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摘要 [目的] 探討离子液体对斜纹夜蛾体内解毒酶活性的影响。[方法] 采用点滴法测定1甲基咪唑、溴化1丙基3甲基咪唑、溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾4龄幼虫的急性毒性，并测定不同触杀时间后幼虫体内谷胱甘肽S转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）的活性。[结果] 1甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈始终抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势。1甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斜纹夜蛾体内CarE活性均呈始终抑制的趋势。溴化1丙基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈始终抑制的趋势。溴化1丙基3甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斜纹夜蛾体内CarE活性均呈始终抑制的趋势。溴化1辛基3甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斜纹夜蛾体内GSTs活性均呈先诱导后抑制的趋势。溴化1辛基3甲基咪唑（LC20和LC50）处理的斜纹夜蛾体内CarE活性均呈始终抑制的趋势。[结论]3种离子液体在斜纹夜蛾体内积累显著影响斜纹夜蛾体内 GSTs和 CarE的活性，减弱斜纹夜蛾体内代谢、分解农药的能力，从而对其产生毒害作用。
关键词 离子液体；斜纹夜蛾；急性毒性；解毒酶
中图分类号 S433.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02347-03
Effects of Ionic Liquids on Detoxifying Enzymes Activities of Prodenia litura
HAN Xuyang， LU Man et al
（Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150026）
Abstract [Objective] To investigate effects of ionic liquids on detoxifying enzymes activities of Prodenia litura. [Method] 1Methylimidazole， 1propyl3methylimidazolium Bromide， 1Octyl3methylimidazolium Bromide were used to test the acute toxicity of 4th instar larvae of Prodenia litura by topical， and investigate the activities of glutathione Stransfer（GSTs）， carboxylesterase （CarE） in the larvae at different tag time. [Result] Effect of 1Methylimidazole GSTs in vivo activity of Spodoptera through LC20 concentrations from the point of view was always suppressed trend from view after LC50 concentrations after the first trend was induced inhibition. 1 methylimidazole （LC20 and LC50） CarE cutworm activity in vivo treatment always showed inhibition trend. 1propyl3methylimidazolium Bromide Spodoptera GSTs activity in vivo through LC20 concentrations from the point of view was suppressed after the first induction trend is always suppressed through LC50 concentrations from the point of view presented. 1propyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera CarE activity in vivo treatment always showed inhibition trend. 1Octyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera GSTs activity in vivo showed after the first treatment induced inhibition of trend. 1Octyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera CarE activity in vivo treatment always showed inhibition trend. [Conclusion] Three ionic liquids were accumulated in the body significantly affect the GSTs and CarE activities in Spodoptera litura， diminished capacity Spodoptera metabolism， decomposition of pesticides， and thus produce its toxic effects. Key words Ionic liquids； Prodenia litura； Acute toxicity； Detoxifying enzymes
斜纹夜蛾Prodenia litura属鳞翅目夜蛾科，又名莲纹夜蛾，俗称夜盗虫、乌头虫等。除青海、新疆未明外，我国其他各省（自治区）都有发生。因斜纹夜蛾容易饲养且发生世代多[7]，抗氧化强，因此，在生物学、分类学、酶学以及环境学等方面的研究中通常都会用其作为昆虫试验的材料[1-6]。
离子液体（Ionic liquids）是在室温下为液体的离子化合物，近几年来已被开发成一种新型绿色化学反应介质[8-9]。目前，国内外对离子液体的研究主要集中在合成、物化性质等领域[10-11]。由于离子液体的研究还处于起步阶段，关于其毒性方面的报道很少[12-13]。所以笔者选取3种有代表性的离子液体对斜纹夜蛾进行毒性试验，进一步明确其杀虫活性和作用机理。昆虫体内的解毒酶是在农药长期施用下，体内产生的一种能够代谢农药的一类酶[14]，就3种离子液体对斜纹夜蛾体内GSTs和CarE这2种解毒酶活性的影响进行了首次探讨，旨在初步探究离子液体对昆虫的杀虫机理，为开发绿色、高效、安全的新型杀虫剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
斜纹夜蛾和饲料均购于湖南农业大学。斜纹夜蛾置于温度（28±2）℃、相对湿度65%、光周期12L∶12D的生化培养箱中，用饲料喂养，驯化15 d后挑选健壮、颜色、大小一致的斜纹夜蛾4龄幼虫用于试验。
1.2 主要试剂
1甲基咪唑、溴化1丙基3甲基咪唑、溴化1辛基3甲基咪唑，均购于上海江莱生物科技有限公司；牛血清白蛋白（ BSA）、乙二胺四乙酸（ EDTA）、二硫苏糖醇（DTT）、对硝基苯酚磷酸二钠（PNPP）均购于Amresco 公司；1氯2，4二硝基苯（CDNB）、固蓝B盐（Fast blue B salt）、考马斯亮蓝 G250购自哈尔滨益世达公司。
1.3 离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的急性毒性测定 采用点滴法[15]触杀斜纹夜蛾4龄幼虫，进行毒性测定，用丙酮将离子液体溶解成药液。预试验：大范围设定一系列浓度梯度，每个浓度为1个试验组，每个试验组设置 2 个平行试验，挑选健康、大小、颜色一致的4龄斜纹夜蛾幼虫 10头放入培养皿中，培养皿底部铺一层饲料。将10 μl药液滴于幼虫的前胸背板处，用丙酮进行对照，48 h后观察幼虫死亡数，确定幼虫100%致死浓度和零致死浓度。正式试验：根据预试验确定的浓度范围，将药液按照几何级数形式稀释成5个浓度梯度，每个浓度为1个试验组，每个试验组设置 3 个平行试验，挑选健康、大小、颜色一致的4龄斜纹夜蛾幼虫 10头放入培养皿中，培养皿底部铺一层饲料。将10 μl的药液滴于幼虫的前胸背板处，用丙酮进行对照，观察斜纹夜蛾的中毒情况并及时挑出死亡个体，分别于触杀处理的12、24、36和48 h后统计死亡数。以镊子轻触试虫，对刺激无反应者视为死亡。
1.4 用于测定酶活性的试虫处理
处理方法同“1.3”。根据3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的毒力测定结果，以48 h的LC50为基准，选取丙酮液（ 丙酮∶蒸馏水=2∶1，V/V）配制成母液，之后再用蒸馏水稀释成亚致死浓度 LC20，以相同溶剂作为对照组。将健康、大小、颜色一致的4龄斜纹夜蛾幼虫 16头放入培养皿中，培养皿底部铺一层饲料。将10 μl的药液滴于幼虫的前胸背板处，用丙酮进行对照，处理12、24、36和48 h后取样，储存于-20 ℃冰箱用于制备酶液。
1.5 酶液制备
从每个处理组均随机选取2头斜纹夜蛾幼虫加1 ml预冷过的提取液，置于冰浴过的玻璃匀浆器内充分匀浆，GSTs和CarE在4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，上层清液即为酶液。
1.6 酶活性的测定
蛋白质含量测定参照 Bradford（ 1976）的考马斯亮蓝 G250法。
GSTs活性测定参照Booth 等（1961）方法，略有改进。在测定试管中分别加入2.3 ml 0.1 mol/L PBS（pH6.5），0.5 ml 9 mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）和0.02 ml酶液，0.1 ml 45 mol/L的CDNB，利用紫外分光光度计在340 nm波长下，测定OD值，每0.5 min观测一次，共观察3 min。
CarE活性测定参照Van Asperen（ 1962）方法，略有改进。取0.005 ml酶液与1.8 ml αNA混合均匀，置于30 ℃水浴锅中反应10 min，加入0.9 ml显色剂终止反应，在600 nm波长下测定OD值。
1.7 数据处理
运用 POLO软件计算3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的致死中浓度（ LC50）和亚致死浓度（ LC20）以及95%置信区间。 采用SPSS18.0 软件进行显著性分析（P=0.05），采用Eccel作图。
2 结果与分析
2.1 3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的急性毒性
从表1可以看出，1甲基咪唑对斜纹夜蛾幼虫 12、24、36和48 h的 LC50分别为32.035、20.383、12.625、7.671 mg/L，LC20分别为16.668、10.145、6.280、4.448 mg/L。从表2可以看出，溴化1丙基3甲基咪唑對斜纹夜蛾幼虫 12、24、36和48 h的LC50分别为46.546、21.398、11.729、7.406 mg/L，LC20分别为21.682、7.771、4.544、3.973 mg/L。从表3可以看出，溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾幼虫12、24、36和48 h的LC50分别为61.111、25.243、14.142、9.726 mg/L，LC20分别为20.177、9.510、6.383、5.297 mg/L。 2.2 3种离子液体对斜纹夜蛾体内解毒酶活性的影响
选择3种离子液体1甲基咪唑48 h的LC50（7.671 mg/L）和48 h的LC20（4.448 mg/L），溴化1丙基3甲基咪唑48 h的LC50（7.406 mg/L）和48 h的LC20（3.973 mg/L），溴化1辛基3甲基咪唑48 h的LC50（9.726 mg/L）和48 h的LC20（5.297 mg/L），作为处理浓度，测定3种离子液体对斜纹夜蛾体内解毒酶活性的影响。
2.2.1 1甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE活性的影响。
从图1可以看出，经过LC20浓度处理，斜纹夜蛾体内GSTs活性均低于对照组。12 h后，抑制作用不显著。24、36、48 h后，有显著的抑制作用（P<0.05）。经过LC50浓度处理，12 h后酶活性高于对照组，诱导作用显著（P<0.05）。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，且抑制作用显著（P<0.05）。1甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈始终抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势。
2.2.2 溴化1丙基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE活性的影响。
从图3可以看出，经过LC20浓度处理，12 h后斜纹夜蛾体内GSTs活性高于对照组，诱导作用显著（P<0.05）。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，抑制作用显著（P<0.05）。经过LC50浓度处理，酶活性均低于对照组，抑制作用显著（P<0.05）。溴化1丙基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈始终抑制的趋势。
2.2.3 溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE活性的影响。
从图5可以看出，经过LC20浓度处理，12 h后斜纹夜蛾体内GSTs活性高于对照组，诱导作用不显著。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，24和36 h有显著抑制作用（P<0.05），48 h抑制作用不显著。经过LC50浓度处理，12 h后酶活性高于对照组，诱导作用不显著。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，有显著抑制作用（P<0.05）。溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势。
3 结论与讨论
3种离子液体在对斜纹夜蛾进行触杀试验时，试虫接入培养皿初期均表现出不同程度的兴奋症状，随着处理时间的延长，处理组幼虫有的虫体表现出抽搐、痉挛，并伴有吐水的症状，虫体失水变软，身体萎缩，最后死亡或出現中毒症状。随着3种离子液体作用时间的延长，LC50值均逐渐降低，表明随处理时间的延长，3种离子液体对斜纹夜蛾幼虫的毒性逐渐增加。该试验表明，3种离子液体对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE的酶活性均有不同程度的影响。
关键词 离子液体；斜纹夜蛾；急性毒性；解毒酶
中图分类号 S433.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02347-03
Effects of Ionic Liquids on Detoxifying Enzymes Activities of Prodenia litura
HAN Xuyang， LU Man et al
（Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150026）
Abstract [Objective] To investigate effects of ionic liquids on detoxifying enzymes activities of Prodenia litura. [Method] 1Methylimidazole， 1propyl3methylimidazolium Bromide， 1Octyl3methylimidazolium Bromide were used to test the acute toxicity of 4th instar larvae of Prodenia litura by topical， and investigate the activities of glutathione Stransfer（GSTs）， carboxylesterase （CarE） in the larvae at different tag time. [Result] Effect of 1Methylimidazole GSTs in vivo activity of Spodoptera through LC20 concentrations from the point of view was always suppressed trend from view after LC50 concentrations after the first trend was induced inhibition. 1 methylimidazole （LC20 and LC50） CarE cutworm activity in vivo treatment always showed inhibition trend. 1propyl3methylimidazolium Bromide Spodoptera GSTs activity in vivo through LC20 concentrations from the point of view was suppressed after the first induction trend is always suppressed through LC50 concentrations from the point of view presented. 1propyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera CarE activity in vivo treatment always showed inhibition trend. 1Octyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera GSTs activity in vivo showed after the first treatment induced inhibition of trend. 1Octyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera CarE activity in vivo treatment always showed inhibition trend. [Conclusion] Three ionic liquids were accumulated in the body significantly affect the GSTs and CarE activities in Spodoptera litura， diminished capacity Spodoptera metabolism， decomposition of pesticides， and thus produce its toxic effects. Key words Ionic liquids； Prodenia litura； Acute toxicity； Detoxifying enzymes
斜纹夜蛾Prodenia litura属鳞翅目夜蛾科，又名莲纹夜蛾，俗称夜盗虫、乌头虫等。除青海、新疆未明外，我国其他各省（自治区）都有发生。因斜纹夜蛾容易饲养且发生世代多[7]，抗氧化强，因此，在生物学、分类学、酶学以及环境学等方面的研究中通常都会用其作为昆虫试验的材料[1-6]。
离子液体（Ionic liquids）是在室温下为液体的离子化合物，近几年来已被开发成一种新型绿色化学反应介质[8-9]。目前，国内外对离子液体的研究主要集中在合成、物化性质等领域[10-11]。由于离子液体的研究还处于起步阶段，关于其毒性方面的报道很少[12-13]。所以笔者选取3种有代表性的离子液体对斜纹夜蛾进行毒性试验，进一步明确其杀虫活性和作用机理。昆虫体内的解毒酶是在农药长期施用下，体内产生的一种能够代谢农药的一类酶[14]，就3种离子液体对斜纹夜蛾体内GSTs和CarE这2种解毒酶活性的影响进行了首次探讨，旨在初步探究离子液体对昆虫的杀虫机理，为开发绿色、高效、安全的新型杀虫剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
斜纹夜蛾和饲料均购于湖南农业大学。斜纹夜蛾置于温度（28±2）℃、相对湿度65%、光周期12L∶12D的生化培养箱中，用饲料喂养，驯化15 d后挑选健壮、颜色、大小一致的斜纹夜蛾4龄幼虫用于试验。
1.2 主要试剂
1甲基咪唑、溴化1丙基3甲基咪唑、溴化1辛基3甲基咪唑，均购于上海江莱生物科技有限公司；牛血清白蛋白（ BSA）、乙二胺四乙酸（ EDTA）、二硫苏糖醇（DTT）、对硝基苯酚磷酸二钠（PNPP）均购于Amresco 公司；1氯2，4二硝基苯（CDNB）、固蓝B盐（Fast blue B salt）、考马斯亮蓝 G250购自哈尔滨益世达公司。
1.3 离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的急性毒性测定 采用点滴法[15]触杀斜纹夜蛾4龄幼虫，进行毒性测定，用丙酮将离子液体溶解成药液。预试验：大范围设定一系列浓度梯度，每个浓度为1个试验组，每个试验组设置 2 个平行试验，挑选健康、大小、颜色一致的4龄斜纹夜蛾幼虫 10头放入培养皿中，培养皿底部铺一层饲料。将10 μl药液滴于幼虫的前胸背板处，用丙酮进行对照，48 h后观察幼虫死亡数，确定幼虫100%致死浓度和零致死浓度。正式试验：根据预试验确定的浓度范围，将药液按照几何级数形式稀释成5个浓度梯度，每个浓度为1个试验组，每个试验组设置 3 个平行试验，挑选健康、大小、颜色一致的4龄斜纹夜蛾幼虫 10头放入培养皿中，培养皿底部铺一层饲料。将10 μl的药液滴于幼虫的前胸背板处，用丙酮进行对照，观察斜纹夜蛾的中毒情况并及时挑出死亡个体，分别于触杀处理的12、24、36和48 h后统计死亡数。以镊子轻触试虫，对刺激无反应者视为死亡。
1.4 用于测定酶活性的试虫处理
处理方法同“1.3”。根据3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的毒力测定结果，以48 h的LC50为基准，选取丙酮液（ 丙酮∶蒸馏水=2∶1，V/V）配制成母液，之后再用蒸馏水稀释成亚致死浓度 LC20，以相同溶剂作为对照组。将健康、大小、颜色一致的4龄斜纹夜蛾幼虫 16头放入培养皿中，培养皿底部铺一层饲料。将10 μl的药液滴于幼虫的前胸背板处，用丙酮进行对照，处理12、24、36和48 h后取样，储存于-20 ℃冰箱用于制备酶液。
1.5 酶液制备
从每个处理组均随机选取2头斜纹夜蛾幼虫加1 ml预冷过的提取液，置于冰浴过的玻璃匀浆器内充分匀浆，GSTs和CarE在4 ℃、10 000 r/min条件下离心20 min，上层清液即为酶液。
1.6 酶活性的测定
蛋白质含量测定参照 Bradford（ 1976）的考马斯亮蓝 G250法。
GSTs活性测定参照Booth 等（1961）方法，略有改进。在测定试管中分别加入2.3 ml 0.1 mol/L PBS（pH6.5），0.5 ml 9 mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）和0.02 ml酶液，0.1 ml 45 mol/L的CDNB，利用紫外分光光度计在340 nm波长下，测定OD值，每0.5 min观测一次，共观察3 min。
CarE活性测定参照Van Asperen（ 1962）方法，略有改进。取0.005 ml酶液与1.8 ml αNA混合均匀，置于30 ℃水浴锅中反应10 min，加入0.9 ml显色剂终止反应，在600 nm波长下测定OD值。
1.7 数据处理
运用 POLO软件计算3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的致死中浓度（ LC50）和亚致死浓度（ LC20）以及95%置信区间。 采用SPSS18.0 软件进行显著性分析（P=0.05），采用Eccel作图。
2 结果与分析
2.1 3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的急性毒性
从表1可以看出，1甲基咪唑对斜纹夜蛾幼虫 12、24、36和48 h的 LC50分别为32.035、20.383、12.625、7.671 mg/L，LC20分别为16.668、10.145、6.280、4.448 mg/L。从表2可以看出，溴化1丙基3甲基咪唑對斜纹夜蛾幼虫 12、24、36和48 h的LC50分别为46.546、21.398、11.729、7.406 mg/L，LC20分别为21.682、7.771、4.544、3.973 mg/L。从表3可以看出，溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾幼虫12、24、36和48 h的LC50分别为61.111、25.243、14.142、9.726 mg/L，LC20分别为20.177、9.510、6.383、5.297 mg/L。 2.2 3种离子液体对斜纹夜蛾体内解毒酶活性的影响
选择3种离子液体1甲基咪唑48 h的LC50（7.671 mg/L）和48 h的LC20（4.448 mg/L），溴化1丙基3甲基咪唑48 h的LC50（7.406 mg/L）和48 h的LC20（3.973 mg/L），溴化1辛基3甲基咪唑48 h的LC50（9.726 mg/L）和48 h的LC20（5.297 mg/L），作为处理浓度，测定3种离子液体对斜纹夜蛾体内解毒酶活性的影响。
2.2.1 1甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE活性的影响。
从图1可以看出，经过LC20浓度处理，斜纹夜蛾体内GSTs活性均低于对照组。12 h后，抑制作用不显著。24、36、48 h后，有显著的抑制作用（P<0.05）。经过LC50浓度处理，12 h后酶活性高于对照组，诱导作用显著（P<0.05）。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，且抑制作用显著（P<0.05）。1甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈始终抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势。
2.2.2 溴化1丙基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE活性的影响。
从图3可以看出，经过LC20浓度处理，12 h后斜纹夜蛾体内GSTs活性高于对照组，诱导作用显著（P<0.05）。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，抑制作用显著（P<0.05）。经过LC50浓度处理，酶活性均低于对照组，抑制作用显著（P<0.05）。溴化1丙基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈始终抑制的趋势。
2.2.3 溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE活性的影响。
从图5可以看出，经过LC20浓度处理，12 h后斜纹夜蛾体内GSTs活性高于对照组，诱导作用不显著。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，24和36 h有显著抑制作用（P<0.05），48 h抑制作用不显著。经过LC50浓度处理，12 h后酶活性高于对照组，诱导作用不显著。24、36、48 h后酶活性均低于对照组，有显著抑制作用（P<0.05）。溴化1辛基3甲基咪唑对斜纹夜蛾体内GSTs活性的影响从经过LC20浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势，从经过LC50浓度处理来看呈先诱导后抑制的趋势。
3 结论与讨论
3种离子液体在对斜纹夜蛾进行触杀试验时，试虫接入培养皿初期均表现出不同程度的兴奋症状，随着处理时间的延长，处理组幼虫有的虫体表现出抽搐、痉挛，并伴有吐水的症状，虫体失水变软，身体萎缩，最后死亡或出現中毒症状。随着3种离子液体作用时间的延长，LC50值均逐渐降低，表明随处理时间的延长，3种离子液体对斜纹夜蛾幼虫的毒性逐渐增加。该试验表明，3种离子液体对斜纹夜蛾体内GSTs、CarE的酶活性均有不同程度的影响。