因子信号通路通过AKT、TSC1和TSC2激活mTOR。TSC1和TSC2形成二聚体（TSC1/TSC2），间接调控mTOR活性。当上游信号被激活时，TSC1/TSC2被AKT抑制，允许mTOR激活。在癌细胞中，PI3K-AKT活性的增加导致mTORC1磷酸化活化，P70S6K1-mTORC2的反馈活性降低。这些变化导致线粒体活性增加、血管生成、核糖体生物发生以促进蛋白质合成、细胞生长、增殖和自噬[13]。总之，研究结果揭示了可能参与胃癌发生的若干通路。这些结果有可能为临床上进一步研究和阐明结直肠癌的发生提供一些帮助，并且它们有可能是结直肠癌治疗的新靶点。
参考文献
[1] 万德森， 陈功. 结直肠癌的流行病学及其危险因素研究近况[J]. 实用癌症杂志， 2000， 015（002）：220-222.
[2] 湯国辉， 贺修胜. 结直肠癌相关长链非编码RNA的研究进展[J]. 中南医学科学杂志， 2018， v.46（03）：23-28.
[3] Ye H， Lin J，YaoX， LiY， LinX， Lu H.Overexpression oflong non-coding RNA NNT-AS1 correlates with tumor progression and poor prognosis in osteosarcoma. Cell Physiol Biochem. 2018， 45：1904-1914. [4] Williams GT， Farzaneh F. Are snoRNAs and snoRNA host genes new players in cancer？ Nat Rev Cancer. 2012;12：84-88.
[5] Yu D， Kahen E， Cubitt CL， et al. identification of synergistic， clini cally achievable， combination therapies for osteosarcoma. Sci Rep. 2015， 5：16991.
[6] Poy MN， Eliasson L， Krutzfeldt J et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature， 2004， 432： 226–230.
[7] El Ouaamari A， Baroukh N， Martens GA， et al. miR-375 targets 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 and regulates glucose-induced biological responses in pancreatic cells. Diabetes， 2008， 57： 2708，2717.
[8] Gauwerky CE， Huebner K， Isobe M， et al. Activation of MYC in a masked t （8; 17） translocation results in an aggressive B-cell leukemia. Proc Natl Acad Sci USA， 1989， 86： 8867–8871.
[9] Chen CZ， Li L， Lodish HF， et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science， 2004， 303： 83–86.
[10] Pan JJ， Zhang SW， Chen CB， et al. Effect of recombinant adenovirus-p53 combined with radiotherapy on long-term prognosis of advanced nasopharyngeal carcinoma. J Clin Oncol， 2008， 27（5）： 799–804.
[11] 张月涵， 张春梅， 潘云. 宫颈癌与NFκB、PI3K/AKT信號通路的研究进展[J]. 中国临床研究， 2018， 31（04）：565-567.
[12] 许世杰， 姚明， 徐龙生，等. PI3K 激酶对骨癌痛大鼠及其脊髓炎症因子表达的调节[J]. 中华医学杂志， 2016， 96（004）：297-300.
[13] [斯庆图娜拉， 刘磊. 抑制自噬增加PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂引起的胃癌细胞死亡[J]. 中国实验诊断学， 2015， 000（009）：1457-1460.
通讯作者：王燕，实验师，研究方向为多基因疾病发病机制研究。
本项目受湖南省教育厅科研基金资助（19C0201）
关键词：GEO数据库;结直肠癌;差异基因;非编码RNA
结直肠癌（Colorectal cancer）是全球范围内发病率最高的三种癌症之一，因其较高的侵袭和转移特性，结直肠癌导致死亡在癌症相关的死亡中占据第二位[1]。结直肠癌的发生和进展涉及基因调控的巨大变化，包括mRNA、miRNA和IncRNA。提供早期诊断和预后信息的生物标志物在结直肠癌治疗中具有重要意义。竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假说认为mRNA、lncRNA等转录物可以通过miRNA应答元件（miRNA response element，MRE）竞争性结合miRNA，相互联系以及相互调控各自的表达水平，产生大规模的调控网络，进而影响他们功能的发挥[2]。这些研究极大拓展了人类基因组遗传信息的功能，同时也展示了转录后调控的全新模式，为理解肿瘤疾病的发生机制提供了新思路。
在本研究中，我们充分利用GEO在线数据库的数据集，通过分析四个微阵列数据集来比较结直肠癌样本与癌旁组织之间的基因表达差异。对差异表达基因进行功能富集分析。研究结果将对结直肠癌发病机制提供深刻认识。
一、材料与方法
1.表达谱芯片数据来源
本次研究中应用到的基因表达芯片数据都是通过在基因芯片数据库即 GEO
（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索并下载得到的。检索GEO数据库时，检索条件为，关键词：colorectal cancer;研究类型：Expression profiling by array;在检索结果中，按标准筛选出所需的基因表达芯片数据集。
筛选标准：
（1）基因表达芯片所研究的样本，为人类总 RNA。
（2）基因表达数据集得研究目标必须是配对的结直肠癌组织和癌旁组织。
（3）每个基因表达数据集研究的样本数量不少于5对。
（4）基因表达数据集必须能下载到基因表达芯片的原始数据。
2. 数据的标准化、质控与差异表迖基因筛选
2.1数据标准化
采用R软件，利用 Bioconductor及affy包的RMA 算法处理芯片数据，依次对芯片数据进行背景校正、标准化及 log2 处理。利用 MetaQC 包对标准化后的表达数据进行质控处理。
2.2 差异表迖基因筛选
应用稳健的多阵列平均算法对每个序列的原始微阵列数据进行背景校正和四分位数据归一化，并分别根据注释文件将探针名称作为标记基因符号。在筛选了无相应基因符号的探针后，计算了具有多个探针的基因符号的平均值。使用R软件limma软件包对选定的胃肿瘤组织及其匹配的正常样本进行了比较。log2（fold）|>1.585和p值<0.05的 mRNA被认为是差异表达的mRNA（DEMS）， |log2（fold）|>1和p值<0.05 的miRNA和LncRNAs被认为是差异表达的miRNA（DEmis）和LncRNAs（DELs）。
2.3 差异表达基因的功能富集分析
利用 DAVID 数据库（DAVID， https：//david.ncifcrf.gov/） 中的在线分析工具对得到的差异基因进行基因功能注释（GO分析）及KEGG通路富集分析。P值<0.05為统计上有显著差异。
2.4 CeRNA网络构建
利用TargetScanHuman 7.2 （http：//www.targetscan.org/vert_72/） 和LncBase Predicted v.2 （http：//carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/）预测miRNA 与 mRNA， 及miRNA与 lncRNA之间的互作关系。Target Scan Human 参数设置为累计加权分< -0.4。LncBase Predicted v.2参数设置为miTG-score > 0.7。利用Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）对ceRNA网络进行可视化做图。
二、结果
1.芯片数据筛选结果
本研究获得了用于结直肠癌分析的四个芯片数据：GSE54129、GSE28700、GSE99415和GSE99416。GSE54129为基于GPL570 2.0芯片的mRNA数据，其中包含111个手术切除的结直肠癌组织和21个匹配的正常组织。GSE28700为基于GPL9081 1.0 miRNA芯片的数据，含有22个结直肠癌组织和22个匹配的正常组织数据。GSE99415为基于GPL18058 microRNA芯片的数据，含有6个结直肠癌和6个匹配的正常组织数据。GSE99416为基于GPL16956 Agilent-045997 Arraystar human lncRNA 芯片的数据，含6个结直肠癌组织和6个匹配的正常组织数据。 1.差异表达基因的鉴定
以|log2（fold）|>1.585和p值<0.05为阈值，在GSE54129中得到了1867条差异表达的mRNAs（966下调，901上调）。在GSE28700中共筛选了44个差异表达的miRNA（30下调，14上调）。在GSE99416 中，鉴定出4329条差异表达的LncRNAs（1974上调，2355下调）。
2.功能分析
图1显示了应用DAVID在线数据库鉴定的差异表达基因的前20个功能富集分析的结果。最重要的生物过程是细胞外基质组织、血管生成、细胞黏附、表皮细胞分化和上皮细胞分化。此结果结果在KEGG路径分析中得到验证。差异表达基因主要参与癌症的途径，PI3k-Akt途径，局灶性粘连，环受体相互作用和CYP450代谢途径。然后，我们分别用上调和下调的差异表达基因进行了KEGG信号通路分析。值得注意的是，调控基因主要参与局灶性粘连、环受体相互作用和PI3k-Akt信号通路（表1）。
3.ceRNA 网络构建
通过TargetScanHuman和 LncBase Predicted v.2预测的mRNAs 和 lncRNAs 被确定为DEMis目标基因。此外，为了筛选可靠的基因，将目标基因与DEMS和DELS进行了比较，只选取了重叠基因（图2）。
讨论
本研究通过 GEO 数据库检索结直肠癌基因表达芯片数据，利用生物信息学方法深入分析结直肠癌发病相关的差异表达ncRNA。功能富集分析提示差异表达基因主要参与PI3k-Akt信号通路。
研究发现多种lncRNAs在胃癌发生、发展中起重要作用。胃癌组织和胃癌细胞株中存在多种表达异常的lncRNAs， 其表达水平呈现不同的升高或者下降，在胃癌的发生、发展中发挥促癌基因或抑癌基因的作用，参与胃癌的增殖、凋亡、侵袭及转移[3]。在胃癌中起促癌基因作用的lncRNAs主要有H19，HOTAIR，LINC00152，CCAT1等[4]。起抑癌基因作用的主要有MEG3，AC138128.1，RP11-119F7.4等[5]。
TCGA数据集miRNomes数据挖掘显示，miR-133a、miR-133b以及miR-1在GC中持续下调[6]。微阵列法和qPCR法均在结直肠癌细胞株和原代结直肠癌组织中证实了这一结果[7]。三组结直肠癌患者及相应的非肿瘤组织均独立检测miR-133在胃癌中的表达水平。结果进一步显示miR-133的下调更有可能在肿瘤大小、浸润深度和周围器官转移方面表现较差[8]。miR-133功能障碍是影响整体生存的独立预后因素。此外，通过荧光素酶检测，miR-133靶向EGFR和HER-2的3’UTR，可能阻断细胞生长信号，抑制细胞生长，最终促进细胞凋亡[9]。此外，miR-133a在结直肠癌细胞中的表达低，抑制了细胞增殖、侵袭和诱导凋亡。它还可以与多种基因结合，包括结肠COL1A1， FSCN1和泛素特异性蛋白酶39（USP 39）[10]。这些miR-133在结直肠癌中的相关研究结果，阐明了miRNA介导途径抑制癌基因的新机制，为结直肠癌治疗提供了新的途径。
PI3k-Akt途径在细胞入侵和迁移等一系列细胞反应中扮演重要角色，这些反应通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡来促进肿瘤的进展。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-Akt信号通路已被报道在人类癌症中显示出频繁的变化，并被认为与EGFR/ERBB家族受体特异性相互作用。据报道，PI3K-Akt信号通路介导p27的调控，与宫颈癌细胞周期阻滞和凋亡有关[11]。在骨癌中，癌症疼痛与MCP-1密切相关，MCP-1通过PI3K/Akt通路介导刺激脊髓小胶质细胞[12]。
前期研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/（mTOR）信号通路的靶蛋白在结直肠癌的发生发展中起着重要作用，因此可能为治疗提供靶点。该通路在细胞的生长、增殖、代谢、存活和血管生成等多种功能中发挥着重要作用[12]。PI3K介导的生长因子信号通路通过AKT、TSC1和TSC2激活mTOR。TSC1和TSC2形成二聚体（TSC1/TSC2），间接调控mTOR活性。当上游信号被激活时，TSC1/TSC2被AKT抑制，允许mTOR激活。在癌细胞中，PI3K-AKT活性的增加导致mTORC1磷酸化活化，P70S6K1-mTORC2的反馈活性降低。这些变化导致线粒体活性增加、血管生成、核糖体生物发生以促进蛋白质合成、细胞生长、增殖和自噬[13]。总之，研究结果揭示了可能参与胃癌发生的若干通路。这些结果有可能为临床上进一步研究和阐明结直肠癌的发生提供一些帮助，并且它们有可能是结直肠癌治疗的新靶点。
参考文献
[1] 万德森， 陈功. 结直肠癌的流行病学及其危险因素研究近况[J]. 实用癌症杂志， 2000， 015（002）：220-222.
[2] 湯国辉， 贺修胜. 结直肠癌相关长链非编码RNA的研究进展[J]. 中南医学科学杂志， 2018， v.46（03）：23-28.
[3] Ye H， Lin J，YaoX， LiY， LinX， Lu H.Overexpression oflong non-coding RNA NNT-AS1 correlates with tumor progression and poor prognosis in osteosarcoma. Cell Physiol Biochem. 2018， 45：1904-1914. [4] Williams GT， Farzaneh F. Are snoRNAs and snoRNA host genes new players in cancer？ Nat Rev Cancer. 2012;12：84-88.
[5] Yu D， Kahen E， Cubitt CL， et al. identification of synergistic， clini cally achievable， combination therapies for osteosarcoma. Sci Rep. 2015， 5：16991.
[6] Poy MN， Eliasson L， Krutzfeldt J et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature， 2004， 432： 226–230.
[7] El Ouaamari A， Baroukh N， Martens GA， et al. miR-375 targets 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 and regulates glucose-induced biological responses in pancreatic cells. Diabetes， 2008， 57： 2708，2717.
[8] Gauwerky CE， Huebner K， Isobe M， et al. Activation of MYC in a masked t （8; 17） translocation results in an aggressive B-cell leukemia. Proc Natl Acad Sci USA， 1989， 86： 8867–8871.
[9] Chen CZ， Li L， Lodish HF， et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science， 2004， 303： 83–86.
[10] Pan JJ， Zhang SW， Chen CB， et al. Effect of recombinant adenovirus-p53 combined with radiotherapy on long-term prognosis of advanced nasopharyngeal carcinoma. J Clin Oncol， 2008， 27（5）： 799–804.
[11] 张月涵， 张春梅， 潘云. 宫颈癌与NFκB、PI3K/AKT信號通路的研究进展[J]. 中国临床研究， 2018， 31（04）：565-567.
[12] 许世杰， 姚明， 徐龙生，等. PI3K 激酶对骨癌痛大鼠及其脊髓炎症因子表达的调节[J]. 中华医学杂志， 2016， 96（004）：297-300.
[13] [斯庆图娜拉， 刘磊. 抑制自噬增加PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂引起的胃癌细胞死亡[J]. 中国实验诊断学， 2015， 000（009）：1457-1460.
通讯作者：王燕，实验师，研究方向为多基因疾病发病机制研究。
本项目受湖南省教育厅科研基金资助（19C0201）