【摘 要】
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目的 构建人白细胞介素（interleukin,IL）-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒，为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础。方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列，克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表达载体中，构建过表达质粒；并根据IL-26外显子序列设计4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exo
【基金项目】
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国家自然科学基金（81860355）；
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目的 构建人白细胞介素（interleukin,IL）-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒，为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础。方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列，克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表达载体中，构建过表达质粒；并根据IL-26外显子序列设计4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2，利用CRISPR/Cas9技术构建至lentiCRISPRv2载体中，构建基因敲除质粒。将过表达质粒和基因敲除质粒分别瞬时转染至HEK293T细胞，利用RT-qPCR和Western blot验证IL-26 mRNA和蛋白的表达情况。并对IL-26进行氨基酸序列分析、结构预测及亚细胞定位观察。结果 通过酶切、测序鉴定及生物信息学分析显示，IL-26全长516 bp，编码171个氨基酸。IL-26过表达质粒转染的HEK293T细胞与正常对照组相比，IL-26 mRNA水平升高了656.789倍，蛋白质水平升高了1.978倍，差异均有统计学意义（t分别为17.976和7.859,P分别＜0.000 1和＜0.001）。4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2质粒转染至HEK293T细胞中后，IL-26的表达水平分别下降了0.930、0.980、0.523 3和0.316 9倍，其中Exon3-sgRNA2质粒能够显著下调IL-26的表达（t=7.440,P ＜0.001）。IL-26蛋白的前22个氨基酸存在信号肽结构，且具有一定的跨膜功能，IL-26存在于细胞质中。结论 成功构建了IL-26过表达和基因敲除质粒，为后续IL-26功能的研究奠定了基础。
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