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[摘要]目的：评估外用葡萄籽提取物原花青素对急性光损伤的Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达的影响。方法：实验设计正常皮肤组、单纯2MED照射组、基质＋2MED照射组、含葡萄籽提取物原花青素样品外用＋2MED照射组共四组，连续3天同样处理24h后对皮肤取材，进行Fas蛋白及Bcl-2蛋白免疫组化染色。结果：含葡萄籽提取物原花青素样品外用＋2MED照射组的Fas蛋白表达积分与单纯2MED照射比较明显下降，Bcl-2蛋白表达积分明显增加，接近正常皮肤。结论：葡萄籽提取物原花青素对日晒伤具有一定的防护作用，其机制可能是与Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达相关。
[关键词]葡萄籽提取物原花青素；光损伤；Fas 蛋白, Bcl-2蛋白
[中图分类号]R758.14Q591.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-03
Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on protein expression from acute ultraviolet injury
YUAN Xiao-ying1,LIU Wei1,XIE Yan-fei,GUO Guang-jin1,MENG Ru-song1,FAN Li-ying1,ZHANG Jie1,TIAN Yan1,MA Hui-min1,XIN Xu-ya1
(1. Department of Dermatology, the Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100036,China; 2. Department of Dermatology, the Otorhinolaryngology Hospital of Baitou, Baitou 062510, Hebei,China)
Abstract:ObjectiveIn this study, the Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Fas Protein and Bcl-2 protein expression from acute ultraviolet injury was investigated in skin by solar-simulator radiation. MethodsAreas of skin of normal volunteers were divided into four sites: normal untreated skin, skin treated with 2-MED UV radiation, or skin treated with GPSE solutions or Vehicle 30minutes before 2-MED solar simulated radiation. Skin areas of different sites were examined immunohistochemically for Fas Protein and Bcl-2 protein expression.ResultsOn immunohistochemical examination, Skin treated with GSPE before UV radiation reduced Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression compared with skin treated only with UV radiation.ConclusionGrape Seed Proanthocyanidin Extract may protect skin against acute sunburn partly through reducing Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression.
Key words: Grape Seed Proanthocyanidin Extract, sunburn, Fas , Bcl-2
随着生活水平的提高，人们进行越来越多的户外运动、日光浴，导致接受过多的紫外线照射。研究表明皮肤在急性紫外光损伤过程中，大量氧自由基生成、细胞内钙超载、大量炎性细胞浸润以及线粒体损伤等均可促使皮肤DNA损伤，从而导致角质形成细胞调亡。在细胞调亡过程中，调亡相关的蛋白表达产物Fas蛋白及抗凋亡因子Bcl-2蛋白的作用被认为有重要意义。大量实验表明葡萄籽提取物原花青素（Grape Seed Proanthocyanidin Extract，GSPE）是一种强效抗氧化剂，但对于其是否对光损伤所造成的细胞调亡的影响并不清楚。本实验研究葡萄籽提取物原花青素对皮肤急性光损伤Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达的影响。
1材料和方法
1.1 实验材料与仪器：日光模拟器GS-2000 (中国计量科学研究院生产)，包括一个450瓦的氙灯加上一个WG320滤光片（Schott， Clichy， France），光线输出模拟连续的290 至 400nm 的日光紫外线输出。Fas和Bcl-2单克隆抗体(编号为MAB－0226)、二抗均为美国Maxim公司产品，购自福州迈新生物技术公司。GSPE购自深圳建安公司，纯度为95％，将8克GSPE溶于100ml的50％的乙醇溶液（即基质），制成样品。
1.2 实验对象：实验招募10名志愿者，所有志愿者身体健康，没有接受任何医学治疗，既往没有皮肤病史、日光过敏史。所有的志愿者在试验结束后均获得一定的经济补偿。这项实验由空军总医院伦理委员会批准。
1.3 实验设计：志愿者需要5次就诊。第一天按25％六孔递增法在每位健康志愿者的臀部测定其初始最小红斑量（minimal erythema dose，MED）值。
第二天读取最小红斑量的数值，其中出现边界清楚的红斑所需要的能量即为最小红斑量。在志愿者的背部分别测定为7cm×3cm大小的四处皮肤并做相应标记，分别作为Group1(G1)、Group2(G2)、Group3(G3)、Group4(G4)，其中G1组不作任何处理；G2组连续三天单纯接受2倍MED0值日光模拟照射；G3组先外用基质处理，30min后接受2倍MED值日光模拟照射，连续3天均同样处理；G4组先外用含GSPE的样品，30min后接受2倍MED值日光模拟照射，连续三天。样品和基质的涂抹量为2μl/cm2。
第五天即最后一次照射24h后在四个标记部位的中心分别用3mm孔径的环钻钻取皮肤，用福尔马林液固定，石蜡包埋，切片于4度冰箱保存备用。
1.4 Fas基因和Bcl-2基因蛋白表达检测：取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5张，采用链霉素－生物素－过氧化物酶技术法进行免疫组化染色和AEC显色法。简单的说，石蜡切片经二甲苯和梯度酒精脱水，用PBS冲洗三次，每次5min。3%过氧化氢酶阻断以消除非特异性着色，室温下孵育10min。加特异性第一抗体后放置4℃冰箱过夜，用PBS洗涤三次，每次5min。链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶在室温下孵育10min，用PBS洗涤三次，每次5min，AEC室温8～20min显色，然后用自来水冲洗，苏木素复染，中性封片剂封片。参照Bresalier法[1]，在每张切片上随机观察10个高倍视野，根据每个视野中细胞的染色特征进行计分，未着色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。取其平均值作为整张切片的染色强度评分。
1.5统计学处理：采用SPSS软件进行统计学分析，组间均数比较采用q检验进行，P＜0.05为差异有显著性。
2结果
皮肤组织中Fas基因和Bcl-2基因的蛋白表达
2.1G1组仅可见极少数散在的Fas蛋白阳性染色细胞；G2组和G3组可见较多的Fas蛋白阳性染色细胞；G4组Fas蛋白阳性染色细胞明显减少。
2.2G1组可见较强的的Bcl-2蛋白阳性染色；G2组和G3组可见Bcl-2蛋白阳性染色明显减弱；G4组Bcl-2蛋白阳性染色细胞较前增多，与G1组Bcl-2蛋白阳性染色细胞数目近似。
具体结果图1、图2和表1。
3讨论
短期较强的紫外线照射通常导致皮肤急性光损伤，可明显增加皮肤组织中活性氧自由基的生成，产生过多的氧自由基与细胞内的结构相互作用而造成细胞DNA的损伤，皮肤角质形成细胞出现凋亡。Fas蛋白是存在于细胞表面的一种膜蛋白，为Fas基因的产物，是一种凋亡细胞受体，其活化后可导致细胞在数小时内凋亡[2]，在启动急性光损伤所致的角质形成细胞凋亡中被认为具有极其重要的意义。Bcl-2基因被称为“存活基因”，由Bcl-2基因编码的Bcl-2蛋白位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上[3]，Carson[4]发现Bcl-2蛋白能调节细胞稳态及抑制线粒体中细胞色素C的释放等作用，阻断引起凋亡的最后共同通路，有阻止细胞凋亡的能力。本实验发现，接受2MED紫外线照射后，Fas蛋白表达积分明显升高，而Bcl-2蛋白表达积分明显减少，说明在日晒后皮肤损伤的早期就可能出现了凋亡。
近年来天然抗氧化植物在光损伤及光防护、治疗上受到国内外广泛的关注[5-7]。研究发现一些植物如绿茶、大豆、海藻及部分果实提取物如石榴等抗氧化物质能够对紫外线引起的光损伤引起的角质形成细胞凋亡具有较好的防护及治疗作用。以往研究同样证明，GSPE具有强效的抗氧化作用，在其抗氧化能力是维生素C及维生素E的数十倍[8]，有研究表明GSPE能够对心肌灌注损伤的Fas基因表达上调，Bcl-2基因表达下调，但尚无紫外光损伤方面的实验。本研究结果显示，外用GSPE后再接受2MED紫外线照射的皮肤与单纯接受2MED紫外线照射的皮肤对比，皮肤中Fas蛋白表达积分显著减少，而Bcl-2蛋白表达积分显著增加，在一定程度上说明了GSPE对急性光损伤所致的角质形成细胞凋亡具有防护作用，但是GSPE是否单纯通过此条途径抑制凋亡，尚有待进一步研究。
[参考文献]
[1]Bresalier RS, Ho SB, Schoeppner HI, et al. Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis[J]. Gastroenterology,1996,110: 1354-1367.
[2]Suda T, Takahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas Ligand, a novel member of tumor necrosis factor family[J]. Cell, 1993, 75:1169-1178.
[3]Chen-Levy Z, Cleary ML. Membrane topology of the Bcl-2protooncogenic protein demonstrated in vitro[J]. J Biol Chem,1990,265: 4929-4933.
[4]Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease[J]. Lancet,1993,341: 1251-1254.
[5]Lee BC， Lee SY, leeHJ, et al. Anti-oxidative and photo-protective effects of coumarins isolated from Fraxinus chinensis[J]. Arch Pharm Res, 2007，30（10）：1293-301.
[6]Sevin A, Oztas P, Senen D,et al. Effects of polyphenols on skin damage due to ultraviolet A rays: an experimental study on rats[J]. J Eur Acad dermatol Venereol, 2007，21（5）： 650-656.
[7]Rout S, Banerjee RFree radical scavenging, anti-glycation and tyrosinase inhibition properties of a polysaccharide fraction isolated from the rind from Punica granatum[J]. Bioresour Technol, 2007,98（16）：3159-3163.
[8] Bagchi D, Garg A, Krohn RL, et al. Oxygen free radicals scavenging abilities of Vitamin C and E, and a grape seed proanthocyanidin extract in human vivo[J]. Res Commun Pathol Pharmacol, 1997, 95:179-189.
[收稿日期]2007-12-18[修回日期]2008-03-04
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
[关键词]葡萄籽提取物原花青素；光损伤；Fas 蛋白, Bcl-2蛋白
[中图分类号]R758.14Q591.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-03
Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on protein expression from acute ultraviolet injury
YUAN Xiao-ying1,LIU Wei1,XIE Yan-fei,GUO Guang-jin1,MENG Ru-song1,FAN Li-ying1,ZHANG Jie1,TIAN Yan1,MA Hui-min1,XIN Xu-ya1
(1. Department of Dermatology, the Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100036,China; 2. Department of Dermatology, the Otorhinolaryngology Hospital of Baitou, Baitou 062510, Hebei,China)
Abstract:ObjectiveIn this study, the Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Fas Protein and Bcl-2 protein expression from acute ultraviolet injury was investigated in skin by solar-simulator radiation. MethodsAreas of skin of normal volunteers were divided into four sites: normal untreated skin, skin treated with 2-MED UV radiation, or skin treated with GPSE solutions or Vehicle 30minutes before 2-MED solar simulated radiation. Skin areas of different sites were examined immunohistochemically for Fas Protein and Bcl-2 protein expression.ResultsOn immunohistochemical examination, Skin treated with GSPE before UV radiation reduced Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression compared with skin treated only with UV radiation.ConclusionGrape Seed Proanthocyanidin Extract may protect skin against acute sunburn partly through reducing Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression.
Key words: Grape Seed Proanthocyanidin Extract, sunburn, Fas , Bcl-2
随着生活水平的提高，人们进行越来越多的户外运动、日光浴，导致接受过多的紫外线照射。研究表明皮肤在急性紫外光损伤过程中，大量氧自由基生成、细胞内钙超载、大量炎性细胞浸润以及线粒体损伤等均可促使皮肤DNA损伤，从而导致角质形成细胞调亡。在细胞调亡过程中，调亡相关的蛋白表达产物Fas蛋白及抗凋亡因子Bcl-2蛋白的作用被认为有重要意义。大量实验表明葡萄籽提取物原花青素（Grape Seed Proanthocyanidin Extract，GSPE）是一种强效抗氧化剂，但对于其是否对光损伤所造成的细胞调亡的影响并不清楚。本实验研究葡萄籽提取物原花青素对皮肤急性光损伤Fas蛋白及Bcl-2蛋白表达的影响。
1材料和方法
1.1 实验材料与仪器：日光模拟器GS-2000 (中国计量科学研究院生产)，包括一个450瓦的氙灯加上一个WG320滤光片（Schott， Clichy， France），光线输出模拟连续的290 至 400nm 的日光紫外线输出。Fas和Bcl-2单克隆抗体(编号为MAB－0226)、二抗均为美国Maxim公司产品，购自福州迈新生物技术公司。GSPE购自深圳建安公司，纯度为95％，将8克GSPE溶于100ml的50％的乙醇溶液（即基质），制成样品。
1.2 实验对象：实验招募10名志愿者，所有志愿者身体健康，没有接受任何医学治疗，既往没有皮肤病史、日光过敏史。所有的志愿者在试验结束后均获得一定的经济补偿。这项实验由空军总医院伦理委员会批准。
1.3 实验设计：志愿者需要5次就诊。第一天按25％六孔递增法在每位健康志愿者的臀部测定其初始最小红斑量（minimal erythema dose，MED）值。
第二天读取最小红斑量的数值，其中出现边界清楚的红斑所需要的能量即为最小红斑量。在志愿者的背部分别测定为7cm×3cm大小的四处皮肤并做相应标记，分别作为Group1(G1)、Group2(G2)、Group3(G3)、Group4(G4)，其中G1组不作任何处理；G2组连续三天单纯接受2倍MED0值日光模拟照射；G3组先外用基质处理，30min后接受2倍MED值日光模拟照射，连续3天均同样处理；G4组先外用含GSPE的样品，30min后接受2倍MED值日光模拟照射，连续三天。样品和基质的涂抹量为2μl/cm2。
第五天即最后一次照射24h后在四个标记部位的中心分别用3mm孔径的环钻钻取皮肤，用福尔马林液固定，石蜡包埋，切片于4度冰箱保存备用。
1.4 Fas基因和Bcl-2基因蛋白表达检测：取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5张，采用链霉素－生物素－过氧化物酶技术法进行免疫组化染色和AEC显色法。简单的说，石蜡切片经二甲苯和梯度酒精脱水，用PBS冲洗三次，每次5min。3%过氧化氢酶阻断以消除非特异性着色，室温下孵育10min。加特异性第一抗体后放置4℃冰箱过夜，用PBS洗涤三次，每次5min。链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶在室温下孵育10min，用PBS洗涤三次，每次5min，AEC室温8～20min显色，然后用自来水冲洗，苏木素复染，中性封片剂封片。参照Bresalier法[1]，在每张切片上随机观察10个高倍视野，根据每个视野中细胞的染色特征进行计分，未着色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。取其平均值作为整张切片的染色强度评分。
1.5统计学处理：采用SPSS软件进行统计学分析，组间均数比较采用q检验进行，P＜0.05为差异有显著性。
2结果
皮肤组织中Fas基因和Bcl-2基因的蛋白表达
2.1G1组仅可见极少数散在的Fas蛋白阳性染色细胞；G2组和G3组可见较多的Fas蛋白阳性染色细胞；G4组Fas蛋白阳性染色细胞明显减少。
2.2G1组可见较强的的Bcl-2蛋白阳性染色；G2组和G3组可见Bcl-2蛋白阳性染色明显减弱；G4组Bcl-2蛋白阳性染色细胞较前增多，与G1组Bcl-2蛋白阳性染色细胞数目近似。
具体结果图1、图2和表1。
3讨论
短期较强的紫外线照射通常导致皮肤急性光损伤，可明显增加皮肤组织中活性氧自由基的生成，产生过多的氧自由基与细胞内的结构相互作用而造成细胞DNA的损伤，皮肤角质形成细胞出现凋亡。Fas蛋白是存在于细胞表面的一种膜蛋白，为Fas基因的产物，是一种凋亡细胞受体，其活化后可导致细胞在数小时内凋亡[2]，在启动急性光损伤所致的角质形成细胞凋亡中被认为具有极其重要的意义。Bcl-2基因被称为“存活基因”，由Bcl-2基因编码的Bcl-2蛋白位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上[3]，Carson[4]发现Bcl-2蛋白能调节细胞稳态及抑制线粒体中细胞色素C的释放等作用，阻断引起凋亡的最后共同通路，有阻止细胞凋亡的能力。本实验发现，接受2MED紫外线照射后，Fas蛋白表达积分明显升高，而Bcl-2蛋白表达积分明显减少，说明在日晒后皮肤损伤的早期就可能出现了凋亡。
近年来天然抗氧化植物在光损伤及光防护、治疗上受到国内外广泛的关注[5-7]。研究发现一些植物如绿茶、大豆、海藻及部分果实提取物如石榴等抗氧化物质能够对紫外线引起的光损伤引起的角质形成细胞凋亡具有较好的防护及治疗作用。以往研究同样证明，GSPE具有强效的抗氧化作用，在其抗氧化能力是维生素C及维生素E的数十倍[8]，有研究表明GSPE能够对心肌灌注损伤的Fas基因表达上调，Bcl-2基因表达下调，但尚无紫外光损伤方面的实验。本研究结果显示，外用GSPE后再接受2MED紫外线照射的皮肤与单纯接受2MED紫外线照射的皮肤对比，皮肤中Fas蛋白表达积分显著减少，而Bcl-2蛋白表达积分显著增加，在一定程度上说明了GSPE对急性光损伤所致的角质形成细胞凋亡具有防护作用，但是GSPE是否单纯通过此条途径抑制凋亡，尚有待进一步研究。
[参考文献]
[1]Bresalier RS, Ho SB, Schoeppner HI, et al. Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis[J]. Gastroenterology,1996,110: 1354-1367.
[2]Suda T, Takahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas Ligand, a novel member of tumor necrosis factor family[J]. Cell, 1993, 75:1169-1178.
[3]Chen-Levy Z, Cleary ML. Membrane topology of the Bcl-2protooncogenic protein demonstrated in vitro[J]. J Biol Chem,1990,265: 4929-4933.
[4]Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease[J]. Lancet,1993,341: 1251-1254.
[5]Lee BC， Lee SY, leeHJ, et al. Anti-oxidative and photo-protective effects of coumarins isolated from Fraxinus chinensis[J]. Arch Pharm Res, 2007，30（10）：1293-301.
[6]Sevin A, Oztas P, Senen D,et al. Effects of polyphenols on skin damage due to ultraviolet A rays: an experimental study on rats[J]. J Eur Acad dermatol Venereol, 2007，21（5）： 650-656.
[7]Rout S, Banerjee RFree radical scavenging, anti-glycation and tyrosinase inhibition properties of a polysaccharide fraction isolated from the rind from Punica granatum[J]. Bioresour Technol, 2007,98（16）：3159-3163.
[8] Bagchi D, Garg A, Krohn RL, et al. Oxygen free radicals scavenging abilities of Vitamin C and E, and a grape seed proanthocyanidin extract in human vivo[J]. Res Commun Pathol Pharmacol, 1997, 95:179-189.
[收稿日期]2007-12-18[修回日期]2008-03-04
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”