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摘要：为研究槲寄生碱对人肝癌细胞株SMMC-7721对bcl-2mRNA表达的影响。采用半定量RT-PCR法测定bcl-2 mRNA表达变化。结果表明，RT-PCR检测SMMC-7721细胞中bc1-2、mRNA表达的相对强度，发现bc1-2mRNA的表达强度降低(P<0.05)。说明中药槲寄生碱抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖作用与降低bcl-2 mRNA表达水平有关。
关键词：槲寄生碱；bcl-2 mRNA；RT-PCR；人肝癌细胞SMMC-7721
中图分类号：R931.7文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2010.06.003
Effect of Mistletoe Alkali on Expression of bcl-2 mRNA in Human Hepatocarcinoma Cell SMMC-7721
KONG Fan-qing1, DING Hai-mai1,YANG Yan-hong2, GUO Mei-xiang2
(1.Baotou Medical College, Baotou, Neimenggu 014010, China; 2. The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou, Neimenggu 014010,China)
Abstract：This study was designed to investigate the expression of bcl-2 mRNA in Human Hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 tread with mistletoe alkali in vitro. Change of bcl-2 mRNA expression in human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721 was detected by Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Degression of bcl-2 mRNA expression(P<0.05) was detected by using RT-PC. Proliferation was inhibited by mistletoe alkali in SMMC-7721 cell line. Its mechanism was related to degression of bcl-2 mRNA expression.
Key words: mistletoe alkali; bcl-2 mRNA; reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR); human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721
槲寄生（Viscum coloratum(Kom.)Nakai）是一味传统中药，有祛风湿，补肝肾，强筋骨，养血、安胎等功效[1]。近年来，人们发现槲寄生有抗肿瘤作用，其抗肿瘤活性成分主要为槲寄生糖蛋白、毒肽、生物碱。对于槲寄生糖蛋白、毒肽的结构，抗肿瘤作用及机制的研究进展较快，欧洲槲寄生糖蛋白制剂已广泛用于临床并取得较好疗效。但对于槲寄生碱抗肿瘤的研究较少，其抗肿瘤作用的机理尚未见报道。本实验组已证实槲寄生碱对肝癌SMMC-7721细胞增殖有显著抑制作用, 且呈剂量和时间依赖性[2]。本试验选取浓度为0.1 mg·mL-1槲寄生碱液（抑制率为38%）作用于SMMC-7721细胞，观察其对bcl-2mRNA表达的影响。
1材料和方法
1.1材料
主要试剂和仪器：一步法RT-PCR试剂盒（BBI），胎牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640（GIBCO），Trizol试剂 、引物、琼脂糖（上海生工），Forma CO2培养箱（美国），Enpddorf低温离心机（德国），PCR仪(美国)，倒置显微镜、凝胶成像系统（上海康乐）。
药物：槲寄生购于中药房，经山西医科大学药学系扬官娥教授鉴定。槲寄生碱由包头医学院化学教研室提取。
细胞株：人肝癌SMMC-7721细胞株购于中国科学院上海细胞研究所。
1.2方法
1.2.1细胞体外培养细胞培养于含10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的RPMI1640培养基中, 37 ℃、5%CO2培养箱中培养,每2 d换液1次。
1.2.2RNA提取取对数生长期的SMMC- 7721细胞调整至2×105·mL-1，2.5 mL 接种于6孔板,置37 ℃、5 %CO2培养24 h后弃原培养液,加入含浓度为0.1 mg·mL-1槲寄生碱培养液2.5 mL培养24 h，按Trizol试剂所附说明提取RNA，紫外分光光度计检测纯度。引物用灭菌去离子水溶解成10 μmol·L-1。
1.2.3引物设计按参考文献[3]、[4]及GenBank中基因序列设计引物如表1。
1.2.4 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)按一步法逆转录试剂盒要求配成50 μL反应体系进行反应。逆转录条件：45 ℃30 min ，94 ℃灭活逆转录酶2 min。bcl-2扩增条件: 94 ℃30 s，45 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，72 ℃ 延伸8 min；β-actin扩增条件: 94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸8 min。
1.2.5半定量分析将扩增的RT-PCR 产物在1.5 %琼脂糖凝胶、0.5 ×TBE 缓冲液中电泳检测,电泳条件为90 V恒压1 h。紫外透射仪下观察电泳条带,于凝胶成相仪上进行目的条带的光密度定量，bcl-2mRNA表达相对强度= bcl-2条带光密度值/β-actin条带光密度值。
1.2.6统计学处理试验结果用SPSS 11.5统计分析软件处理，数据用x±s表示,进行t 检验及方差分析。
2结果与分析
2.1总RNA抽提结果
所提取RNA经紫外分光光度计检测A260 nm /A280 nm比值为1.75。
2.2RT-PCR结果
由表2可见，bcl-2和Bax mRNA的表达均降低（P < 0.01），bcl-2下降的百分率为86.45%。bcl-2/Bax mRNA的比值用药组较对照组降低84.19%,有显著性差异（P < 0.01）。
bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，编码的bcl-2蛋白是一种膜整合蛋白，定位于线粒体膜、核膜和内质网膜上[4]。有报道说bcl-2能稳定线粒体跨膜电位，抑制线粒体通透性转变孔的开放及细胞色素C的释放，使细胞对凋亡的敏感性降低[5]，从而抑制细胞凋亡和延长细胞寿命，可以引发肿瘤。本试验显示，0.1mg·mL-1槲寄生碱作用SMMC-7721细胞24 h后bcl-2 mRNA的表达明显降低，说明槲寄生碱抑制SMMC-7721细胞增殖与降低bcl-2 mRNA表达水平有关。
参考文献：
[1] 李佩文.实用临床抗肿瘤中药[M]. 沈阳：辽宁科学技术出版社, 2001:132-133.
[2] 孔凡青.槲寄生碱对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制作用的研究[J].包头医学院学报，2007（4）：354-355,359.
[3] 张传海.亚砷酸体外抗人肝癌细胞作用及其相关机制的实验研究[D].合肥：安徽医科大学，2005.
[4] Jacobson M D, Burne J F, King M P, et al. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA[J]. Nature，1993,361(6410):365-369.
[5] Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apopogeniccytochrome C by the mitochondrial channel VDAC[J]. Nature, 1999, 399 (6735)：483-487.
关键词：槲寄生碱；bcl-2 mRNA；RT-PCR；人肝癌细胞SMMC-7721
中图分类号：R931.7文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2010.06.003
Effect of Mistletoe Alkali on Expression of bcl-2 mRNA in Human Hepatocarcinoma Cell SMMC-7721
KONG Fan-qing1, DING Hai-mai1,YANG Yan-hong2, GUO Mei-xiang2
(1.Baotou Medical College, Baotou, Neimenggu 014010, China; 2. The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou, Neimenggu 014010,China)
Abstract：This study was designed to investigate the expression of bcl-2 mRNA in Human Hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 tread with mistletoe alkali in vitro. Change of bcl-2 mRNA expression in human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721 was detected by Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Degression of bcl-2 mRNA expression(P<0.05) was detected by using RT-PC. Proliferation was inhibited by mistletoe alkali in SMMC-7721 cell line. Its mechanism was related to degression of bcl-2 mRNA expression.
Key words: mistletoe alkali; bcl-2 mRNA; reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR); human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721
槲寄生（Viscum coloratum(Kom.)Nakai）是一味传统中药，有祛风湿，补肝肾，强筋骨，养血、安胎等功效[1]。近年来，人们发现槲寄生有抗肿瘤作用，其抗肿瘤活性成分主要为槲寄生糖蛋白、毒肽、生物碱。对于槲寄生糖蛋白、毒肽的结构，抗肿瘤作用及机制的研究进展较快，欧洲槲寄生糖蛋白制剂已广泛用于临床并取得较好疗效。但对于槲寄生碱抗肿瘤的研究较少，其抗肿瘤作用的机理尚未见报道。本实验组已证实槲寄生碱对肝癌SMMC-7721细胞增殖有显著抑制作用, 且呈剂量和时间依赖性[2]。本试验选取浓度为0.1 mg·mL-1槲寄生碱液（抑制率为38%）作用于SMMC-7721细胞，观察其对bcl-2mRNA表达的影响。
1材料和方法
1.1材料
主要试剂和仪器：一步法RT-PCR试剂盒（BBI），胎牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640（GIBCO），Trizol试剂 、引物、琼脂糖（上海生工），Forma CO2培养箱（美国），Enpddorf低温离心机（德国），PCR仪(美国)，倒置显微镜、凝胶成像系统（上海康乐）。
药物：槲寄生购于中药房，经山西医科大学药学系扬官娥教授鉴定。槲寄生碱由包头医学院化学教研室提取。
细胞株：人肝癌SMMC-7721细胞株购于中国科学院上海细胞研究所。
1.2方法
1.2.1细胞体外培养细胞培养于含10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的RPMI1640培养基中, 37 ℃、5%CO2培养箱中培养,每2 d换液1次。
1.2.2RNA提取取对数生长期的SMMC- 7721细胞调整至2×105·mL-1，2.5 mL 接种于6孔板,置37 ℃、5 %CO2培养24 h后弃原培养液,加入含浓度为0.1 mg·mL-1槲寄生碱培养液2.5 mL培养24 h，按Trizol试剂所附说明提取RNA，紫外分光光度计检测纯度。引物用灭菌去离子水溶解成10 μmol·L-1。
1.2.3引物设计按参考文献[3]、[4]及GenBank中基因序列设计引物如表1。
1.2.4 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)按一步法逆转录试剂盒要求配成50 μL反应体系进行反应。逆转录条件：45 ℃30 min ，94 ℃灭活逆转录酶2 min。bcl-2扩增条件: 94 ℃30 s，45 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，72 ℃ 延伸8 min；β-actin扩增条件: 94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸8 min。
1.2.5半定量分析将扩增的RT-PCR 产物在1.5 %琼脂糖凝胶、0.5 ×TBE 缓冲液中电泳检测,电泳条件为90 V恒压1 h。紫外透射仪下观察电泳条带,于凝胶成相仪上进行目的条带的光密度定量，bcl-2mRNA表达相对强度= bcl-2条带光密度值/β-actin条带光密度值。
1.2.6统计学处理试验结果用SPSS 11.5统计分析软件处理，数据用x±s表示,进行t 检验及方差分析。
2结果与分析
2.1总RNA抽提结果
所提取RNA经紫外分光光度计检测A260 nm /A280 nm比值为1.75。
2.2RT-PCR结果
由表2可见，bcl-2和Bax mRNA的表达均降低（P < 0.01），bcl-2下降的百分率为86.45%。bcl-2/Bax mRNA的比值用药组较对照组降低84.19%,有显著性差异（P < 0.01）。
bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，编码的bcl-2蛋白是一种膜整合蛋白，定位于线粒体膜、核膜和内质网膜上[4]。有报道说bcl-2能稳定线粒体跨膜电位，抑制线粒体通透性转变孔的开放及细胞色素C的释放，使细胞对凋亡的敏感性降低[5]，从而抑制细胞凋亡和延长细胞寿命，可以引发肿瘤。本试验显示，0.1mg·mL-1槲寄生碱作用SMMC-7721细胞24 h后bcl-2 mRNA的表达明显降低，说明槲寄生碱抑制SMMC-7721细胞增殖与降低bcl-2 mRNA表达水平有关。
参考文献：
[1] 李佩文.实用临床抗肿瘤中药[M]. 沈阳：辽宁科学技术出版社, 2001:132-133.
[2] 孔凡青.槲寄生碱对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制作用的研究[J].包头医学院学报，2007（4）：354-355,359.
[3] 张传海.亚砷酸体外抗人肝癌细胞作用及其相关机制的实验研究[D].合肥：安徽医科大学，2005.
[4] Jacobson M D, Burne J F, King M P, et al. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA[J]. Nature，1993,361(6410):365-369.
[5] Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apopogeniccytochrome C by the mitochondrial channel VDAC[J]. Nature, 1999, 399 (6735)：483-487.