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摘要：目的 建立维药睡莲花中没食子酸和烟花苷含量的高效液相色谱测定方法。方法 色谱柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.1%冰乙酸混合水溶液，梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃。结果 没食子酸及烟花苷进样量分别在0.065～0.585 ?g（r=0.999 1）、0.133～1.197 ?g（r=0.999 5）范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为102.71%、102.08%，RSD分别为1.97%、0.46%。结论 本方法操作简单、准确可靠，可用于维药睡莲花中烟花苷和没食子酸含量的测定。
关键词：睡莲花；没食子酸；烟花苷；高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.027
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0092-03
Determination of Gallic Acid and Kaempferol-3-O-Rutinoside Contents in Nymphaea Candida Presl. by HPLC LI Jie1， ZHANG Xue-jia1， LI Ke-ao2， JI Zhi-hong2， TIAN Shu-ge1 （1.College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China；2.Xinjiang Qikang Habo Uygur Medicine Company， Urumqi 830026， China）
Abstract：Objective To establish an HPLC method for the content determination of gallic acid and kaempferol-3-O-rutinoside in Nymphaea candida Presl.. Methods The separation was carried out on a Wondasil C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was methanol-0.1% acetic acid solution， with gradient elution；the flow rate was 1.0 mL/min；the detection wavelength was set at 270 nm；the column temperature was 30 ℃. Results The linear ranges of gallic acid and kaempferol-3-O-rutinoside were 0.065-0.585 μg （r=0.999 1）， 0.133-1.197 μg （r=0.999 5）， respectively. The average recoveries of gallic acid and kaempferol-3-O-rutinoside were 102.71%， 102.08%， with RSD of 1.97%， 0.46%， respectively. Conclusion This method was rapid， accurate， and reliable. It can be used for the determination of allic acid and kaempferol-3-O-rutinoside in Nymphaea candida Presl..
Key words：Nymphaea candida Presl.；gallic acid；kaempferol-3-O-rutinoside；HPLC；content determination
睡莲花为睡莲科雪白睡莲Nymphaea candida
基金项目：乌鲁木齐市科技计划项目（C121120001）
通讯作者：田树革，E-mail：tsgyz@sina.com
Presl.的干燥花蕾，分布于我国新疆的南部地区，具有降热止咳、益心护脑、安神止痛功效，临床主要用于感冒发热、头痛咳嗽、咽痛等表症[1-2]。睡莲花是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要药物，含
参考文献：
[1] 钟可，何建亿.葛根不同炮制品中总黄酮的含量测定[J].贵阳中医学院学报，2004，26（4）：59.
[2] 宋炜，高卫华.葛根素的药理作用解析及临床用途[J].中外医疗， 2011，30（4）：139.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：312.
[4] 王孝涛，叶定江.历代中药炮制法汇典：古代部分[M].南昌：江西科学技术出版社，1986：141-142.
[5] 黄伟强，金哲雄，张贵君，等.葛根止泻作用研究[J].黑龙江医药， 2009，22（6）：821-824.
[6] 尹丽红，李艳枫，孟繁琳.葛根的化学成分，药理作用和临床应用[J].黑龙江医药，2010，23（3）：371-373.
[7] 白东义，佟春玲，韩慧.葛根素的药理作用及其临床应用研究进展[J].江苏中医药，2009，41（3）：76-78.
[8] 张彤，马玮芸，陶建生，等.多指标综合评分法优选栀子炭炮制工艺[J].中国药师，2007，10（4）：322-324. （收稿日期：2013-11-15；编辑：陈静）
有大量黄酮类和酚酸化合物。其黄酮类化合物的生物活性广泛而温和，具有抗菌、消炎、抑制血小板聚集、抗凝及抗血栓形成等作用[3-4]。本试验参考相关文献[5-8]，建立高效液相色谱法（HPLC）测定睡莲花中没食子酸和烟花苷含量的方法，为睡莲花的进一步开发利用提供参考。
1 仪器与试药
LC-6AD型高效液相色谱仪，CBM-20A型色谱工作站，SPD-20A型紫外检测器，SIL-20A型自动进样器，CTO-10ASvp型柱温箱（日本岛津公司）；XS105型电子天平（德国梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
烟花苷对照品（含量>97%）由新疆药物研究所赵军博士提供，没食子酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，含量>98%）。睡莲花药材采购于新疆奇康哈博维药有限公司，经新疆医科大学中医学院药用植物学讲师徐海燕鉴定为睡莲科雪白睡莲Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾，粉碎，过20目筛，备用。甲醇（色谱纯，飞世尔实验器材有限公司），其他试剂均为分析纯，水为饮用纯净水（娃哈哈集团有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）和0.1%冰乙酸混合水溶液（B）。梯度程序：0～10 min，90%～75%B；10～25 min，75%～55%B；25～35 min，55%～45%B；35～50 min，45%～0%B。流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。色谱图见图1。
A
B
注：A.混合对照品；B.供试品；1.没食子酸；2.烟花苷
图1 睡莲花中没食子酸和烟花苷HPLC图
2.2 对照品溶液的制备
精密称取没食子酸对照品6.50 mg、烟花苷对照品5.31 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成浓度分别为0.650 mg/mL没食子酸、0.531 mg/mL烟花苷的对照品储备液。分别吸取1 mL没食子酸对照品储备液、2.5 mL烟花苷对照品储备液，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，即得没食子酸0.065 mg/mL、烟花苷0.133 mg/mL的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取1 g睡莲花药材粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇，称定质量，超声处理（功率80 W，频率100 Hz）30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，取滤液，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得。
2.4 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液1、3、5、7、9 ?L，进样分析，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。得到没食子酸线性回归方程Y=3 177 785.34X-34 770.85（r=0.999 1），烟花苷线性回归方程Y=2 027 945.39X-17 934.95 （r=0.999 5）。结果表明，没食子酸及烟花苷进样量分别在0.065～0.585 ?g、0.133～1.197 ?g范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液5 ?L，连续进样6次，结果没食子酸及烟花苷峰面积RSD分别为0.76%、0.98%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一睡莲花供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样5 ?L测定，结果没食子酸峰面积RSD=2.37%，烟花苷峰面积RSD=2.29%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.7 重复性试验
称取睡莲花样品6份，按“2.3”项下方法配制，并在“2.1”项色谱条件下进样5 ?L进行测定。结果供试品溶液中没食子酸及烟花苷含量的RSD分别为0.35%、1.92%，表明本方法的重复性较好。
2.8 加样回收率试验
分别称取6份已知含量的睡莲花药材粉末，每份约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入没食子酸对照品及烟花苷对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样5 ?L测定，结果没食子酸平均回收率为102.71%（RSD=1.97%），烟花苷平均回收率为102.08%（RSD=0.46%）。
3 讨论
本试验对样品的提取方法进行了考察。提取溶剂分别采用甲醇、乙醇及70%乙醇，对睡莲花中没食子酸和烟花苷的测定结果没有明显影响，但以甲醇作为溶剂时色谱峰较多，故选用甲醇作为提取溶剂。分别采用超声、煎煮两种提取方式，设定不同的提取时间，对没食子酸和烟花苷的含量进行测定，结果超声30 min为最佳提取方式。
分别对甲醇和乙腈作为流动相对样品的分离效果进行了对比，结果以甲醇-0.1%冰乙酸混合水溶液为流动相进行梯度洗脱、检测波长为270 nm时，样品色谱峰峰型、分离度等均较理想。结果表明，3批睡莲花中没食子酸和烟花苷含量没有明显差异。
本试验采用HPLC测定睡莲花中没食子酸和烟花苷含量，该方法重复性、稳定性较好，专属性强，检测可排除其他非测定物质的干扰，测定结果准确，可作为同时测定维药睡莲花中没食子酸、烟花苷化学成分的检测标准，为睡莲花的质量控制提供了试验数据。
参考文献：
[1] 刘勇民.维吾尔药志：下册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社， 1999：541.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[S].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：41.
[3] 赵军，何金华，闫明，等.维药睡莲花化学成分研究[J].中国中药杂志， 2007，32（12）：1232-1234.
[4] 金晓红，耿伟，桂红武，等.睡莲花总黄酮超声提取工艺研究[J].医药导报，2011，30（11）：1487-1489.
[5] 王东东，刘宏炳，宋海龙，等.HPLC法测定阜康阿魏根和叶中阿魏酸的含量[J].新疆医科大学学报，2012，35（9）：1139-1142.
[6] 叶光明，姜云云，陈云红.HPLC法同时测定芦笋黄酮中5种黄酮苷的含量[C]//第十一届江苏省药师周大会论文集.常州：常州出版社，2011.
[7] 常占瑛，马桂芝，高晓黎.HPLC法测定新疆不同产地石榴皮中没食子酸的含量[J].新疆医科大学学报，2009，32（11）：1552-1556.
[8] 任源，堵年生.HPLC测定没食子中没食子酸的含量[J].华西药学杂志， 2005，20（1）：71-72.
（收稿日期：2014-01-06；编辑：陈静）
关键词：睡莲花；没食子酸；烟花苷；高效液相色谱法；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.027
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0092-03
Determination of Gallic Acid and Kaempferol-3-O-Rutinoside Contents in Nymphaea Candida Presl. by HPLC LI Jie1， ZHANG Xue-jia1， LI Ke-ao2， JI Zhi-hong2， TIAN Shu-ge1 （1.College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China；2.Xinjiang Qikang Habo Uygur Medicine Company， Urumqi 830026， China）
Abstract：Objective To establish an HPLC method for the content determination of gallic acid and kaempferol-3-O-rutinoside in Nymphaea candida Presl.. Methods The separation was carried out on a Wondasil C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was methanol-0.1% acetic acid solution， with gradient elution；the flow rate was 1.0 mL/min；the detection wavelength was set at 270 nm；the column temperature was 30 ℃. Results The linear ranges of gallic acid and kaempferol-3-O-rutinoside were 0.065-0.585 μg （r=0.999 1）， 0.133-1.197 μg （r=0.999 5）， respectively. The average recoveries of gallic acid and kaempferol-3-O-rutinoside were 102.71%， 102.08%， with RSD of 1.97%， 0.46%， respectively. Conclusion This method was rapid， accurate， and reliable. It can be used for the determination of allic acid and kaempferol-3-O-rutinoside in Nymphaea candida Presl..
Key words：Nymphaea candida Presl.；gallic acid；kaempferol-3-O-rutinoside；HPLC；content determination
睡莲花为睡莲科雪白睡莲Nymphaea candida
基金项目：乌鲁木齐市科技计划项目（C121120001）
通讯作者：田树革，E-mail：tsgyz@sina.com
Presl.的干燥花蕾，分布于我国新疆的南部地区，具有降热止咳、益心护脑、安神止痛功效，临床主要用于感冒发热、头痛咳嗽、咽痛等表症[1-2]。睡莲花是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要药物，含
参考文献：
[1] 钟可，何建亿.葛根不同炮制品中总黄酮的含量测定[J].贵阳中医学院学报，2004，26（4）：59.
[2] 宋炜，高卫华.葛根素的药理作用解析及临床用途[J].中外医疗， 2011，30（4）：139.
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[4] 王孝涛，叶定江.历代中药炮制法汇典：古代部分[M].南昌：江西科学技术出版社，1986：141-142.
[5] 黄伟强，金哲雄，张贵君，等.葛根止泻作用研究[J].黑龙江医药， 2009，22（6）：821-824.
[6] 尹丽红，李艳枫，孟繁琳.葛根的化学成分，药理作用和临床应用[J].黑龙江医药，2010，23（3）：371-373.
[7] 白东义，佟春玲，韩慧.葛根素的药理作用及其临床应用研究进展[J].江苏中医药，2009，41（3）：76-78.
[8] 张彤，马玮芸，陶建生，等.多指标综合评分法优选栀子炭炮制工艺[J].中国药师，2007，10（4）：322-324. （收稿日期：2013-11-15；编辑：陈静）
有大量黄酮类和酚酸化合物。其黄酮类化合物的生物活性广泛而温和，具有抗菌、消炎、抑制血小板聚集、抗凝及抗血栓形成等作用[3-4]。本试验参考相关文献[5-8]，建立高效液相色谱法（HPLC）测定睡莲花中没食子酸和烟花苷含量的方法，为睡莲花的进一步开发利用提供参考。
1 仪器与试药
LC-6AD型高效液相色谱仪，CBM-20A型色谱工作站，SPD-20A型紫外检测器，SIL-20A型自动进样器，CTO-10ASvp型柱温箱（日本岛津公司）；XS105型电子天平（德国梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
烟花苷对照品（含量>97%）由新疆药物研究所赵军博士提供，没食子酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，含量>98%）。睡莲花药材采购于新疆奇康哈博维药有限公司，经新疆医科大学中医学院药用植物学讲师徐海燕鉴定为睡莲科雪白睡莲Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾，粉碎，过20目筛，备用。甲醇（色谱纯，飞世尔实验器材有限公司），其他试剂均为分析纯，水为饮用纯净水（娃哈哈集团有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）和0.1%冰乙酸混合水溶液（B）。梯度程序：0～10 min，90%～75%B；10～25 min，75%～55%B；25～35 min，55%～45%B；35～50 min，45%～0%B。流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃。色谱图见图1。
A
B
注：A.混合对照品；B.供试品；1.没食子酸；2.烟花苷
图1 睡莲花中没食子酸和烟花苷HPLC图
2.2 对照品溶液的制备
精密称取没食子酸对照品6.50 mg、烟花苷对照品5.31 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成浓度分别为0.650 mg/mL没食子酸、0.531 mg/mL烟花苷的对照品储备液。分别吸取1 mL没食子酸对照品储备液、2.5 mL烟花苷对照品储备液，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，即得没食子酸0.065 mg/mL、烟花苷0.133 mg/mL的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取1 g睡莲花药材粉末，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇，称定质量，超声处理（功率80 W，频率100 Hz）30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，取滤液，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得。
2.4 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液1、3、5、7、9 ?L，进样分析，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。得到没食子酸线性回归方程Y=3 177 785.34X-34 770.85（r=0.999 1），烟花苷线性回归方程Y=2 027 945.39X-17 934.95 （r=0.999 5）。结果表明，没食子酸及烟花苷进样量分别在0.065～0.585 ?g、0.133～1.197 ?g范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液5 ?L，连续进样6次，结果没食子酸及烟花苷峰面积RSD分别为0.76%、0.98%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一睡莲花供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样5 ?L测定，结果没食子酸峰面积RSD=2.37%，烟花苷峰面积RSD=2.29%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.7 重复性试验
称取睡莲花样品6份，按“2.3”项下方法配制，并在“2.1”项色谱条件下进样5 ?L进行测定。结果供试品溶液中没食子酸及烟花苷含量的RSD分别为0.35%、1.92%，表明本方法的重复性较好。
2.8 加样回收率试验
分别称取6份已知含量的睡莲花药材粉末，每份约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入没食子酸对照品及烟花苷对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样5 ?L测定，结果没食子酸平均回收率为102.71%（RSD=1.97%），烟花苷平均回收率为102.08%（RSD=0.46%）。
3 讨论
本试验对样品的提取方法进行了考察。提取溶剂分别采用甲醇、乙醇及70%乙醇，对睡莲花中没食子酸和烟花苷的测定结果没有明显影响，但以甲醇作为溶剂时色谱峰较多，故选用甲醇作为提取溶剂。分别采用超声、煎煮两种提取方式，设定不同的提取时间，对没食子酸和烟花苷的含量进行测定，结果超声30 min为最佳提取方式。
分别对甲醇和乙腈作为流动相对样品的分离效果进行了对比，结果以甲醇-0.1%冰乙酸混合水溶液为流动相进行梯度洗脱、检测波长为270 nm时，样品色谱峰峰型、分离度等均较理想。结果表明，3批睡莲花中没食子酸和烟花苷含量没有明显差异。
本试验采用HPLC测定睡莲花中没食子酸和烟花苷含量，该方法重复性、稳定性较好，专属性强，检测可排除其他非测定物质的干扰，测定结果准确，可作为同时测定维药睡莲花中没食子酸、烟花苷化学成分的检测标准，为睡莲花的质量控制提供了试验数据。
参考文献：
[1] 刘勇民.维吾尔药志：下册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社， 1999：541.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[S].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：41.
[3] 赵军，何金华，闫明，等.维药睡莲花化学成分研究[J].中国中药杂志， 2007，32（12）：1232-1234.
[4] 金晓红，耿伟，桂红武，等.睡莲花总黄酮超声提取工艺研究[J].医药导报，2011，30（11）：1487-1489.
[5] 王东东，刘宏炳，宋海龙，等.HPLC法测定阜康阿魏根和叶中阿魏酸的含量[J].新疆医科大学学报，2012，35（9）：1139-1142.
[6] 叶光明，姜云云，陈云红.HPLC法同时测定芦笋黄酮中5种黄酮苷的含量[C]//第十一届江苏省药师周大会论文集.常州：常州出版社，2011.
[7] 常占瑛，马桂芝，高晓黎.HPLC法测定新疆不同产地石榴皮中没食子酸的含量[J].新疆医科大学学报，2009，32（11）：1552-1556.
[8] 任源，堵年生.HPLC测定没食子中没食子酸的含量[J].华西药学杂志， 2005，20（1）：71-72.
（收稿日期：2014-01-06；编辑：陈静）