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摘要 [目的]为评价内生真菌D202的生防价值以及生理学特性。[方法]通过对峙培养和非挥发性代谢产物抑菌实验，测定生防内生真菌D202对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的抑制作用，并且对其生理学学特性进行了研究。[结果]拮抗试验中D202对丝核菌的抑制率为67.25%，相对抑制效果为3.54，其非挥发性代谢产物对丝核菌的抑制率为72.35%，菌株D202及其代谢产物可有效抑制立枯丝核菌的生长；内生菌株D202生长最适碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，在温度为25℃、培养基pH为7时菌落生长最好。[结论]筛选得到的生防内生菌D202具有开发生物源杀菌剂的潜力。
关键词 深色有隔内生真菌；生防内生菌；立枯丝核菌；抑制作用；生物学特性
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）27-09274-02
Inhibiting Effect of Dark Septate Endophyte Fungi D202 on Rhizoctonia solani and Its Physiological Characteristics
SONG Xiaoshuang1， DENG Xun2， YU Wenjing1， SONG Ruiqing2* et al
（1.Heilongjiang Forestry Protect Institute， Harbin， Heilongjiang 150040； 2.Northeast Forestry University， Harbin Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the biocontrol ability and physiological characterisitics of endophyte strain D202. [Method]Dark septate endophyte fungi D202 was evaluated against R. solani in confront culture and through production of nonvolatile inhibitors， and the physiological characteristics of D202 were researched by growth rate method. [Result] In the dual culture， D202 could inhibit the growth of R.solani effectively， the inhibition rate was 67.25%， and relative inhibit rate was 3.54. The nonvolatile antibiotics inhibited the growth of R.solani effectively， and the inhibit rate was 72.35%. Strain D202 could grow well in PDA media whose pH was 7.0. The optimum carbon sources for D202 growing were glucose， and the optimum nitrogen sources were peptone， and the optimum temperature for growing was 25 ℃.[Conclusion]Endophyte D202 had the potential to develop biocontrol agents.
Key words Dark septate endophyte fungi； Biological controls endophytes； Rhizoctonia solani； Inhibiting effect； Physiological characteristics
随着化学药剂的过度使用，土壤微生态环境被破坏，苗木长势不良以及有害生物的抗药性等问题日益突出，环境和谐性病虫害防控技术日益受到重视。同时，农副产品的绿色健康已成为关注的焦点，因此现代农林业的发展要求减少化学药剂的使用，发展以生物防治为核心内容的生态控制技术。在当前提倡的土壤保健和植物保健技术等土壤生物修复和生态调控理念中，通过引入植物根际有益微生物和生防菌株，可以改善土壤环境，促进苗木生长，提高植物抗逆性[1]。因此，筛选高效菌株，开发生物源的生防菌剂日益受到人们的关注。
深色有隔内生真菌（DSE）是植物根部的内生菌。在高寒、干旱、污染土壤以及盐碱环境等极端和逆境环境下，它均可与宿主植物形成互惠的共生关系[2]，在促进植物生长、改善矿物质吸收、病害生物防治、提高植物抗逆性等方面作用显著[3-4]。在病害防治方面，DSE真菌可以在宿主根系定殖，并且有效抑制土传病害的发生，在防治白菜根肿病[5-6]和番茄枯萎病上[7]均取得实际的控制效果。此外，通过诱导植物抗性，对叶部病害也有一定的预防作用。深色有隔内生真菌D202是从针叶树根部分离得到的内生真菌。通过形态鉴定和ITS测序，它属于Phialocephala fortinii s.l.Acephala applanata species complex （PAC），为典型的植物根部深色有隔内生真菌。在前期筛选中，它对立枯丝核菌具有强烈的抑制作用，具有开发生防菌的潜力。笔者通过平板对峙培养和发酵液抑菌试验，测定了D202菌株对立枯丝核菌的抑制作用，并且对其生物学特性进行研究，为进一步研究其抑菌机理和田间应用奠定基础。 1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试深色有隔内生真菌D202（Phialocephala fortinii）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）SH均保存于东北林业大学森林微生物实验室。
1.2 深色有隔内生真菌D202对立枯丝核菌的抑制作用研究
采用平板对峙培养法[8]，测定菌株D202对立枯丝核菌的拮抗作用。由于生长速度差异，采用先内生真菌后丝核菌的错时培养方培进行拮抗试验，测量菌落半径，计算抑制率、相对抑制效果。每个处理3次重复。
抑制率（%）=[（对照菌落半径-对峙培养菌落半径）/对照菌落半径]×100%
相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率
采用菌丝生长抑制法[9]，测定菌株D202非挥发性代谢产物对四核菌生长的抑制作用，过滤，收集发酵液后，添加到PDA培养基中，培养丝核菌，采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算菌株D202代谢产物中抑菌活性成分对病原菌生长的抑制率。每个处理3次重复。
抑制率（%）=[（对照菌落半径-抑制培养菌落半径）/对照菌落半径]×100%
1.3 深色有隔内生真菌D202生理学特性研究
1.3.1 不同温度对菌丝生长的影响。将D202菌落接种到PDA培养基上，分别在10、15、20、25、30、35 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
1.3.2 不同碳源对菌丝生长的影响。碳源培养基配方改良PDA培养基，将不同碳源包括甘露醇、 蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖替代葡萄糖，制备不同碳源培养基碳源添加量为20 g/L，接种菌株D202后，置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
1.3.3 不同氮源对菌丝生长的影响。氮源培养基为改良PDA中添加2 g氮源。供试氮源包括甘氨酸、硝酸钙、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、酒石酸铵、硝酸铵，制备不同氮源培养基，氮源添加量为2 g/L接种菌株D202后，置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
1.3.4 不同pH对菌丝生长的影响。用1 mol/L HCl和NaOH分别调节改良PDA培养基pH为5、6、7、8、9，制备不同pH的改良PDA培养基，接种菌株D202后置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
2 结果与分析
2.1 菌株D202对立枯丝核菌的抑制作用
在对峙培养中，菌株D202可以有效抑制丝核菌的生长（图1），2个菌落未形成拮抗线，但可以判断D202在PDA培养基上生长时代谢出抑菌活性成分，抑制丝核菌的生长，生防菌株的作用机理包括重寄生、竞争作用和代谢活性成分，而D202的抑菌机理主要可以代谢抑菌活性成分，D202对丝核菌的抑制率为67.25%，相对抑制效果3.54，在有效抑制丝核菌生长的同时，自身生长未受到明显抑制。菌株D202的非挥发性代谢产物具有强烈的抑制丝核菌生长的作用，其非挥发性代谢产物对丝核菌的抑制率为72.35%，D202非挥发性代谢产物的热稳定性较好，高温灭菌处理后抑菌率为50.15%，丝核菌在含有D202的非挥发性代谢产物的培养基上长势很弱，菌丝生长稀疏，气生菌丝较多。
2.2 深色有隔内生真菌D202生物学特性
2.2.1 温度对菌落生长的影响。由图2可知，菌株D202在 10～35 ℃范围内均可生长，生长的最佳温度范围20～30 ℃，可耐低温，菌株在25 ℃下培养生长速度最快，14 d后菌落直径达到5.24 cm，低于10 ℃和高于35 ℃时，菌落生长较慢。
2.2.2 碳源对菌落生长的影响。由图3可知，在所有供试碳源中，菌株D202均可生长，对葡萄糖、蔗糖和淀粉的利用率较高，在碳源为葡萄糖时菌落生长速度最快，培养14 d后菌落直径可达5.21 cm；横向比较，菌株D202对甘露醇、乳糖和半乳糖的利用率较低。
2.2.3 氮源对菌落生长的影响。由图4可知，不同氮源对菌株D202生长的影响较小。菌株可很好地利用各种有机氮和无机氮，对蛋白胨的利用率最高，培养14 d后菌落直径可达到5.18 cm。该菌株对氮源无特殊要求。在缺乏氮源的改良PDA培养基培养条件下，菌落依然生长良好。
2.2.4 pH对菌落生长的影响。由图5可知，在不同pH条件下，菌株D202均可生长。在中性偏酸条件下，菌丝生长迅速，菌落浓密旺盛，而偏碱性时菌株生长受到一定的抑制作用。在pH为7时，培养14 d后菌落直径可达5.19 cm，说明该菌株的生长环境偏酸，不喜好在偏碱性环境中生长。
拮抗试验中D202对丝核菌的抑制率为67.25%，相对抑制效果3.54，其非挥发性代谢产物对丝核菌的抑制率为72.35%。上述结果表明，菌株D202及其代谢产物可有效地抑制立枯丝核菌的生长，具有生防菌的开发价值。生理学特性研究结果表明，当内生菌株D202生长的碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，温度为25 ℃，培养基pH为7时，菌落生长最好。
参考文献
[1]
邓勋，宋小双，尹大川，等. 引进木霉菌株对药用植物刺五加和五味子苗木的抗病促生作用[J].吉林农业大学学报，2014，36（2）：164-170.
[2] 刘茂军，张兴涛，赵之伟.深色有隔内生真菌（DSE）研究进展[J].菌物学报，2009，28（6）： 888-894.
[3] JUMPPONEN A，TRAPPE J M.Dark septate endophytes： a review of facultative biotrophic rootcolonizing fungi[J].New Phytol，1998，140：295-310. [4] JUMPPONEN A.Dark septate endophytesare they mycorrhizal[J].Mycorrhiza，2001，11：207-211.
[5] NARISAWA K，USUKI F，HASHIBA T.Control of Verticillium yellows in Chinese cabbage by the dark septate endophytic fungus LtVB3 [J].Phytopathology，2004，94（5）： 412-418.
[6] NARISAWA K，HAMBLETON S，CURRAH R S.Heteroconium chaetospira，a dark septate root endophyte allied to the Herpotrichiellaceae （Chaetothyriales） obtained from some forest soil samples in Canada using bait plants [J].Mycoscience，2007，48（5）：274-281.
[7] ROCIO D，LINARES A，RGROSCH R.Effects of dark septate endophytes on tomato plant performance [J].Mycorrhiza，2011，21：413-422.
[8] MORTON D T，STROUBE N H.Antagonistic and stimulatory effects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology，1955，45：419-420.
[9] SUNIL C D，SURESH M，BIRENDRA S.Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f.sp.ciceris for integrated management of chickpea wilt [J].Biological Control，2007，40：118-127.
关键词 深色有隔内生真菌；生防内生菌；立枯丝核菌；抑制作用；生物学特性
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）27-09274-02
Inhibiting Effect of Dark Septate Endophyte Fungi D202 on Rhizoctonia solani and Its Physiological Characteristics
SONG Xiaoshuang1， DENG Xun2， YU Wenjing1， SONG Ruiqing2* et al
（1.Heilongjiang Forestry Protect Institute， Harbin， Heilongjiang 150040； 2.Northeast Forestry University， Harbin Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the biocontrol ability and physiological characterisitics of endophyte strain D202. [Method]Dark septate endophyte fungi D202 was evaluated against R. solani in confront culture and through production of nonvolatile inhibitors， and the physiological characteristics of D202 were researched by growth rate method. [Result] In the dual culture， D202 could inhibit the growth of R.solani effectively， the inhibition rate was 67.25%， and relative inhibit rate was 3.54. The nonvolatile antibiotics inhibited the growth of R.solani effectively， and the inhibit rate was 72.35%. Strain D202 could grow well in PDA media whose pH was 7.0. The optimum carbon sources for D202 growing were glucose， and the optimum nitrogen sources were peptone， and the optimum temperature for growing was 25 ℃.[Conclusion]Endophyte D202 had the potential to develop biocontrol agents.
Key words Dark septate endophyte fungi； Biological controls endophytes； Rhizoctonia solani； Inhibiting effect； Physiological characteristics
随着化学药剂的过度使用，土壤微生态环境被破坏，苗木长势不良以及有害生物的抗药性等问题日益突出，环境和谐性病虫害防控技术日益受到重视。同时，农副产品的绿色健康已成为关注的焦点，因此现代农林业的发展要求减少化学药剂的使用，发展以生物防治为核心内容的生态控制技术。在当前提倡的土壤保健和植物保健技术等土壤生物修复和生态调控理念中，通过引入植物根际有益微生物和生防菌株，可以改善土壤环境，促进苗木生长，提高植物抗逆性[1]。因此，筛选高效菌株，开发生物源的生防菌剂日益受到人们的关注。
深色有隔内生真菌（DSE）是植物根部的内生菌。在高寒、干旱、污染土壤以及盐碱环境等极端和逆境环境下，它均可与宿主植物形成互惠的共生关系[2]，在促进植物生长、改善矿物质吸收、病害生物防治、提高植物抗逆性等方面作用显著[3-4]。在病害防治方面，DSE真菌可以在宿主根系定殖，并且有效抑制土传病害的发生，在防治白菜根肿病[5-6]和番茄枯萎病上[7]均取得实际的控制效果。此外，通过诱导植物抗性，对叶部病害也有一定的预防作用。深色有隔内生真菌D202是从针叶树根部分离得到的内生真菌。通过形态鉴定和ITS测序，它属于Phialocephala fortinii s.l.Acephala applanata species complex （PAC），为典型的植物根部深色有隔内生真菌。在前期筛选中，它对立枯丝核菌具有强烈的抑制作用，具有开发生防菌的潜力。笔者通过平板对峙培养和发酵液抑菌试验，测定了D202菌株对立枯丝核菌的抑制作用，并且对其生物学特性进行研究，为进一步研究其抑菌机理和田间应用奠定基础。 1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试深色有隔内生真菌D202（Phialocephala fortinii）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）SH均保存于东北林业大学森林微生物实验室。
1.2 深色有隔内生真菌D202对立枯丝核菌的抑制作用研究
采用平板对峙培养法[8]，测定菌株D202对立枯丝核菌的拮抗作用。由于生长速度差异，采用先内生真菌后丝核菌的错时培养方培进行拮抗试验，测量菌落半径，计算抑制率、相对抑制效果。每个处理3次重复。
抑制率（%）=[（对照菌落半径-对峙培养菌落半径）/对照菌落半径]×100%
相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率
采用菌丝生长抑制法[9]，测定菌株D202非挥发性代谢产物对四核菌生长的抑制作用，过滤，收集发酵液后，添加到PDA培养基中，培养丝核菌，采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算菌株D202代谢产物中抑菌活性成分对病原菌生长的抑制率。每个处理3次重复。
抑制率（%）=[（对照菌落半径-抑制培养菌落半径）/对照菌落半径]×100%
1.3 深色有隔内生真菌D202生理学特性研究
1.3.1 不同温度对菌丝生长的影响。将D202菌落接种到PDA培养基上，分别在10、15、20、25、30、35 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
1.3.2 不同碳源对菌丝生长的影响。碳源培养基配方改良PDA培养基，将不同碳源包括甘露醇、 蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖替代葡萄糖，制备不同碳源培养基碳源添加量为20 g/L，接种菌株D202后，置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
1.3.3 不同氮源对菌丝生长的影响。氮源培养基为改良PDA中添加2 g氮源。供试氮源包括甘氨酸、硝酸钙、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、酒石酸铵、硝酸铵，制备不同氮源培养基，氮源添加量为2 g/L接种菌株D202后，置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
1.3.4 不同pH对菌丝生长的影响。用1 mol/L HCl和NaOH分别调节改良PDA培养基pH为5、6、7、8、9，制备不同pH的改良PDA培养基，接种菌株D202后置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养14 d后，采用十字交叉法测定菌落直径。每个处理3次重复。
2 结果与分析
2.1 菌株D202对立枯丝核菌的抑制作用
在对峙培养中，菌株D202可以有效抑制丝核菌的生长（图1），2个菌落未形成拮抗线，但可以判断D202在PDA培养基上生长时代谢出抑菌活性成分，抑制丝核菌的生长，生防菌株的作用机理包括重寄生、竞争作用和代谢活性成分，而D202的抑菌机理主要可以代谢抑菌活性成分，D202对丝核菌的抑制率为67.25%，相对抑制效果3.54，在有效抑制丝核菌生长的同时，自身生长未受到明显抑制。菌株D202的非挥发性代谢产物具有强烈的抑制丝核菌生长的作用，其非挥发性代谢产物对丝核菌的抑制率为72.35%，D202非挥发性代谢产物的热稳定性较好，高温灭菌处理后抑菌率为50.15%，丝核菌在含有D202的非挥发性代谢产物的培养基上长势很弱，菌丝生长稀疏，气生菌丝较多。
2.2 深色有隔内生真菌D202生物学特性
2.2.1 温度对菌落生长的影响。由图2可知，菌株D202在 10～35 ℃范围内均可生长，生长的最佳温度范围20～30 ℃，可耐低温，菌株在25 ℃下培养生长速度最快，14 d后菌落直径达到5.24 cm，低于10 ℃和高于35 ℃时，菌落生长较慢。
2.2.2 碳源对菌落生长的影响。由图3可知，在所有供试碳源中，菌株D202均可生长，对葡萄糖、蔗糖和淀粉的利用率较高，在碳源为葡萄糖时菌落生长速度最快，培养14 d后菌落直径可达5.21 cm；横向比较，菌株D202对甘露醇、乳糖和半乳糖的利用率较低。
2.2.3 氮源对菌落生长的影响。由图4可知，不同氮源对菌株D202生长的影响较小。菌株可很好地利用各种有机氮和无机氮，对蛋白胨的利用率最高，培养14 d后菌落直径可达到5.18 cm。该菌株对氮源无特殊要求。在缺乏氮源的改良PDA培养基培养条件下，菌落依然生长良好。
2.2.4 pH对菌落生长的影响。由图5可知，在不同pH条件下，菌株D202均可生长。在中性偏酸条件下，菌丝生长迅速，菌落浓密旺盛，而偏碱性时菌株生长受到一定的抑制作用。在pH为7时，培养14 d后菌落直径可达5.19 cm，说明该菌株的生长环境偏酸，不喜好在偏碱性环境中生长。
拮抗试验中D202对丝核菌的抑制率为67.25%，相对抑制效果3.54，其非挥发性代谢产物对丝核菌的抑制率为72.35%。上述结果表明，菌株D202及其代谢产物可有效地抑制立枯丝核菌的生长，具有生防菌的开发价值。生理学特性研究结果表明，当内生菌株D202生长的碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，温度为25 ℃，培养基pH为7时，菌落生长最好。
参考文献
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邓勋，宋小双，尹大川，等. 引进木霉菌株对药用植物刺五加和五味子苗木的抗病促生作用[J].吉林农业大学学报，2014，36（2）：164-170.
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[7] ROCIO D，LINARES A，RGROSCH R.Effects of dark septate endophytes on tomato plant performance [J].Mycorrhiza，2011，21：413-422.
[8] MORTON D T，STROUBE N H.Antagonistic and stimulatory effects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology，1955，45：419-420.
[9] SUNIL C D，SURESH M，BIRENDRA S.Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f.sp.ciceris for integrated management of chickpea wilt [J].Biological Control，2007，40：118-127.