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[摘要] 目的 研究金银花水提取物能否扶植肠道正常菌群生长，从而调整因胆道梗阻造成的大鼠肠道菌群失调。 方法 Wistar大鼠80只，随机抽取16只作为假手术组，其余64只大鼠造成梗阻性黄疸模型后随机分成四组，每组16只，分别以金银花（金银花组），丽珠肠乐（丽珠肠乐组）、金银花与丽珠肠乐合剂（金丽合剂组）、生理盐水（梗黄模型自然恢复组）灌胃，灌胃4 d、8 d后分别处死大鼠检测肠道菌群、细菌易位数。 结果 梗阻性黄疸模型组与假手术组相比，肠道菌群数量和比例发生显著变化，肠道菌群失调。各治疗组经治疗后肠道菌群恢复，金银花与丽珠肠乐同时使用治疗效果最佳。 结论 胆道梗阻时，肠内缺乏胆汁酸，抑制革兰阴性菌能力减弱，肠道菌群失调，中药金银花可以作为微生态调节剂，调整肠道菌群失调。
[关键词] 梗阻性黄疸；菌群失调；金银花；细菌易位
[中图分类号] R575；R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673—9701（2012）24—0003—02
The adjustment of double flower on obstructive jaundice rats’ intestinal microflora imbalance
YANG Chunjia1 SU Dewang2 WANG Yuesheng2 ZHANG Kun1 MA Shuxia1 LI Liqiu1 CUI Gang1
1.Department of Microbiology，College of Basical Medical Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China；2.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China
[Abstract] Objective To investigate the traditional Chinese medicine—double flower wether can be microecological modulator so as to adjust obstructive jaundice rats’ intestinal microflora imbalance by propping up intestinal normal microbial population. Methods Among 80 Wistar rats，16 Wistar rats were randomly extracted as pseudo—operation group，other 64 rats were obstructive jaundice group. Then they were further divided into four groups：one group treated with double flower，one group treated with Bifidobiogen Livzon，one group treated with double flower and Bifidobiogen Livzon at the same time，the last group intragastric administered with physiologic saline. The 4 groups were separately tested the quantity of intestinal flora and the quantity of flora translocated into liver at the 4th，8th day after operation. Results Compared with pseudo—operation group，obstructive jaundice rats’ intestinal microflora imbalanced， the proportion and quantity of intestinal bacteria changed significantly. after teated， rats’ intestinal flora recovered in individual group and the effect of double flower with Bifidobiogen Livzon was best. Conclusion When rats’ billiary tract are obstructed，rats appear microecological imbance because of lacking bile acid in intestine，so that the ability of inhibition G— bacteria decrease. Double flower can be as prebiotics to adjust intestinal flora in rats with intestinal microflora imbalance.
[Key words] Obstructive jaundice；Microecological imbance；Double flower；Bacterial translocation
梗阻性黄疽是常见的肝胆系统疾病，内外胆管由于各种原因完全或不完全阻塞，胆汁排泄不畅，胆管压力增高，胆红素回流，出现皮肤、巩膜黄染等症状，术后虽然黄疸症状消失，但有时并发脓毒血症。有文献表明，正常人胆汁中含有能抑制肠内菌群过量繁殖的胆盐、胆酸和可溶性免疫球蛋白A（sIgA），胆汁中去氧胆汁盐具有抑制G—杆菌的作用，梗黄时由于胆道梗阻，胆汁不能顺利进入肠道，致使肠道微生态平衡紊乱。实验证明，一些补益类中药具有扶植正常菌群生长、调节菌群失调作用，起到益生元效果，如黄芪等。金银花为忍冬科植物忍冬及同属植物的干燥花蕾或带初开的花，具有显著的清热解毒、抗菌消炎等作用，其化学成分复杂，已鉴别出的就有70多种，研究表明金银花富含有机酸、挥发油、黄酮类等成分，以金银花为主要成分研制的中成药已大量应用于临床。本实验研究金银花能否促进双歧杆菌、乳酸杆菌生长，起到益生元的作用，进而应用中药金银花调整肠道菌群，治疗梗阻性黄疸及并发症时体现了中西医结合的方法，为临床减少梗阻性黄疸患者并发症提供一条新思路。 1 材料与方法
1.1 药物及制备
金银花水煎剂浓缩至浓度0.5 g生药量/mL，丽珠肠乐稀释成浓度为2.5亿活菌/mL。
1.2 动物分组及给药
Wistar大鼠80只，由佳木斯大学实验动物中心提供，体重180～220 g，雌雄各半，随机抽取16只仅游离胆总管作为假手术组，其余64只结扎胆总管造成梗阻性黄疸模型，梗阻性黄疸模型组继续随机分为四组：梗阻性黄疸自然恢复组（简称自然恢复组）、丽珠肠乐治疗组、金银花治疗组、金银花与丽珠肠乐联合治疗组（简称金丽合剂组），每组16只。自然恢复组以生理盐水灌胃，1 mL/次，2次/d；丽珠肠乐组以丽珠肠乐灌胃，1 mL/次，2次/d；金银花组以金银花灌胃1 mL/次，2次/d；金银花与丽珠肠乐合剂组以金银花和丽珠肠乐灌胃，1 mL/次，2次/d（金银花与丽珠肠乐的比例1∶1）。用药后的第4天每组处死8只大鼠，第8天每组再处死8只大鼠，取标本检测肠道菌群及细菌易位数。
1.3 肠道菌群检测
处死大鼠，无菌取大鼠盲肠内容物0.1 g，加0.9 mL稀释液，配制成稀释度10—1的盲肠内容物，进行10倍稀释至10—9，每个稀释度3滴，将双歧杆菌和乳酸杆菌培养基放入厌氧培养箱培养48～72 h，肠球菌和肠杆菌培养基置于温箱中需氧培养24 h，分别计算活菌数（CFU）。
1.4 肠道细菌易位检测
无菌称取肝组织0.1 g，加0.9 mL稀释液配制成浓度10—1 肝组织匀浆。然后10倍稀释至浓度为10—2及10—3，用20 μL微量加样器将3个稀释度滴种在EMB培养基上，需氧培养24 h。计算肠道易位至肝组织中活菌数。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1梗阻性黄疸模型组与假手术组四种肠道菌群检测结果比较
梗阻性黄疸模型组与假手术组相比，乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌菌量降低（P < 0.01），而肠杆菌菌量显著升高（P <0.01），四种肠道正常菌群菌数量及比例发生显著变化，梗阻性黄疸模型组大鼠出现肠道菌群失调。
2.2 各组大鼠肠道正常菌群定量检测结果
梗阻性黄疸大鼠肠道菌群失调后，经过各治疗组持续治疗8 d，肠道双歧杆菌菌量和乳酸杆菌菌量均增加，而肠杆菌菌量下降，治疗第4天及第8天，与自然恢复组相比均差异显著（P < 0.01），灌胃第8天与灌胃第4天相比，各治疗组双歧杆菌和乳酸杆菌菌量增加大肠杆菌下降，而自然恢复组双歧杆菌和乳酸杆菌菌量下降大肠杆菌上升。经各治疗组持续8天治疗，大鼠肠球菌菌量略有增加，但增加缓慢，在治疗第4天及治疗第8天，金银花组与梗阻性黄疸自然恢复组相比，无明显差异（P > 0.05），金丽合剂组与梗阻性黄疸自然恢复组相比无差异（P > 0.05），金银花没有显著提高肠球菌含量，可能与金银花的抑菌作用有关。
2.3 各组大鼠细菌易位数检测
在肠道微生态失衡和屏障功能破坏的情况下，肠道内的细菌可以出现在肠外组织，称细菌易位[3]。假手术组大鼠肝脏无肠道细菌易位，而梗阻性黄疸模型组肝脏中出现了肠杆菌，而且自然恢复组大鼠第8天与第4天相比，细菌易位数增加。各治疗组大鼠经过持续8天治疗，肠道细菌易位至肝脏数量大幅度下降，治疗第4天与自然恢复组相比差异显著，第8天与自然恢复组相比差异显著（P < 0.01）。
3 讨论
丽珠肠乐组、金银花组和金银花丽珠肠乐合剂组均能够显著提高双歧杆菌和乳酸杆菌菌量，降低大肠杆菌菌量，均能控制肠道细菌易位，说明中药金银花有益生元作用，能扶植正常菌群生长，调整菌群失调。金银花、丽珠肠乐二者联用起到益生元和益生菌互相促进的效果，疗效优于单独使用益生元或单独使用益生菌。
解除胆管梗阻是治疗恶性梗阻性黄疸的关键，需要进行肠道操作，使胆汁引流到肠腔，促使患者的消化功能恢复，恢复“肠肝循环”，减轻菌群失调程度和肠源性内毒素的病理效应。对于围手术期的梗阻性黄疸患者，可以微生态学方法治疗肠道菌群失调及肠源性内毒素血症等并发症。本实验研究结果表明金银花可以作为益生元，提高双歧杆菌和乳酸杆菌的含量，抑制大肠杆菌过度生长，由于内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖成分，当菌体裂解后才释放出来，大肠杆菌是G—菌，实验已探讨了中药金银花作为微生态调节剂调节肠道菌群的作用，实验后期将继续研究金银花通过调整肠道菌群及正常菌群如何发挥生理作用，进而减轻内毒素血症的作用，辅助降低梗黄患者并发症及死亡率。
[参考文献]
[1] 李波，郑思琳，陈红.肠道清洁在恶性梗阻性黄疸术前准备中的应用[J].四川医学，2010，31（3）：323.
[2] 龙跃平，肖谷欣，戴立人，等.胆盐在胆道梗阻所致肠道细菌易位中的作用[J].中华实验外科杂志，1995，12（2）：109—110.
[3] 马淑霞.临床微生态学[M].吉林：吉林科学技术出版社，
2010：66，120.
[4] 李娜，阮文辉，杨莹莹，等.金银花成分分析研究进展[J].科技情报开发与经济，2011，21（18）：178—180.
[5] Clarke DL，PillayY，Anderson F，et al.The current standard of care in the periprocedural management of the patient with obstructive[J]. Ann R CollSurgEng， 2006，88（7）：610—616.
[6] 刘朝奇.医学微生物学[M].上海：世界图书出版公司，2010：55.
（收稿日期：2012—06—13）
[关键词] 梗阻性黄疸；菌群失调；金银花；细菌易位
[中图分类号] R575；R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673—9701（2012）24—0003—02
The adjustment of double flower on obstructive jaundice rats’ intestinal microflora imbalance
YANG Chunjia1 SU Dewang2 WANG Yuesheng2 ZHANG Kun1 MA Shuxia1 LI Liqiu1 CUI Gang1
1.Department of Microbiology，College of Basical Medical Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China；2.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China
[Abstract] Objective To investigate the traditional Chinese medicine—double flower wether can be microecological modulator so as to adjust obstructive jaundice rats’ intestinal microflora imbalance by propping up intestinal normal microbial population. Methods Among 80 Wistar rats，16 Wistar rats were randomly extracted as pseudo—operation group，other 64 rats were obstructive jaundice group. Then they were further divided into four groups：one group treated with double flower，one group treated with Bifidobiogen Livzon，one group treated with double flower and Bifidobiogen Livzon at the same time，the last group intragastric administered with physiologic saline. The 4 groups were separately tested the quantity of intestinal flora and the quantity of flora translocated into liver at the 4th，8th day after operation. Results Compared with pseudo—operation group，obstructive jaundice rats’ intestinal microflora imbalanced， the proportion and quantity of intestinal bacteria changed significantly. after teated， rats’ intestinal flora recovered in individual group and the effect of double flower with Bifidobiogen Livzon was best. Conclusion When rats’ billiary tract are obstructed，rats appear microecological imbance because of lacking bile acid in intestine，so that the ability of inhibition G— bacteria decrease. Double flower can be as prebiotics to adjust intestinal flora in rats with intestinal microflora imbalance.
[Key words] Obstructive jaundice；Microecological imbance；Double flower；Bacterial translocation
梗阻性黄疽是常见的肝胆系统疾病，内外胆管由于各种原因完全或不完全阻塞，胆汁排泄不畅，胆管压力增高，胆红素回流，出现皮肤、巩膜黄染等症状，术后虽然黄疸症状消失，但有时并发脓毒血症。有文献表明，正常人胆汁中含有能抑制肠内菌群过量繁殖的胆盐、胆酸和可溶性免疫球蛋白A（sIgA），胆汁中去氧胆汁盐具有抑制G—杆菌的作用，梗黄时由于胆道梗阻，胆汁不能顺利进入肠道，致使肠道微生态平衡紊乱。实验证明，一些补益类中药具有扶植正常菌群生长、调节菌群失调作用，起到益生元效果，如黄芪等。金银花为忍冬科植物忍冬及同属植物的干燥花蕾或带初开的花，具有显著的清热解毒、抗菌消炎等作用，其化学成分复杂，已鉴别出的就有70多种，研究表明金银花富含有机酸、挥发油、黄酮类等成分，以金银花为主要成分研制的中成药已大量应用于临床。本实验研究金银花能否促进双歧杆菌、乳酸杆菌生长，起到益生元的作用，进而应用中药金银花调整肠道菌群，治疗梗阻性黄疸及并发症时体现了中西医结合的方法，为临床减少梗阻性黄疸患者并发症提供一条新思路。 1 材料与方法
1.1 药物及制备
金银花水煎剂浓缩至浓度0.5 g生药量/mL，丽珠肠乐稀释成浓度为2.5亿活菌/mL。
1.2 动物分组及给药
Wistar大鼠80只，由佳木斯大学实验动物中心提供，体重180～220 g，雌雄各半，随机抽取16只仅游离胆总管作为假手术组，其余64只结扎胆总管造成梗阻性黄疸模型，梗阻性黄疸模型组继续随机分为四组：梗阻性黄疸自然恢复组（简称自然恢复组）、丽珠肠乐治疗组、金银花治疗组、金银花与丽珠肠乐联合治疗组（简称金丽合剂组），每组16只。自然恢复组以生理盐水灌胃，1 mL/次，2次/d；丽珠肠乐组以丽珠肠乐灌胃，1 mL/次，2次/d；金银花组以金银花灌胃1 mL/次，2次/d；金银花与丽珠肠乐合剂组以金银花和丽珠肠乐灌胃，1 mL/次，2次/d（金银花与丽珠肠乐的比例1∶1）。用药后的第4天每组处死8只大鼠，第8天每组再处死8只大鼠，取标本检测肠道菌群及细菌易位数。
1.3 肠道菌群检测
处死大鼠，无菌取大鼠盲肠内容物0.1 g，加0.9 mL稀释液，配制成稀释度10—1的盲肠内容物，进行10倍稀释至10—9，每个稀释度3滴，将双歧杆菌和乳酸杆菌培养基放入厌氧培养箱培养48～72 h，肠球菌和肠杆菌培养基置于温箱中需氧培养24 h，分别计算活菌数（CFU）。
1.4 肠道细菌易位检测
无菌称取肝组织0.1 g，加0.9 mL稀释液配制成浓度10—1 肝组织匀浆。然后10倍稀释至浓度为10—2及10—3，用20 μL微量加样器将3个稀释度滴种在EMB培养基上，需氧培养24 h。计算肠道易位至肝组织中活菌数。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1梗阻性黄疸模型组与假手术组四种肠道菌群检测结果比较
梗阻性黄疸模型组与假手术组相比，乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌菌量降低（P < 0.01），而肠杆菌菌量显著升高（P <0.01），四种肠道正常菌群菌数量及比例发生显著变化，梗阻性黄疸模型组大鼠出现肠道菌群失调。
2.2 各组大鼠肠道正常菌群定量检测结果
梗阻性黄疸大鼠肠道菌群失调后，经过各治疗组持续治疗8 d，肠道双歧杆菌菌量和乳酸杆菌菌量均增加，而肠杆菌菌量下降，治疗第4天及第8天，与自然恢复组相比均差异显著（P < 0.01），灌胃第8天与灌胃第4天相比，各治疗组双歧杆菌和乳酸杆菌菌量增加大肠杆菌下降，而自然恢复组双歧杆菌和乳酸杆菌菌量下降大肠杆菌上升。经各治疗组持续8天治疗，大鼠肠球菌菌量略有增加，但增加缓慢，在治疗第4天及治疗第8天，金银花组与梗阻性黄疸自然恢复组相比，无明显差异（P > 0.05），金丽合剂组与梗阻性黄疸自然恢复组相比无差异（P > 0.05），金银花没有显著提高肠球菌含量，可能与金银花的抑菌作用有关。
2.3 各组大鼠细菌易位数检测
在肠道微生态失衡和屏障功能破坏的情况下，肠道内的细菌可以出现在肠外组织，称细菌易位[3]。假手术组大鼠肝脏无肠道细菌易位，而梗阻性黄疸模型组肝脏中出现了肠杆菌，而且自然恢复组大鼠第8天与第4天相比，细菌易位数增加。各治疗组大鼠经过持续8天治疗，肠道细菌易位至肝脏数量大幅度下降，治疗第4天与自然恢复组相比差异显著，第8天与自然恢复组相比差异显著（P < 0.01）。
3 讨论
丽珠肠乐组、金银花组和金银花丽珠肠乐合剂组均能够显著提高双歧杆菌和乳酸杆菌菌量，降低大肠杆菌菌量，均能控制肠道细菌易位，说明中药金银花有益生元作用，能扶植正常菌群生长，调整菌群失调。金银花、丽珠肠乐二者联用起到益生元和益生菌互相促进的效果，疗效优于单独使用益生元或单独使用益生菌。
解除胆管梗阻是治疗恶性梗阻性黄疸的关键，需要进行肠道操作，使胆汁引流到肠腔，促使患者的消化功能恢复，恢复“肠肝循环”，减轻菌群失调程度和肠源性内毒素的病理效应。对于围手术期的梗阻性黄疸患者，可以微生态学方法治疗肠道菌群失调及肠源性内毒素血症等并发症。本实验研究结果表明金银花可以作为益生元，提高双歧杆菌和乳酸杆菌的含量，抑制大肠杆菌过度生长，由于内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖成分，当菌体裂解后才释放出来，大肠杆菌是G—菌，实验已探讨了中药金银花作为微生态调节剂调节肠道菌群的作用，实验后期将继续研究金银花通过调整肠道菌群及正常菌群如何发挥生理作用，进而减轻内毒素血症的作用，辅助降低梗黄患者并发症及死亡率。
[参考文献]
[1] 李波，郑思琳，陈红.肠道清洁在恶性梗阻性黄疸术前准备中的应用[J].四川医学，2010，31（3）：323.
[2] 龙跃平，肖谷欣，戴立人，等.胆盐在胆道梗阻所致肠道细菌易位中的作用[J].中华实验外科杂志，1995，12（2）：109—110.
[3] 马淑霞.临床微生态学[M].吉林：吉林科学技术出版社，
2010：66，120.
[4] 李娜，阮文辉，杨莹莹，等.金银花成分分析研究进展[J].科技情报开发与经济，2011，21（18）：178—180.
[5] Clarke DL，PillayY，Anderson F，et al.The current standard of care in the periprocedural management of the patient with obstructive[J]. Ann R CollSurgEng， 2006，88（7）：610—616.
[6] 刘朝奇.医学微生物学[M].上海：世界图书出版公司，2010：55.
（收稿日期：2012—06—13）