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[摘要] 目的 探讨流式细胞术在检测甲状腺穿刺组织细胞角蛋白－19中的应用，评估其在进一步临床诊断应用中的可行性。方法 取我院2006年1月~2008年6月手术切除甲状腺肿物标本进行穿刺获取组织并制备成单细胞悬液，采用流式细胞术检测悬液中的CK-19表达；根据术后标本病理分为良性组（23例）及恶性组（17例）。结果 恶性组中，阳性表达13例（76.4％），良性组中100％阴性表达。灵敏度76.4％，特异性100％，准确度为90.0％；与国内外采用免疫组化方法的灵敏度及特异性相当。结论 CK-19是鉴别良恶性甲状腺肿瘤特异的及敏感的指标，采用流式细胞术能较准确地检测甲状腺穿刺组织中CK-19的表达，有进一步临床诊断应用的可行性。
[关键词] 甲状腺肿瘤；流式细胞术；细胞角蛋白－19；细针穿刺
[中图分类号] R7361[文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2009）12-18-02
Cytokeratins-19 Expression in Biopsy Specimens from Thyroid Neoplasm Detected by Flow Cytometry
HUANG QingnanHUANG YaoZHAO Jie
The People’s of Futian District in Shenzhen，Guangdong 518033
[Abstract] Objective To study cytokeratins-19 expression in biopsy specimens from thyroid neoplasm detected by flow cytometry and estimate its clinical diagnosis utility. Methods The 50 biopsy specimens were collected after thyroid neoplasm exairesis from January 2006 to June 2008 in the foruth people’s hospital of Shenzhen city.All the biopsy specimens were prepared in cell suspension and detected the cytekeratins-19expression，according to postoperative pathology diagnosis，all the specimens was divided into two groups：innocence group（23 cases） and m alignant group（17 cases）. Results 13 cases were positive expression（76.4%） in m alignant groups，all the case were negative expression， sensitivity was 76.4%，specificity was 100%，accuracy was 90%. The sensitivity and the specificity were correspondent to the approach by the immunohistochemisty. Conclusion Cytokeratins-19 is sensitive and specific marker. The approach by the flow cytometry can accuratelydetect the Ck-19 expression in thyroid biopsy specimen，theclinical diagnosis utility is feasible.
[Key Words] Thyroid neoplasms；Flow cytometry；Cytokeratins-19；Biopsy
流式細胞术具有检测速度快、测量指标多，采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，其在肿瘤研究中已广泛应用。流式细胞术已广泛应用于石蜡标本[1]及新鲜穿刺标本[2]的肿瘤标志物的检测。本研究主要通过采用流式细胞术对穿刺甲状腺组织细胞角蛋白-19（Cytokeratins-19，CK-19）表达情况的测定，从而达到肿瘤定性的目的及评估性在进一步临床诊断应用中的可行性。
1材料与方法
1.1标本来源
取我院2006年1月~2008年7月手术切除甲状腺肿物标本进行细针穿刺获取组织，其中男13例，女27例；良性病变23例（其中腺瘤8例，结节性甲状腺肿大15例）；恶性病变17例（乳头状癌15例，滤泡癌2例）；平均年龄（42±8.6）岁。
1.2单细胞悬液的制作[3]
将获取的穿刺标本反复用生理盐水洗涤，以眼科剪将组织剪至匀浆状加入5mLPBS液，用吸管吸取组织匀浆先以200目铜网过滤到试管内离心沉淀3000r/min，3~5min后，再用PBS液洗三次，每次以1000r/min的低速离心5min去除细胞碎片，以350目尼龙网过滤去除细胞团块，取上述细胞悬液，用白细胞计数板显微镜下计数并调细胞浓度为（1～2）×106个/mL。
1.3抗体标记
取约1×106细胞的悬液100μl，分别加入对照管及测定管，每管加入10μl CD45-PC5单抗，置室温15min，离心洗涤后再加破膜剂Intraprep Rengent 1固定15min，经洗涤再加入Reagent 2破膜，5min后加入CK19-FIFC置室温暗处待机检测。
1.4流式细胞仪测定
采用beckman-epics-XL流式细胞仪测定并用专业软件处理数据。
1.5统计学处理
采用SPSS10.0软件处理，计数资料的组间比较采用四格表FISHER精确概率法检验。灵敏度=癌的阳性例数/癌的总数×100%；特异度=良性总例数×100%；准确度= （癌的阳性例数 良性的阴性例数） / （癌的总例数 良性的总例数）。
2结果
在恶性组17例（乳头状癌15例，滤泡癌2例）中，阳性表达有13例（76.4％），良性组23例（其中腺瘤8例，结节性甲状腺肿大15例）中阴性表达23例（100％）；两组间CK-19的阳性表达率用四格表FISHER精确概率法检验，差别具有统计学意义，灵敏度=13/17×100％=76.4％，特异度100％，准确度90.0％。细胞角蛋白-19是鉴别良恶性甲状腺肿瘤特异性及敏感的指标，采用流式细胞术检测甲状腺穿刺组织中CK-19的表达情况如表1。在甲状腺肿瘤定性上敏感度、特异性及准确性高，有进一步临床诊断应用的可行性。
3讨论
甲状腺肿瘤为我国较高发的肿瘤之一，及早明确甲状腺肿瘤的性质对避免良性病变患者不必要的手术及改善恶性肿瘤患者的预后有相当重要的意义。尽管有很多检查方法如超声及CT及MRI等检查技术用于甲状腺肿瘤的诊断，但对于肿瘤定性上仍有很大局限。组织细胞病理学是肿瘤定性的主要方法，但对以组织结构改变为主，强调实质和间质成分关系的病变，如甲状腺乳头状癌、滤泡状癌与乳头状增生结节的鉴别上有困难[4]。
CK-19是可用于甲状腺鉴别诊断的一种相对分子质量低的角蛋白[5]，Miettinen等[6]认为CK-19可区别乳头状癌和乳头状增生，Baloch[7]等其认为对滤泡型乳头状癌和其他滤泡性病变亦有区别作用，研究发现在甲状腺良性病变中CK-19多为阴性，仅少数阳性表达，即使结甲和甲亢的乳头状增生结节大多亦为阴性，滤泡性癌中大多阳性并中度及强阳性，特别是在包膜浸润处明显阳性，而乳头状癌不论经典型还是滤泡型基本都是中、强阳性表达，在癌周围组织中一些散在浸润腺体亦为明显阳性，而不同于背景组织，提示CK-19阳性表达是滤泡细胞增生恶变的重要标志，不但可作为甲状腺良、恶性病变，尤其是乳头状癌诊断的重要依据，而且可以提示一些恶性病变倾向，防止漏诊。
目前CK-19的检测主要是通过免疫组织化学方法进行，在甲状腺穿刺组织用流式细胞术来检测CK-19的表达，目前国内外很少报道；本研究用手术切除标本模仿活体穿刺操作，以保持与活体操作的一致性；用穿刺组织制备成细胞悬液，再用流式细胞术来检测CK-19的表达；从结果可以看到用本方法得出的CK-19的表达情况在甲状腺肿瘤定性上与报道[8]用免疫组织化学方法得出的敏感度、特异度及准确度相近。由此可见，用流式细胞术来检测甲状腺穿刺组织CK-19的表达，有助于甲状腺肿瘤的定性，且有进一步临床诊断应用的可行性。
[参考文献]
[1] 齐亚灵，方艳秋，段秀梅，等. 凋亡抑制蛋白Survivin在原发性肝细胞癌中的表达及其意义[J]. 吉林大学学报（医学版），2008，38（1）：135- 138.
[2] 沈宗丽，朱月清，莊一平，等. 流式细胞术检测遗传不稳定性：肺癌穿刺标本中DNA异倍体与P16表达[J]. 中华医学遗传学杂志，2007，24（3）：322-324.
[3] 贾云香，孙兆瑶，卓夏阳，等. 流式细胞术新鲜实体瘤检测样本的制作[J]. 江西医学检验，2006，24（6）：513-514.
[4] 方芳，郑宏庭，刘理等. 细针穿刺细胞学检查对甲状腺肿瘤诊断价值的探讨[J]. 重庆医学，2006，35（10）：877-878.
[5] 滕晓东，王丽君，姚洪田，等. 细胞角蛋白19、galectin-3、HBME-1在甲状腺病变上的表达及鉴别诊断意义[J]. 中华病理学杂志，2004，33（3）：212-216.
[6] Miettinen M，Kovatich AJ，Karkkainen P. Keratin subsets in papillary and follicular thyroid lesions：a paraffin section analysis with diagnosis implications[J]. Vichows Arch，1997，431（6）：407-4l3．
[7] Baloch ZW，Abraham S，Roberts S，et a1. Differential expression of cytokeratins in follicular variant papillary carcinoma：an imunohistochemical study and its diagnostic utility[J]. Hum Patho1，1999，30（10）：l166-1171.
[8] 何春年，Lili H，Jin Q CH，等. 甲状腺乳头状癌诊断与鉴别的可靠标记物[J]. 临床与实验病理学杂志，2007，23（6）：694-698.
（收稿日期：2008-12-23）
[关键词] 甲状腺肿瘤；流式细胞术；细胞角蛋白－19；细针穿刺
[中图分类号] R7361[文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2009）12-18-02
Cytokeratins-19 Expression in Biopsy Specimens from Thyroid Neoplasm Detected by Flow Cytometry
HUANG QingnanHUANG YaoZHAO Jie
The People’s of Futian District in Shenzhen，Guangdong 518033
[Abstract] Objective To study cytokeratins-19 expression in biopsy specimens from thyroid neoplasm detected by flow cytometry and estimate its clinical diagnosis utility. Methods The 50 biopsy specimens were collected after thyroid neoplasm exairesis from January 2006 to June 2008 in the foruth people’s hospital of Shenzhen city.All the biopsy specimens were prepared in cell suspension and detected the cytekeratins-19expression，according to postoperative pathology diagnosis，all the specimens was divided into two groups：innocence group（23 cases） and m alignant group（17 cases）. Results 13 cases were positive expression（76.4%） in m alignant groups，all the case were negative expression， sensitivity was 76.4%，specificity was 100%，accuracy was 90%. The sensitivity and the specificity were correspondent to the approach by the immunohistochemisty. Conclusion Cytokeratins-19 is sensitive and specific marker. The approach by the flow cytometry can accuratelydetect the Ck-19 expression in thyroid biopsy specimen，theclinical diagnosis utility is feasible.
[Key Words] Thyroid neoplasms；Flow cytometry；Cytokeratins-19；Biopsy
流式細胞术具有检测速度快、测量指标多，采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，其在肿瘤研究中已广泛应用。流式细胞术已广泛应用于石蜡标本[1]及新鲜穿刺标本[2]的肿瘤标志物的检测。本研究主要通过采用流式细胞术对穿刺甲状腺组织细胞角蛋白-19（Cytokeratins-19，CK-19）表达情况的测定，从而达到肿瘤定性的目的及评估性在进一步临床诊断应用中的可行性。
1材料与方法
1.1标本来源
取我院2006年1月~2008年7月手术切除甲状腺肿物标本进行细针穿刺获取组织，其中男13例，女27例；良性病变23例（其中腺瘤8例，结节性甲状腺肿大15例）；恶性病变17例（乳头状癌15例，滤泡癌2例）；平均年龄（42±8.6）岁。
1.2单细胞悬液的制作[3]
将获取的穿刺标本反复用生理盐水洗涤，以眼科剪将组织剪至匀浆状加入5mLPBS液，用吸管吸取组织匀浆先以200目铜网过滤到试管内离心沉淀3000r/min，3~5min后，再用PBS液洗三次，每次以1000r/min的低速离心5min去除细胞碎片，以350目尼龙网过滤去除细胞团块，取上述细胞悬液，用白细胞计数板显微镜下计数并调细胞浓度为（1～2）×106个/mL。
1.3抗体标记
取约1×106细胞的悬液100μl，分别加入对照管及测定管，每管加入10μl CD45-PC5单抗，置室温15min，离心洗涤后再加破膜剂Intraprep Rengent 1固定15min，经洗涤再加入Reagent 2破膜，5min后加入CK19-FIFC置室温暗处待机检测。
1.4流式细胞仪测定
采用beckman-epics-XL流式细胞仪测定并用专业软件处理数据。
1.5统计学处理
采用SPSS10.0软件处理，计数资料的组间比较采用四格表FISHER精确概率法检验。灵敏度=癌的阳性例数/癌的总数×100%；特异度=良性总例数×100%；准确度= （癌的阳性例数 良性的阴性例数） / （癌的总例数 良性的总例数）。
2结果
在恶性组17例（乳头状癌15例，滤泡癌2例）中，阳性表达有13例（76.4％），良性组23例（其中腺瘤8例，结节性甲状腺肿大15例）中阴性表达23例（100％）；两组间CK-19的阳性表达率用四格表FISHER精确概率法检验，差别具有统计学意义，灵敏度=13/17×100％=76.4％，特异度100％，准确度90.0％。细胞角蛋白-19是鉴别良恶性甲状腺肿瘤特异性及敏感的指标，采用流式细胞术检测甲状腺穿刺组织中CK-19的表达情况如表1。在甲状腺肿瘤定性上敏感度、特异性及准确性高，有进一步临床诊断应用的可行性。
3讨论
甲状腺肿瘤为我国较高发的肿瘤之一，及早明确甲状腺肿瘤的性质对避免良性病变患者不必要的手术及改善恶性肿瘤患者的预后有相当重要的意义。尽管有很多检查方法如超声及CT及MRI等检查技术用于甲状腺肿瘤的诊断，但对于肿瘤定性上仍有很大局限。组织细胞病理学是肿瘤定性的主要方法，但对以组织结构改变为主，强调实质和间质成分关系的病变，如甲状腺乳头状癌、滤泡状癌与乳头状增生结节的鉴别上有困难[4]。
CK-19是可用于甲状腺鉴别诊断的一种相对分子质量低的角蛋白[5]，Miettinen等[6]认为CK-19可区别乳头状癌和乳头状增生，Baloch[7]等其认为对滤泡型乳头状癌和其他滤泡性病变亦有区别作用，研究发现在甲状腺良性病变中CK-19多为阴性，仅少数阳性表达，即使结甲和甲亢的乳头状增生结节大多亦为阴性，滤泡性癌中大多阳性并中度及强阳性，特别是在包膜浸润处明显阳性，而乳头状癌不论经典型还是滤泡型基本都是中、强阳性表达，在癌周围组织中一些散在浸润腺体亦为明显阳性，而不同于背景组织，提示CK-19阳性表达是滤泡细胞增生恶变的重要标志，不但可作为甲状腺良、恶性病变，尤其是乳头状癌诊断的重要依据，而且可以提示一些恶性病变倾向，防止漏诊。
目前CK-19的检测主要是通过免疫组织化学方法进行，在甲状腺穿刺组织用流式细胞术来检测CK-19的表达，目前国内外很少报道；本研究用手术切除标本模仿活体穿刺操作，以保持与活体操作的一致性；用穿刺组织制备成细胞悬液，再用流式细胞术来检测CK-19的表达；从结果可以看到用本方法得出的CK-19的表达情况在甲状腺肿瘤定性上与报道[8]用免疫组织化学方法得出的敏感度、特异度及准确度相近。由此可见，用流式细胞术来检测甲状腺穿刺组织CK-19的表达，有助于甲状腺肿瘤的定性，且有进一步临床诊断应用的可行性。
[参考文献]
[1] 齐亚灵，方艳秋，段秀梅，等. 凋亡抑制蛋白Survivin在原发性肝细胞癌中的表达及其意义[J]. 吉林大学学报（医学版），2008，38（1）：135- 138.
[2] 沈宗丽，朱月清，莊一平，等. 流式细胞术检测遗传不稳定性：肺癌穿刺标本中DNA异倍体与P16表达[J]. 中华医学遗传学杂志，2007，24（3）：322-324.
[3] 贾云香，孙兆瑶，卓夏阳，等. 流式细胞术新鲜实体瘤检测样本的制作[J]. 江西医学检验，2006，24（6）：513-514.
[4] 方芳，郑宏庭，刘理等. 细针穿刺细胞学检查对甲状腺肿瘤诊断价值的探讨[J]. 重庆医学，2006，35（10）：877-878.
[5] 滕晓东，王丽君，姚洪田，等. 细胞角蛋白19、galectin-3、HBME-1在甲状腺病变上的表达及鉴别诊断意义[J]. 中华病理学杂志，2004，33（3）：212-216.
[6] Miettinen M，Kovatich AJ，Karkkainen P. Keratin subsets in papillary and follicular thyroid lesions：a paraffin section analysis with diagnosis implications[J]. Vichows Arch，1997，431（6）：407-4l3．
[7] Baloch ZW，Abraham S，Roberts S，et a1. Differential expression of cytokeratins in follicular variant papillary carcinoma：an imunohistochemical study and its diagnostic utility[J]. Hum Patho1，1999，30（10）：l166-1171.
[8] 何春年，Lili H，Jin Q CH，等. 甲状腺乳头状癌诊断与鉴别的可靠标记物[J]. 临床与实验病理学杂志，2007，23（6）：694-698.
（收稿日期：2008-12-23）