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摘要：目的：建立一种快速、灵敏的正向高效液相色谱法测定角鲨烯胶囊中角鲨烯的含量。方法：角鲨烯胶囊内容物经异辛烷溶解稀释后，采用SunFire TM Prep Silica色谱柱、0.5%甲醇-0.5%正辛醇-异辛烷流动相进行分离，紫外检测器210nm处进行检测。结果：10～1000g/mL浓度范围内角鲨烯呈良好的线性关系，相关系数r=0.999，最低定量限为10g/mL。低、中、高3个浓度水平的加标回收率均值为102.1%，相对标准偏差为1.0%。采用所建方法对市售3批角鲨烯胶囊进行含量测定，角鲨烯标示含量均符合规定。结论：所建方法适合角鲨烯胶囊中角鲨烯的含量测定。
关键词：正相高效液相色谱法 角鲨烯 含量测定
中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）14-0016-02
Abstract：Objective：To establish a rapid and sensitive method for determination of squalene in squalene capsules by normal-phase high performance liquid chromatography. Methods：Squalene was extracted and was dissolved and diluted by isooctane， using a mobile phase of isooctane with 0.5% methanol and 0.5% n-octyl alcohol on SunFire TM Prep silica column by UV-detector at 210 nm. Results：The calibration curves showed good linear relationship in the range of 10～1000mg/mL for squalene with the correlation coefficient of 0.999.The limit of quantification （LQD） of squalene was10mg/mL. The average recovery of squalene was 102.1% and the relative standard deviations was 1.0 %. Three batches of squalene capsules were measured by our method， which showed that the content of squalene in all tested samples met the specified requirements. Conclusion：The method was proved to be suitable for determination of squalene in squalene capsules.
Key Words：Normal-phase high performance liquid chromatography Squalene Determination of content
角鲨烯，化学名称为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜[1]。由于角鲨烯具有增强机体免疫能力、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等广泛的生理功能，目前被广泛应用于各种保健食品中[2]。角鲨烯的含量测定方法主要包括气相色谱法[3-5]、液相色谱法[6-8]、质谱法[9]等。气相色谱法测定角鲨烯需经衍生化，样品预处理繁琐，而反相高效液相色潽法及质谱法测定角鲨烯同样存在色谱条件复杂，样品前处理过程繁琐等缺点。本文基于正向高效液相色谱法，建立了角鲨烯胶囊中角鲨烯的含量测定方法，并用于市售角鲨烯胶囊的含量测定。
1 材料与方法
1.1 仪器
梅特勒-托利多XS205DU型电子天平；Waters1525 HPLC（美国Waters公司）；紫外检测器；Empower2数据处理系统（Waters）；Thermo低温离心机。
1.2 样品与试剂
角鲨烯对照品（批号140721-200601，含量99.5%）购于中国药品生物制品检定所；异辛烷购于Fisher
Scientific，HPLC级（LOT：067362），正辛醇购于aladdiin，HPLC级（LOT：E1216020）；甲醇购于Honeywell，LC-MS级（LOT：10315431）。实验所用样品均为市售角鲨烯胶囊。
1.3 色谱条件
色谱柱：SunFireTM Prep Silica（5m4.6×250mm）；流动相：异辛烷，含0.5%正辛醇、0.5%甲醇；流速：1.0mL/min；进样量：5L。检测波长：210nm。
1.4 对照品储备液的配制
取角鲨烯对照品约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1mL约含1mg角鲨烯的对照品储备液。
1.5 供试品溶液制备
取角鲨烯胶囊内容物约10mg，精密称定，置20mL量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2 实验结果
2.1 色谱条件的优化
根据文献报道，角鲨烯最大紫外吸收波长为210nm。本实验中分别考察流动相异辛烷中含0.1%正辛醇、 0.1%甲醇，含0.5%正辛醇、0.5%甲醇；及含1%正辛醇，1%甲醇等不同比例的分析结果，采用0.5%甲醇-0.5%正辛醇-异辛烷流动相，角鲨烯色谱峰峰形较好，分离度、对称因子、拖尾因子等考察结果最佳。分别考察 0.5mL/min，1.0mL/min，1.5mL/min3种流速，结果表明不同流速只影响角鲨烯的保留时间，对角鲨烯色谱峰参数无影响。本实验采用1.0mL/min的流速，流动相比例为0.5%甲醇-0.5%正辛醇-异辛烷，上述色谱条件下，角鲨烯对照品典型色谱图如图1所示，保留时间为4.5min。 2.2 线性范围及最低定量限
分别精密量取上述对照品储备液，用异辛烷稀释至浓度分别为10，50，100，200，400，600，800，1000g/mL的对照品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线，角鲨烯线性方程为：Y=10486X+263556（r=0.999），结果表明，角鲨烯在10～1000g/mL范围内线性良好，最低定量限为10g/mL（信噪比S/N=40）。如图2。
2.3 精密度
日内精密度：上述色谱条件下，取对照品溶液（500 g/mL）重复进样6次，以角鲨烯色谱峰计，6次进样色谱峰面积RSD为0.3%。日间精密度：取500mg/mL对照品溶液，按上述色谱条件连续进样3天，角鲨烯峰面积的RSD为0.5%，表明该方法的精密度良好。
2.4 加标回收率
取角鲨烯胶囊内容物约5mg，精密称定，置20mL量瓶中，分别加入4mL，5mL，6mL对照品储备液，每个加标浓度重复3次，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，供液相色谱进样分析。加标回收率试验结果如表1所示，不同加标浓度的平均回收率为102.1%，RSD为1.0%。
2.5 样品测定结果
取市售不同生产厂家的三批角鲨烯胶囊，按所建方法进行样品处理并检测角鲨烯含量，结果如表2所示，3批样品中角鲨烯含量的实测值均在“80%标示值～120%标示值”范围内，符合我国《食品营养成分标示准则》的相关规定。
3 讨论
目前，国家食品药品监督管理总局批准上市的角鲨烯类保健食品多达17种[10]。食品中角鲨烯的现行标准检验方法为前卫生部于2003年颁布的《保健食品检验与评价技术规范》[11]，该方法采用气相色谱法测定，前处理方法复杂，分析时间长。本文参考《保健食品功效成分检测方法》，结合角鲨烯胶囊的剂型特点，基于正相色谱法建立角鲨烯软胶囊中角鲨烯的含量测定方法，样品只需用异辛烷溶解稀释，方法简便，快速，灵敏度高，适合保健食品角鲨烯胶囊中角鲨烯的含量测定。
参考文献
[1]吴立军.天然药物化学[M].5版.北京：人民卫生出版社，2003：220-222.
[2]赵振东，孙震.生物活性角鲨烯的资源及其应用研究进展[J].林产化学与工业，2004（3）：107-107.
[3]李和，阮栋梁，李玉帼.灰星鲨肝油中角鲨烯的分离与鉴定[J].中国海洋药物，2004（3）：34-35.
[4]车欣颖，卢雯.气相色谱法测定角鲨烯软胶囊中角鲨烯含量[J].齐齐哈尔医学院学报，200829（12）：1475-1476.
[5]王晓明，扈健，李玲.气相色谱填充柱法同时测定α-亚麻酸和角鲨烯[J].中国卫生检验杂志，2006（2）：212-212.
[6]梁新华，郑彩霞，张风侠.甘草中角鲨烯高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药，2010（8）：1856-1857.
[7]邹海民，曹铸，曾红燕.功能食品中角鲨烯的气相和液相色谱方法比较[J].现代预防医学，2014（2）：293-299.
[8]白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].1版.北京：中国中医药出版社，2011：178-179.
[9]付松，向仕学.气相色谱-质谱法检测保健食品中角鲨烯[J].中国卫生检验杂志，2003（6）：717-717.
[10]国家食品药品监督管理总局.数据查询[DB/OL].北京.
[11]中华人民共和国卫生部，保健食品检验与评价技术规范[S].北京：2003：266-268.
关键词：正相高效液相色谱法 角鲨烯 含量测定
中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）14-0016-02
Abstract：Objective：To establish a rapid and sensitive method for determination of squalene in squalene capsules by normal-phase high performance liquid chromatography. Methods：Squalene was extracted and was dissolved and diluted by isooctane， using a mobile phase of isooctane with 0.5% methanol and 0.5% n-octyl alcohol on SunFire TM Prep silica column by UV-detector at 210 nm. Results：The calibration curves showed good linear relationship in the range of 10～1000mg/mL for squalene with the correlation coefficient of 0.999.The limit of quantification （LQD） of squalene was10mg/mL. The average recovery of squalene was 102.1% and the relative standard deviations was 1.0 %. Three batches of squalene capsules were measured by our method， which showed that the content of squalene in all tested samples met the specified requirements. Conclusion：The method was proved to be suitable for determination of squalene in squalene capsules.
Key Words：Normal-phase high performance liquid chromatography Squalene Determination of content
角鲨烯，化学名称为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜[1]。由于角鲨烯具有增强机体免疫能力、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等广泛的生理功能，目前被广泛应用于各种保健食品中[2]。角鲨烯的含量测定方法主要包括气相色谱法[3-5]、液相色谱法[6-8]、质谱法[9]等。气相色谱法测定角鲨烯需经衍生化，样品预处理繁琐，而反相高效液相色潽法及质谱法测定角鲨烯同样存在色谱条件复杂，样品前处理过程繁琐等缺点。本文基于正向高效液相色谱法，建立了角鲨烯胶囊中角鲨烯的含量测定方法，并用于市售角鲨烯胶囊的含量测定。
1 材料与方法
1.1 仪器
梅特勒-托利多XS205DU型电子天平；Waters1525 HPLC（美国Waters公司）；紫外检测器；Empower2数据处理系统（Waters）；Thermo低温离心机。
1.2 样品与试剂
角鲨烯对照品（批号140721-200601，含量99.5%）购于中国药品生物制品检定所；异辛烷购于Fisher
Scientific，HPLC级（LOT：067362），正辛醇购于aladdiin，HPLC级（LOT：E1216020）；甲醇购于Honeywell，LC-MS级（LOT：10315431）。实验所用样品均为市售角鲨烯胶囊。
1.3 色谱条件
色谱柱：SunFireTM Prep Silica（5m4.6×250mm）；流动相：异辛烷，含0.5%正辛醇、0.5%甲醇；流速：1.0mL/min；进样量：5L。检测波长：210nm。
1.4 对照品储备液的配制
取角鲨烯对照品约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，用异辛烷溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1mL约含1mg角鲨烯的对照品储备液。
1.5 供试品溶液制备
取角鲨烯胶囊内容物约10mg，精密称定，置20mL量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2 实验结果
2.1 色谱条件的优化
根据文献报道，角鲨烯最大紫外吸收波长为210nm。本实验中分别考察流动相异辛烷中含0.1%正辛醇、 0.1%甲醇，含0.5%正辛醇、0.5%甲醇；及含1%正辛醇，1%甲醇等不同比例的分析结果，采用0.5%甲醇-0.5%正辛醇-异辛烷流动相，角鲨烯色谱峰峰形较好，分离度、对称因子、拖尾因子等考察结果最佳。分别考察 0.5mL/min，1.0mL/min，1.5mL/min3种流速，结果表明不同流速只影响角鲨烯的保留时间，对角鲨烯色谱峰参数无影响。本实验采用1.0mL/min的流速，流动相比例为0.5%甲醇-0.5%正辛醇-异辛烷，上述色谱条件下，角鲨烯对照品典型色谱图如图1所示，保留时间为4.5min。 2.2 线性范围及最低定量限
分别精密量取上述对照品储备液，用异辛烷稀释至浓度分别为10，50，100，200，400，600，800，1000g/mL的对照品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线，角鲨烯线性方程为：Y=10486X+263556（r=0.999），结果表明，角鲨烯在10～1000g/mL范围内线性良好，最低定量限为10g/mL（信噪比S/N=40）。如图2。
2.3 精密度
日内精密度：上述色谱条件下，取对照品溶液（500 g/mL）重复进样6次，以角鲨烯色谱峰计，6次进样色谱峰面积RSD为0.3%。日间精密度：取500mg/mL对照品溶液，按上述色谱条件连续进样3天，角鲨烯峰面积的RSD为0.5%，表明该方法的精密度良好。
2.4 加标回收率
取角鲨烯胶囊内容物约5mg，精密称定，置20mL量瓶中，分别加入4mL，5mL，6mL对照品储备液，每个加标浓度重复3次，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，供液相色谱进样分析。加标回收率试验结果如表1所示，不同加标浓度的平均回收率为102.1%，RSD为1.0%。
2.5 样品测定结果
取市售不同生产厂家的三批角鲨烯胶囊，按所建方法进行样品处理并检测角鲨烯含量，结果如表2所示，3批样品中角鲨烯含量的实测值均在“80%标示值～120%标示值”范围内，符合我国《食品营养成分标示准则》的相关规定。
3 讨论
目前，国家食品药品监督管理总局批准上市的角鲨烯类保健食品多达17种[10]。食品中角鲨烯的现行标准检验方法为前卫生部于2003年颁布的《保健食品检验与评价技术规范》[11]，该方法采用气相色谱法测定，前处理方法复杂，分析时间长。本文参考《保健食品功效成分检测方法》，结合角鲨烯胶囊的剂型特点，基于正相色谱法建立角鲨烯软胶囊中角鲨烯的含量测定方法，样品只需用异辛烷溶解稀释，方法简便，快速，灵敏度高，适合保健食品角鲨烯胶囊中角鲨烯的含量测定。
参考文献
[1]吴立军.天然药物化学[M].5版.北京：人民卫生出版社，2003：220-222.
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[4]车欣颖，卢雯.气相色谱法测定角鲨烯软胶囊中角鲨烯含量[J].齐齐哈尔医学院学报，200829（12）：1475-1476.
[5]王晓明，扈健，李玲.气相色谱填充柱法同时测定α-亚麻酸和角鲨烯[J].中国卫生检验杂志，2006（2）：212-212.
[6]梁新华，郑彩霞，张风侠.甘草中角鲨烯高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药，2010（8）：1856-1857.
[7]邹海民，曹铸，曾红燕.功能食品中角鲨烯的气相和液相色谱方法比较[J].现代预防医学，2014（2）：293-299.
[8]白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].1版.北京：中国中医药出版社，2011：178-179.
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