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摘 要 本研究对瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coquillett的性别决定基因tra-2的cDNA序列进行了克隆和分析。根据转录组数据库及序列同源性分析，分别克隆并获得瓜实蝇雌雄成虫tra-2的基因片段，利用生物信息软件对所得序列进行分析；采用qPCR技术，研究该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达情况。研究结果表明，瓜实蝇tra-2基因的cDNA序列共1 450 bp，无性别特异性，含753 bp的开放阅读框，共编码250个氨基酸。该基因在瓜实蝇不同发育阶段均有不同的表达量，瓜实蝇tra-2基因具有母体遗傳表达特性，在胚胎期的表达量较高，雌成虫表达量显著高于雄成虫。
关键词 瓜实蝇；性别决定；tra-2；qPCR
中图分类号 S433 文献标识码 A
Abstract In this paper， the sex determination gene tra-2 cDNA sequence of B. cucurbitae Coquillett was cloned and analyzed. According to the transcriptome database and sequence homology analysis， the male and female tra-2 gene fragments of the B. cucurbitae were cloned and analyzed by bioinformatics software. The qPCR technique was used to study the effects of different development stage of the expression of the situation. The results showed that the cDNA sequence of tra-2 gene of B. cucurbitae was 1 450 bp in length， without sex-specific transtript. The open reading frame of tra-2 was 753 bp in length， which encoding a polypeptide of 250 amino acids. tra-2 gene of B. cucurbitae had different expression levels in different developmental stages. It had maternal genetic effects with high expression in the embryonic period， and female adult expressed significantly more than male adult.
Key words melon fly； sex determination； tra-2； qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.020
瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coquillett，属双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，为中国进境植物检疫性有害生物[1]，属于钻蛀性害虫，危害葫芦科、茄科以及番木瓜、番石榴等120多种蔬菜和水果[2-7]，已在我国广东、广西、海南等地造成严重危害[5， 7-11]。瓜实蝇繁殖能力强，一年发生多代，世代重叠，以蛹或成虫越冬[12]，严重危害到各类果蔬的种植与生产[13-15]。
昆虫种类繁多，其性别决定机制复杂多样，了解昆虫的性别决定机制，有助于理解昆虫性别分化调控的过程，为人类有效控制害虫、高效利用益虫提供新的方向。昆虫的性别决定机制分为环境性别决定和遗传性别决定，目前环境性别决定的分子研究还较少，而对遗传性别决定的研究很多。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，性别决定是一个遗传级联式过程，主要涉及性染色体初始信号原件、sxl、tra、tra-2、dsx等基因[16-17]。明确昆虫的性别调控机制，结合RNAi技术，可人为调控昆虫的性别发育方向，用于昆虫不育技术的研究[18]。
本研究利用基因克隆技术，得到瓜实蝇性别决定基因tra-2的全长序列，并对氨基酸序列进行分析，利用荧光定量qPCR技术对该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达量进行了分析，为该基因日后的功能研究及释放携带显性致死基因的技术研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试昆虫：瓜实蝇为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所入侵害虫课题组提供。成虫与幼虫均以人工饲料饲养，饲养条件为（27±0.5）℃，RH （50±5）%，光周期为14L ： 10D。
试剂：TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、TransScript?Tip Green qPCR SuperMix等均购于北京全式金生物有限公司，Gel Exteaction Kit、Gel Mini Kit购于美国Omega Bio-Tek，无水乙醇购于西陇科学，三氯甲烷购于广州化学试剂厂，甘油购于Solarbio。
仪器：Centrifuge 5810R台式冷冻高速离心机、Thermo Scientific PCR仪、Thermo Scientific（Nanodrop 2000c）超微量紫外分光光度计、Applied Biosystems QuantStudio 6荧光定量PCR仪。 1.2 方法
1.2.1 瓜实蝇tra-2基因的克隆 分别选取单头1日龄雌雄成虫，使用TransZol Up Plus RNA Kit分别提取样本的总RNA，每个样品取4 μg合格的总RNA，按照TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书反转录获得cDNA。
根据已有的转录组数据库以及同源比对的结果，使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线设计引物242F/653R來扩增瓜实蝇tra-2中间片段。PCR反应体系50 μL，其中包含：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，10×TransTaq? HiFi BufferⅡ 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq? HiFi DNA Polymerase 1 μL，加ddH2O至50 μL。反应程序为94℃预变性3 min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于1.5%的琼脂糖中进行恒压电泳检测并用Gel Exteaction Kit试剂盒割胶回收，回收片段使用pEASY?-T1 Cloning Kit试剂盒进行克隆转化，涂板后隔日进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落鉴定阳性克隆，选取有目的条带的菌落送至南京金斯瑞公司测序。
构建5’-RACE Ready cDNA 和3’ -RACE Ready cDNA文库，按照SMARTer? RACE cDNA amplification Kit（Clontech）的说明书操作，以5’RACE Ready cDNA为模板扩增5’端UTR，以3’RACE Ready cDNA为模板扩增3’端UTR，PCR反应体系25 μL：Ex Taq HS 12.5 μL，5’/3’RACE Ready cDNA 1 μL，20 μmol/L 5’/3’RACE 引物1 μL，UPM 2.5 μL，加ddH2O至25 μL。反应程序为：95 ℃，预变性3min；94℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物进行割胶回收并克隆转化测序，步骤同上。
1.2.2 序列分析和分子进化树构建 采用ORF Finder预测开放阅读框；利用NCBI网站的BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行蛋白同源性比较分析；使用DNAMAN 6.0软件分析蛋白质的等电位点、分子量以及跨膜结构域；利用MEGA 7.0软件进行多重序列比对，并以邻接法构建系统进化树，bootstrap法评估结果可信度（1 000次重复）。
1.2.3 qPCR分析tra-2基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达情况 分别收集瓜实蝇不同卵龄期（0～2 h，2～4 h，4～8 h，8～12 h，12～24 h）的卵各100枚、1龄虫20头、2龄虫10头、3龄虫10头、老龄虫5头、1日龄蛹5头、1日龄雌虫1头、1日龄雄虫1头。其中，瓜实蝇幼虫分龄参照李子玲等[19]的研究结果，老龄虫为跳入沙中但未化蛹的幼虫。提取总RNA后反转录为cDNA，方法同1.2.1。qPCR反应体系为20 μL：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×TransStart? Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×），加dd H2O至20 μL。反应程序为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。并设置溶解曲线温度变化。设置3个生物学重复，3个技术重复，并以1日龄雄成虫的表达量作为1，再选取RP L32为内参基因，用2-△△Ct法计算相对表达量做柱状图，用SPSS软件做方差分析及邓肯检验（0.05）。
2 结果与分析
2.1 瓜实蝇tra-2基因的克隆和序列分析
以瓜实蝇1日龄雌、雄成虫为模板，242F/653R扩增瓜实蝇雌雄成虫tra-2中间片段，均获得一致的431 bp基因片段（图1）。经过Blast分析，发现其与扎氏果实蝇（Bactrocera jarvisi）tra-2基因的相似度为90%，推断该片段为瓜实蝇tra-2基因的片段。通过RACE技术扩增得到瓜实蝇雌雄虫tra-2的cDNA全长序列均为1 450 bp，将雌雄虫片段进行比对，发现其无性别特异性。瓜实蝇tra-2基因片段1 450 bp，开放阅读框753 bp，共编码250个氨基酸，分子量为29 526，等电点为12，无跨膜结构域。
2.2 瓜实蝇tra-2基因氨基酸列分析和进化树构建
将瓜实蝇tra-2基因的氨基酸序列与同科的其他昆虫的tra-2基因编码产物做了多重比对，如图2。瓜实蝇tra-2具有RRM（RNA Recognition Motif）高度的保守功能区以及位于两端的RS domain（Arginine /Serine rich domain），推测tra-2可与其他蛋白结合发挥其功能。所有物种的氨基酸差异主要在RS区，RRM具有相同的氨基酸数目。
为了了解瓜实蝇tra-2基因与其他昆虫的进化关系，构建了tra-2氨基酸序列进化树（图3）。氨基酸进化树结果表明，在离腹寡毛果实蝇属中，瓜实蝇tra-2氨基酸序列与桔小实蝇、昆士兰实蝇、扎氏果实蝇、番石榴实蝇聚为一支。
2.3 瓜实蝇tra-2的表达分析
以瓜实蝇1日龄雄成虫为对照，以RP L32为内参基因，采用荧光定量qPCR技术对瓜实蝇的tra-2基因在不同发育时期的表达情况进行分析，结果如图4。结果表明，tra-2在瓜实蝇的不同发育阶段均有表达，在胚胎期，早期胚胎表达量最高，晚期胚胎表达量最低；在幼虫期，表达量随着幼虫的发育时间而增加，在老龄虫时表达量最高；雌雄1日龄成虫中，雌虫表达量显著高于雄虫表达量。 3 讨论
本研究使用PCR技术和RACE技术，克隆获得瓜实蝇tra-2的cDNA序列。瓜实蝇tra-2基因无性别特异性，cDNA序列长1 450 bp，开放阅读框753 bp，共编码250个氨基酸，含高度保守区域RRM及两端的RS区域。
进化树分析显示，瓜实蝇tra-2氨基酸序列与桔小实蝇、昆士兰实蝇（B. tryoni）、扎氏果实蝇（B. jarvisi）、番石榴实蝇等同属的其他实蝇聚为一大支，说明tra-2基因的功能可能跟同属的昆虫相似，性别决定机制可能也相同。
qPCR结果表明，tra-2在瓜实蝇的不同发育阶段均有表达，在胚胎期，早期胚胎表达量最高，晚期胚胎表达量最低；在幼虫期，表达量随着幼虫的发育时间而增加，在老龄虫时表达量最高；雌雄1日龄成虫中，雌虫表达量远高于雄虫表达量。
tra-2基因是性别决定通路上的基因，与tra相互结合作用于dsx基因，从而控制雌雄分化[20， 21]。tra-2基因由RNA识别结构域RRM及两端的两个多精氨酸/丝氨酸RS共3个区域构成。在真核生物中，RRM结构域一般含有两个高度保守的短结构域：RNP（Ribonucleoprotein）和RBD（RNA binding Domains），在转录后基因表达调控中起作用[22]。“RS+RRM+RS”的结构为RNA结合蛋白的典型特征，说明其可能具有RNA剪接的功能。在黑腹果蝇（D. melanogaster）中，tra-2具有4种不同的剪接体，其中2种为雌雄虫共有，2种为雄虫特有，而在蜜蜂（A. mellifera）[23]、赤拟谷盗（T. castaneum）[24]和烟粉虱（Bemisia tabaci）[25] 中，tra-2基因随具有多个剪接体，但并不具备性别特异性，但在桔小实蝇（B. dorsalis）[26]、铜绿蝇（Lucilia cuprina）[27] 、加勒比按实蝇（Anastrepha suspensa）[28] 、番石榴实蝇（B. correcta）[29] 、地中海实蝇（Ceratitis capitata）[30]、家蝇（Musca domestica）[31]、西印度按实蝇（A. obliqua）[32]等均只检测到一个剪接体，未检测到性别特异的剪接体，在本文的瓜实蝇中，也只检测到一个剪接体，因此，可以推测，瓜实蝇tra-2基因可能与桔小实蝇、铜绿蝇等只有一个剪接体的昆虫具有相同或相似的功能。已有研究表明，在黑腹果蝇中，tra-2对调控dsx雌性特异剪接和雄虫不育具有重要作用[33]。在按实蝇、地中海实蝇等昆虫中，tra-2与tra形成复合体，既与下游基因dsx雌性特异外显子结合，调控dsx的剪接；又能与tra雄性特异外显子结合，抑制tra雄性外显子的剪接翻译[30，32]。
在胚胎早期，瓜实蝇tra-2即有较高的表达量，表明其可能具有母体遗传表达特性，这与桔小实蝇[26]相一致。有研究发现，tra-2不仅能影响体细胞的性别分化，还能影响生殖细胞的功能，其次，RS结构还对下游基因的选择性剪切有影响[34-35]。在果蝇的性别决定研究中，通过tra和tra-2的协同作用，调节果蝇性别决定基因dsx的表达，从而调控果蝇性别分化末端靶基因的活性，产生性别分化[36-39]；在果蝇的发育研究中，dsx的复合基因座在幼虫晚期会产生雌雄特异性产物[40]，而dsx基因的表达由上游tra-tra-2复合体控制，因此推测，dsx基因与tra-2基因均可能在幼虫晚期有较高的表达量，此推测与本文的结果相符合。
本文通过PCR技术、RACE技术、qPCR技术，获得了瓜实蝇性别决定基因tra-2的全长序列，明确了该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达量。后期可结合基因调控如RNAi、基因敲除等技术，从分子层面上阐述昆虫性别分化的机制，构建显性特异致死品系，能在研究的早期分离雌雄虫，减少不必要的饲料、人工投入，为SIT技术提供大量的雄性虫源。
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关键词 瓜实蝇；性别决定；tra-2；qPCR
中图分类号 S433 文献标识码 A
Abstract In this paper， the sex determination gene tra-2 cDNA sequence of B. cucurbitae Coquillett was cloned and analyzed. According to the transcriptome database and sequence homology analysis， the male and female tra-2 gene fragments of the B. cucurbitae were cloned and analyzed by bioinformatics software. The qPCR technique was used to study the effects of different development stage of the expression of the situation. The results showed that the cDNA sequence of tra-2 gene of B. cucurbitae was 1 450 bp in length， without sex-specific transtript. The open reading frame of tra-2 was 753 bp in length， which encoding a polypeptide of 250 amino acids. tra-2 gene of B. cucurbitae had different expression levels in different developmental stages. It had maternal genetic effects with high expression in the embryonic period， and female adult expressed significantly more than male adult.
Key words melon fly； sex determination； tra-2； qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.020
瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coquillett，属双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，为中国进境植物检疫性有害生物[1]，属于钻蛀性害虫，危害葫芦科、茄科以及番木瓜、番石榴等120多种蔬菜和水果[2-7]，已在我国广东、广西、海南等地造成严重危害[5， 7-11]。瓜实蝇繁殖能力强，一年发生多代，世代重叠，以蛹或成虫越冬[12]，严重危害到各类果蔬的种植与生产[13-15]。
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本研究利用基因克隆技术，得到瓜实蝇性别决定基因tra-2的全长序列，并对氨基酸序列进行分析，利用荧光定量qPCR技术对该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达量进行了分析，为该基因日后的功能研究及释放携带显性致死基因的技术研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试昆虫：瓜实蝇为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所入侵害虫课题组提供。成虫与幼虫均以人工饲料饲养，饲养条件为（27±0.5）℃，RH （50±5）%，光周期为14L ： 10D。
试剂：TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、TransScript?Tip Green qPCR SuperMix等均购于北京全式金生物有限公司，Gel Exteaction Kit、Gel Mini Kit购于美国Omega Bio-Tek，无水乙醇购于西陇科学，三氯甲烷购于广州化学试剂厂，甘油购于Solarbio。
仪器：Centrifuge 5810R台式冷冻高速离心机、Thermo Scientific PCR仪、Thermo Scientific（Nanodrop 2000c）超微量紫外分光光度计、Applied Biosystems QuantStudio 6荧光定量PCR仪。 1.2 方法
1.2.1 瓜实蝇tra-2基因的克隆 分别选取单头1日龄雌雄成虫，使用TransZol Up Plus RNA Kit分别提取样本的总RNA，每个样品取4 μg合格的总RNA，按照TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书反转录获得cDNA。
根据已有的转录组数据库以及同源比对的结果，使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线设计引物242F/653R來扩增瓜实蝇tra-2中间片段。PCR反应体系50 μL，其中包含：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，10×TransTaq? HiFi BufferⅡ 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq? HiFi DNA Polymerase 1 μL，加ddH2O至50 μL。反应程序为94℃预变性3 min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于1.5%的琼脂糖中进行恒压电泳检测并用Gel Exteaction Kit试剂盒割胶回收，回收片段使用pEASY?-T1 Cloning Kit试剂盒进行克隆转化，涂板后隔日进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落鉴定阳性克隆，选取有目的条带的菌落送至南京金斯瑞公司测序。
构建5’-RACE Ready cDNA 和3’ -RACE Ready cDNA文库，按照SMARTer? RACE cDNA amplification Kit（Clontech）的说明书操作，以5’RACE Ready cDNA为模板扩增5’端UTR，以3’RACE Ready cDNA为模板扩增3’端UTR，PCR反应体系25 μL：Ex Taq HS 12.5 μL，5’/3’RACE Ready cDNA 1 μL，20 μmol/L 5’/3’RACE 引物1 μL，UPM 2.5 μL，加ddH2O至25 μL。反应程序为：95 ℃，预变性3min；94℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物进行割胶回收并克隆转化测序，步骤同上。
1.2.2 序列分析和分子进化树构建 采用ORF Finder预测开放阅读框；利用NCBI网站的BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行蛋白同源性比较分析；使用DNAMAN 6.0软件分析蛋白质的等电位点、分子量以及跨膜结构域；利用MEGA 7.0软件进行多重序列比对，并以邻接法构建系统进化树，bootstrap法评估结果可信度（1 000次重复）。
1.2.3 qPCR分析tra-2基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达情况 分别收集瓜实蝇不同卵龄期（0～2 h，2～4 h，4～8 h，8～12 h，12～24 h）的卵各100枚、1龄虫20头、2龄虫10头、3龄虫10头、老龄虫5头、1日龄蛹5头、1日龄雌虫1头、1日龄雄虫1头。其中，瓜实蝇幼虫分龄参照李子玲等[19]的研究结果，老龄虫为跳入沙中但未化蛹的幼虫。提取总RNA后反转录为cDNA，方法同1.2.1。qPCR反应体系为20 μL：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×TransStart? Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×），加dd H2O至20 μL。反应程序为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。并设置溶解曲线温度变化。设置3个生物学重复，3个技术重复，并以1日龄雄成虫的表达量作为1，再选取RP L32为内参基因，用2-△△Ct法计算相对表达量做柱状图，用SPSS软件做方差分析及邓肯检验（0.05）。
2 结果与分析
2.1 瓜实蝇tra-2基因的克隆和序列分析
以瓜实蝇1日龄雌、雄成虫为模板，242F/653R扩增瓜实蝇雌雄成虫tra-2中间片段，均获得一致的431 bp基因片段（图1）。经过Blast分析，发现其与扎氏果实蝇（Bactrocera jarvisi）tra-2基因的相似度为90%，推断该片段为瓜实蝇tra-2基因的片段。通过RACE技术扩增得到瓜实蝇雌雄虫tra-2的cDNA全长序列均为1 450 bp，将雌雄虫片段进行比对，发现其无性别特异性。瓜实蝇tra-2基因片段1 450 bp，开放阅读框753 bp，共编码250个氨基酸，分子量为29 526，等电点为12，无跨膜结构域。
2.2 瓜实蝇tra-2基因氨基酸列分析和进化树构建
将瓜实蝇tra-2基因的氨基酸序列与同科的其他昆虫的tra-2基因编码产物做了多重比对，如图2。瓜实蝇tra-2具有RRM（RNA Recognition Motif）高度的保守功能区以及位于两端的RS domain（Arginine /Serine rich domain），推测tra-2可与其他蛋白结合发挥其功能。所有物种的氨基酸差异主要在RS区，RRM具有相同的氨基酸数目。
为了了解瓜实蝇tra-2基因与其他昆虫的进化关系，构建了tra-2氨基酸序列进化树（图3）。氨基酸进化树结果表明，在离腹寡毛果实蝇属中，瓜实蝇tra-2氨基酸序列与桔小实蝇、昆士兰实蝇、扎氏果实蝇、番石榴实蝇聚为一支。
2.3 瓜实蝇tra-2的表达分析
以瓜实蝇1日龄雄成虫为对照，以RP L32为内参基因，采用荧光定量qPCR技术对瓜实蝇的tra-2基因在不同发育时期的表达情况进行分析，结果如图4。结果表明，tra-2在瓜实蝇的不同发育阶段均有表达，在胚胎期，早期胚胎表达量最高，晚期胚胎表达量最低；在幼虫期，表达量随着幼虫的发育时间而增加，在老龄虫时表达量最高；雌雄1日龄成虫中，雌虫表达量显著高于雄虫表达量。 3 讨论
本研究使用PCR技术和RACE技术，克隆获得瓜实蝇tra-2的cDNA序列。瓜实蝇tra-2基因无性别特异性，cDNA序列长1 450 bp，开放阅读框753 bp，共编码250个氨基酸，含高度保守区域RRM及两端的RS区域。
进化树分析显示，瓜实蝇tra-2氨基酸序列与桔小实蝇、昆士兰实蝇（B. tryoni）、扎氏果实蝇（B. jarvisi）、番石榴实蝇等同属的其他实蝇聚为一大支，说明tra-2基因的功能可能跟同属的昆虫相似，性别决定机制可能也相同。
qPCR结果表明，tra-2在瓜实蝇的不同发育阶段均有表达，在胚胎期，早期胚胎表达量最高，晚期胚胎表达量最低；在幼虫期，表达量随着幼虫的发育时间而增加，在老龄虫时表达量最高；雌雄1日龄成虫中，雌虫表达量远高于雄虫表达量。
tra-2基因是性别决定通路上的基因，与tra相互结合作用于dsx基因，从而控制雌雄分化[20， 21]。tra-2基因由RNA识别结构域RRM及两端的两个多精氨酸/丝氨酸RS共3个区域构成。在真核生物中，RRM结构域一般含有两个高度保守的短结构域：RNP（Ribonucleoprotein）和RBD（RNA binding Domains），在转录后基因表达调控中起作用[22]。“RS+RRM+RS”的结构为RNA结合蛋白的典型特征，说明其可能具有RNA剪接的功能。在黑腹果蝇（D. melanogaster）中，tra-2具有4种不同的剪接体，其中2种为雌雄虫共有，2种为雄虫特有，而在蜜蜂（A. mellifera）[23]、赤拟谷盗（T. castaneum）[24]和烟粉虱（Bemisia tabaci）[25] 中，tra-2基因随具有多个剪接体，但并不具备性别特异性，但在桔小实蝇（B. dorsalis）[26]、铜绿蝇（Lucilia cuprina）[27] 、加勒比按实蝇（Anastrepha suspensa）[28] 、番石榴实蝇（B. correcta）[29] 、地中海实蝇（Ceratitis capitata）[30]、家蝇（Musca domestica）[31]、西印度按实蝇（A. obliqua）[32]等均只检测到一个剪接体，未检测到性别特异的剪接体，在本文的瓜实蝇中，也只检测到一个剪接体，因此，可以推测，瓜实蝇tra-2基因可能与桔小实蝇、铜绿蝇等只有一个剪接体的昆虫具有相同或相似的功能。已有研究表明，在黑腹果蝇中，tra-2对调控dsx雌性特异剪接和雄虫不育具有重要作用[33]。在按实蝇、地中海实蝇等昆虫中，tra-2与tra形成复合体，既与下游基因dsx雌性特异外显子结合，调控dsx的剪接；又能与tra雄性特异外显子结合，抑制tra雄性外显子的剪接翻译[30，32]。
在胚胎早期，瓜实蝇tra-2即有较高的表达量，表明其可能具有母体遗传表达特性，这与桔小实蝇[26]相一致。有研究发现，tra-2不仅能影响体细胞的性别分化，还能影响生殖细胞的功能，其次，RS结构还对下游基因的选择性剪切有影响[34-35]。在果蝇的性别决定研究中，通过tra和tra-2的协同作用，调节果蝇性别决定基因dsx的表达，从而调控果蝇性别分化末端靶基因的活性，产生性别分化[36-39]；在果蝇的发育研究中，dsx的复合基因座在幼虫晚期会产生雌雄特异性产物[40]，而dsx基因的表达由上游tra-tra-2复合体控制，因此推测，dsx基因与tra-2基因均可能在幼虫晚期有较高的表达量，此推测与本文的结果相符合。
本文通过PCR技术、RACE技术、qPCR技术，获得了瓜实蝇性别决定基因tra-2的全长序列，明确了该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达量。后期可结合基因调控如RNAi、基因敲除等技术，从分子层面上阐述昆虫性别分化的机制，构建显性特异致死品系，能在研究的早期分离雌雄虫，减少不必要的饲料、人工投入，为SIT技术提供大量的雄性虫源。
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