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关键词东亚飞蝗;FK506结合蛋白;金龟子绿僵菌;保护酶
FK506结合蛋白（FK506 binding proteins，FK-BPs）是一类以胞内蛋白为主的蛋白质超家族，因其与FKS06（Prograf，普乐可复）的相互作用而得名，它具有肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIases）活性，可催化多肽或蛋白质底物中的肽一脯氨酸顺反子的转换，从而影响其活性、磷酸化状态、蛋白质间相互作用、亚细胞定位及稳定性。FKBPs能够结合环孢素a（CsA）、FKS06或雷帕霉素，发挥免疫抑制效应。在免疫细胞中，FKBPs和FKS06的二元复合体共同作用，抑制钙调磷酸酶（CAN）的活性，进一步作用于磷酸化信号途径，使免疫细胞产生免疫抑制作用。此外，FKS06结合蛋白还有许多其他重要生理功能，如细胞周期调节、钙离子通道活性调节以及发育调节等作用。
金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae作为一类广谱性的昆虫病原真菌，对害虫生物防治具有重要作用。其侵染方式主要有体壁侵入和体内增殖两种。其中体壁侵染机制是金龟子绿僵菌孢子附着在寄主体表后，形成附着胞和侵染钉，在一系列胞外酶的作用下，穿透体壁进人体腔，形成虫菌体，大量繁殖，消耗寄主营养，并分泌多种毒素，最终造成寄主死亡。研究发现，采用金龟子绿僵菌制剂可以有效控制蝗虫为害，但与化学农药相比，存在致死效率低、致死时间长的弊端。其原因一方面是金龟子绿僵菌侵染所需时间较长，另一方面是东亚飞蝗具有较强的免疫防御反应。因此，我们推测可以通过改变蝗虫体内FKBPs的量，抑制东亚飞蝗免疫活性，促进金龟子绿僵菌侵染，达到加速蝗虫死亡的目的。
本试验通过定量PCR检测了FKBP52基因在东亚飞蝗不同组织中的表达情况，克隆了FKBP52基因，并获得了FKBP52蛋白，研究了其对金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响，以及对东亚飞蝗体内免疫相关酶的诱导激活作用，为进一步明确FKBP的功能奠定了基础，同时对指导蝗虫防治具有一定的理论意义。
1材料与方法
1.1供试菌株、试虫与试剂
供试金龟子绿僵菌菌株IMl330189为国外引进在本实验室长期保藏。培养条件：将菌株接种到PDAY培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，酵母粉5g，琼脂粉20g，补水定容至1000mL，121℃高压灭菌25min）平板上，25℃下培养5d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。
试验所用东亚飞蝗Locusta migratoria ma-nilensis为本实验室饲养纯化种群，在人工气候培养箱中于温度（30±2）℃，相对湿度（60±5）%，光周期L∥D=14h∥10h条件下孵化后，将同一时问孵化的蝗蝻转移到60cm×50cm×70cm规格的养虫笼中饲养，光周期L∥D=14h∥10h，温度为（30±2）℃。
试剂TRIzol、PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser、LA-Taq酶、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）、无RNase纯水等均购于TaKaRa公司;感受态细胞BL21（DE3）、蛋白Marker和Ni-NTA亲和层析柱购自北京全式金生物有限公司;大肠杆菌Escherichia coli DH5a和载体pET-21b为本实验室保存;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;引物合成和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。
1.2东亚飞蝗总RNA提取和反转录
用TRIzol溶液提取東亚飞蝗成虫后足、体壁、脂肪体和血淋巴等不同组织、卵块、1龄蝗蝻虫体、2～5龄蝗蝻及雌雄成虫中肠的RNA，并用NanoPhotometer微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gD-NA Eraser说明书方法合成cDNA第1链，直接进行后续试验或者-20℃保存备用。
1.3 FKBP52基因在飞蝗成虫不同组织、不同发育阶段中肠中的表达
基于NCBI中已经公布的昆虫FKBP基因序列，结合本实验室前期测得东亚飞蝗转录组数据，获得FKBP52基因的DNA序列;利用DNAMAN6.0软件设计荧光定量PCR引物及基因克隆所需引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.4东亚飞蝗FKBP52基因克隆
以1.2中合成的成虫时期东亚飞蝗cDNA作为模板，FKBP52-F、FKBP52-R为引物，PCR扩增FKBP52基因。反应体系（25μL）：10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，上下游引物（10 gmol/L）各1μL，cDNA1μL，双蒸水17μL。反应条件为：94℃预变性5min;94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90 s，共30个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带切胶回收。将纯化产物连接到pMD19-T载体。采用热激转化法，导人感受态细胞DH5a中;通过氨苄抗性筛选阳性克隆。将筛选到的阳性克隆进行PCR检测，正确的送公司测序。从筛选获得的目标菌株中提取质粒，-20℃保存备用。
1.5生物信息学分析
目的基因核酸序列的翻译以及编码蛋白质序列结构分析预测采用DNAMAN软件;蛋白质分子量预测采用https：//web.expasy.org/cgi-bin/prot-param/protparam在线工具;利用SignalP在线软件信号肽。利用NCBI数据库中BlastP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行氨基酸序列同源性分析，运用在线软件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/smart/set）分析保守结构域。 1.6 FKBPS2蛋白表达与纯化
从测序正确的转化子中提取质粒，以该质粒为模板，用分别带有EcoR工和HindⅢ酶切位点的引物FKBP52-F/FKBP52-R进行PCR，扩增FKBP52全长基因。PCR产物经电泳检测无误后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切。将酶切产物回收，与pET-21b载体进行连接，构建重组表达载体。采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂板、挑单克隆检测。将阳性克隆在LB（Amp）液体培养基中37IC培养至为0.5～0.6时，加入IPTG，至终浓度为0.5 mmol/L，16℃进行诱导表达12h。离心收集菌体，超声波破碎（300w，超声持续5s，暂停5s，重复99个循环）后，4℃，9000r/min离心10min，取上清。用镍柱亲和层析进行蛋白纯化，用SDS-PAGE电泳检测所纯化蛋白浓度。
1.7金龟子绿僵菌与FKBPS2组合对东亚飞蝗生物活性测定
采用金龟子绿僵菌IMI330189孢子悬浮液单次背板点滴和FKBP52蛋白饲喂3龄东亚飞蝗的方法来测定FKBP52对金龟子绿僵菌的毒力影响，称取0.5g金龟子绿僵菌孢子粉于0.05%的吐温80溶液中，用涡旋仪使其混合均匀，随后用血球计数板进行计数，配制成终浓度为4.15×10个/mL的金龟子绿僵菌孢子悬浮液。FKBP52蛋白测定浓度后，配制成终浓度为1mg/mL的蛋白液。共设3个处理1个对照。
处理1：金龟子绿僵菌孢子悬浮液背板点滴，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸;处理2：FKBP52蛋白饲喂，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸 1mL的FKBP52蛋白;处理3：同时进行金龟子绿僵菌孢子悬浮液背板点滴和FKBP52蛋白饲喂，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸 1mL的FKBP52蛋白;对照：同时进行0.05%的吐温80溶液背板点滴和大肠杆菌BL21（DE3）（含有pET-21b空载体）诱导表达的菌体饲喂，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸 1mL终浓度为1mg/mL的空载体诱导表达的蛋白。不同处理中金龟子绿僵菌孢子用量和FKBP52蛋白浓度见表2。对照和所有处理均重复5次。
将预先饥饿处理12h的3龄东亚飞蝗蝗蝻按照30头/筐的标准放人无菌的塑料生测筐中（长×宽×高=30 cmX12 cmX9cm），用已消毒的玻璃板盖好。金龟子绿僵菌单独处理和金龟子绿僵菌 FKBP52共同处理中的蝗蝻全部以背板点滴的方式接种金龟子绿僵菌IMI330189孢子悬浮液（浓度为4.15×10个/mL），对照组中的蝗蝻全部以背板点滴的方式接种0.05%的吐温80溶液，每头蝗蝻接种量为2μL。对照、FKBP52、绿僵菌单独处理以及金龟子绿僵菌 FKBP52共同处理中分别加入相应的饵剂。根据试验设计，24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至试验结束，每日记录蝗虫的死亡数与存活数，连续统计10d。试验于温度30℃，相对湿度60%，光周期L//D=16h//8h生测室内进行。
1.8 FKBP52处理后东亚飞蝗保护酶酶活力测定
按照与1.7相同的方法处理蝗蝻，将3龄蝗蝻分装，每筐15头，每个处理重复3次。第2天开始，从每个处理的3个重复中各取1头蝗虫，解剖收集中肠，于液氮中研磨，加入预冷的20mmol/L Tris-HCl缓冲液，4℃、15000r/min离心20min，取上清作为酶提取液，以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，参照Bradford方法测定每个提取液的蛋白浓度，然后测定酶液中过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具體测定方法参照试剂盒使用说明书。每个样品重复测定3次。
1.9数据处理与分析
采用SPSS19软件进行单因素方差分析，并选用多重比较进行显著性差异分析，其中P
FK506结合蛋白（FK506 binding proteins，FK-BPs）是一类以胞内蛋白为主的蛋白质超家族，因其与FKS06（Prograf，普乐可复）的相互作用而得名，它具有肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIases）活性，可催化多肽或蛋白质底物中的肽一脯氨酸顺反子的转换，从而影响其活性、磷酸化状态、蛋白质间相互作用、亚细胞定位及稳定性。FKBPs能够结合环孢素a（CsA）、FKS06或雷帕霉素，发挥免疫抑制效应。在免疫细胞中，FKBPs和FKS06的二元复合体共同作用，抑制钙调磷酸酶（CAN）的活性，进一步作用于磷酸化信号途径，使免疫细胞产生免疫抑制作用。此外，FKS06结合蛋白还有许多其他重要生理功能，如细胞周期调节、钙离子通道活性调节以及发育调节等作用。
金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae作为一类广谱性的昆虫病原真菌，对害虫生物防治具有重要作用。其侵染方式主要有体壁侵入和体内增殖两种。其中体壁侵染机制是金龟子绿僵菌孢子附着在寄主体表后，形成附着胞和侵染钉，在一系列胞外酶的作用下，穿透体壁进人体腔，形成虫菌体，大量繁殖，消耗寄主营养，并分泌多种毒素，最终造成寄主死亡。研究发现，采用金龟子绿僵菌制剂可以有效控制蝗虫为害，但与化学农药相比，存在致死效率低、致死时间长的弊端。其原因一方面是金龟子绿僵菌侵染所需时间较长，另一方面是东亚飞蝗具有较强的免疫防御反应。因此，我们推测可以通过改变蝗虫体内FKBPs的量，抑制东亚飞蝗免疫活性，促进金龟子绿僵菌侵染，达到加速蝗虫死亡的目的。
本试验通过定量PCR检测了FKBP52基因在东亚飞蝗不同组织中的表达情况，克隆了FKBP52基因，并获得了FKBP52蛋白，研究了其对金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响，以及对东亚飞蝗体内免疫相关酶的诱导激活作用，为进一步明确FKBP的功能奠定了基础，同时对指导蝗虫防治具有一定的理论意义。
1材料与方法
1.1供试菌株、试虫与试剂
供试金龟子绿僵菌菌株IMl330189为国外引进在本实验室长期保藏。培养条件：将菌株接种到PDAY培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，酵母粉5g，琼脂粉20g，补水定容至1000mL，121℃高压灭菌25min）平板上，25℃下培养5d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。
试验所用东亚飞蝗Locusta migratoria ma-nilensis为本实验室饲养纯化种群，在人工气候培养箱中于温度（30±2）℃，相对湿度（60±5）%，光周期L∥D=14h∥10h条件下孵化后，将同一时问孵化的蝗蝻转移到60cm×50cm×70cm规格的养虫笼中饲养，光周期L∥D=14h∥10h，温度为（30±2）℃。
试剂TRIzol、PrimeScriptTM RT Reagent Kitwith gDNA Eraser、LA-Taq酶、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）、无RNase纯水等均购于TaKaRa公司;感受态细胞BL21（DE3）、蛋白Marker和Ni-NTA亲和层析柱购自北京全式金生物有限公司;大肠杆菌Escherichia coli DH5a和载体pET-21b为本实验室保存;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;引物合成和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。
1.2东亚飞蝗总RNA提取和反转录
用TRIzol溶液提取東亚飞蝗成虫后足、体壁、脂肪体和血淋巴等不同组织、卵块、1龄蝗蝻虫体、2～5龄蝗蝻及雌雄成虫中肠的RNA，并用NanoPhotometer微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gD-NA Eraser说明书方法合成cDNA第1链，直接进行后续试验或者-20℃保存备用。
1.3 FKBP52基因在飞蝗成虫不同组织、不同发育阶段中肠中的表达
基于NCBI中已经公布的昆虫FKBP基因序列，结合本实验室前期测得东亚飞蝗转录组数据，获得FKBP52基因的DNA序列;利用DNAMAN6.0软件设计荧光定量PCR引物及基因克隆所需引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.4东亚飞蝗FKBP52基因克隆
以1.2中合成的成虫时期东亚飞蝗cDNA作为模板，FKBP52-F、FKBP52-R为引物，PCR扩增FKBP52基因。反应体系（25μL）：10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，上下游引物（10 gmol/L）各1μL，cDNA1μL，双蒸水17μL。反应条件为：94℃预变性5min;94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸90 s，共30个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带切胶回收。将纯化产物连接到pMD19-T载体。采用热激转化法，导人感受态细胞DH5a中;通过氨苄抗性筛选阳性克隆。将筛选到的阳性克隆进行PCR检测，正确的送公司测序。从筛选获得的目标菌株中提取质粒，-20℃保存备用。
1.5生物信息学分析
目的基因核酸序列的翻译以及编码蛋白质序列结构分析预测采用DNAMAN软件;蛋白质分子量预测采用https：//web.expasy.org/cgi-bin/prot-param/protparam在线工具;利用SignalP在线软件信号肽。利用NCBI数据库中BlastP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行氨基酸序列同源性分析，运用在线软件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/smart/set）分析保守结构域。 1.6 FKBPS2蛋白表达与纯化
从测序正确的转化子中提取质粒，以该质粒为模板，用分别带有EcoR工和HindⅢ酶切位点的引物FKBP52-F/FKBP52-R进行PCR，扩增FKBP52全长基因。PCR产物经电泳检测无误后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切。将酶切产物回收，与pET-21b载体进行连接，构建重组表达载体。采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂板、挑单克隆检测。将阳性克隆在LB（Amp）液体培养基中37IC培养至为0.5～0.6时，加入IPTG，至终浓度为0.5 mmol/L，16℃进行诱导表达12h。离心收集菌体，超声波破碎（300w，超声持续5s，暂停5s，重复99个循环）后，4℃，9000r/min离心10min，取上清。用镍柱亲和层析进行蛋白纯化，用SDS-PAGE电泳检测所纯化蛋白浓度。
1.7金龟子绿僵菌与FKBPS2组合对东亚飞蝗生物活性测定
采用金龟子绿僵菌IMI330189孢子悬浮液单次背板点滴和FKBP52蛋白饲喂3龄东亚飞蝗的方法来测定FKBP52对金龟子绿僵菌的毒力影响，称取0.5g金龟子绿僵菌孢子粉于0.05%的吐温80溶液中，用涡旋仪使其混合均匀，随后用血球计数板进行计数，配制成终浓度为4.15×10个/mL的金龟子绿僵菌孢子悬浮液。FKBP52蛋白测定浓度后，配制成终浓度为1mg/mL的蛋白液。共设3个处理1个对照。
处理1：金龟子绿僵菌孢子悬浮液背板点滴，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸;处理2：FKBP52蛋白饲喂，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸 1mL的FKBP52蛋白;处理3：同时进行金龟子绿僵菌孢子悬浮液背板点滴和FKBP52蛋白饲喂，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸 1mL的FKBP52蛋白;对照：同时进行0.05%的吐温80溶液背板点滴和大肠杆菌BL21（DE3）（含有pET-21b空载体）诱导表达的菌体饲喂，饵剂为1g含5%植物油的无菌麦麸 1mL终浓度为1mg/mL的空载体诱导表达的蛋白。不同处理中金龟子绿僵菌孢子用量和FKBP52蛋白浓度见表2。对照和所有处理均重复5次。
将预先饥饿处理12h的3龄东亚飞蝗蝗蝻按照30头/筐的标准放人无菌的塑料生测筐中（长×宽×高=30 cmX12 cmX9cm），用已消毒的玻璃板盖好。金龟子绿僵菌单独处理和金龟子绿僵菌 FKBP52共同处理中的蝗蝻全部以背板点滴的方式接种金龟子绿僵菌IMI330189孢子悬浮液（浓度为4.15×10个/mL），对照组中的蝗蝻全部以背板点滴的方式接种0.05%的吐温80溶液，每头蝗蝻接种量为2μL。对照、FKBP52、绿僵菌单独处理以及金龟子绿僵菌 FKBP52共同处理中分别加入相应的饵剂。根据试验设计，24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至试验结束，每日记录蝗虫的死亡数与存活数，连续统计10d。试验于温度30℃，相对湿度60%，光周期L//D=16h//8h生测室内进行。
1.8 FKBP52处理后东亚飞蝗保护酶酶活力测定
按照与1.7相同的方法处理蝗蝻，将3龄蝗蝻分装，每筐15头，每个处理重复3次。第2天开始，从每个处理的3个重复中各取1头蝗虫，解剖收集中肠，于液氮中研磨，加入预冷的20mmol/L Tris-HCl缓冲液，4℃、15000r/min离心20min，取上清作为酶提取液，以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，参照Bradford方法测定每个提取液的蛋白浓度，然后测定酶液中过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具體测定方法参照试剂盒使用说明书。每个样品重复测定3次。
1.9数据处理与分析
采用SPSS19软件进行单因素方差分析，并选用多重比较进行显著性差异分析，其中P