【摘 要】
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打开文本图片集 摘要：目的：构建携带MC1R基因的重组腺相关病毒并探究小鼠海马齿状回中过表达MC1R基因对小鼠长期记忆的影响。方法：获取小鼠目的基因MC1R。使用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切AAV载体质粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a及目的基因，使用T4DNAligase进行连接，连接产物转化stbl3感受态细胞并筛选阳性克隆pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，并进行测序验证。将构建的pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、P
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摘要：目的：构建携带MC1R基因的重组腺相关病毒并探究小鼠海马齿状回中过表达MC1R基因对小鼠长期记忆的影响。方法：获取小鼠目的基因MC1R。使用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切AAV载体质粒pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a及目的基因，使用T4DNAligase进行连接，连接产物转化stbl3感受态细胞并筛选阳性克隆pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，并进行测序验证。将构建的pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R、PAAV-DJ/8、pHelper质粒转染至HEK293T细胞进行病毒包装及纯化并利用Q-PCR检测病毒滴度。纯化后的病毒通过立体定位注射到小鼠海马齿状回中，表达14天以上后，验证该病毒是否能够提高小鼠海马区的MC1R基因表达，并检测小鼠在旷场实验及条件性恐惧实验中的行为学改变。结果：rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R过表达病毒构建成功，滴度约为1.1*1010，立体定位注射到小鼠海马齿状回中至少14天后小鼠海马齿转回中能表达绿色荧光蛋白，并能显著提高小鼠海马中MC1R基因的表达。进一步的，过表达MC1R基因对小鼠旷场实验中的自发活动、焦虑状态均无影响，但显著提高条件性恐惧实验中的僵立水平。结论：本研究成功构建了重组腺相关病毒rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R，通过立体定位注射，该病毒显著提高小鼠海马齿状回中MC1R基因的表达，并增强小鼠的长期记忆。我们的结果说明MC1R基因可能是一个记忆损伤类疾病如阿尔兹海默症的一个潜在治疗靶点。
关键词：MC1R;腺相关病毒;海马齿状回;
【中图分类号】G644.5 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）12--03
前言：黑素皮质素1受體（MC1R）是一种环腺苷单磷酸刺激g蛋白偶联受体（GPCR）[1-4]，同时是MSH（α、β、γ）和ATCH的受体[1，2，5-7]，调节黑色素的形成，通过控制cAMP信号从而影响黑色素细胞[8]，通过黑色素合成途径调节皮肤生理。研究发现MC1R基因的改变与阿尔兹海默症[9]、帕金森病[9]有密切的相关性，最新研究表明，激活MC1R在不同的通路中可以减轻IHC所致的神经炎症、在自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中发挥神经保护作用[10]、以及减弱蛛网膜下腔出血的症状[11]。WeilinXu等人发现，在IHC后的小胶质细胞、星形胶质细胞、表皮细胞中均有表达，并且通过激活MC1R可以减少小胶质细胞的数量[12]。以上实验均表明，黑素皮质素-1受体（MC1R）不仅与神经系统疾病密切相关，并且MC1R的激活在几种神经疾病中均有明显的抗炎和神经保护作用。Genecard数据库中表明MC1R在神经系统中尤其是大脑中的表达水平较高，但是在大脑中明确的生理功能以及作用机制并不清楚。由于以上众多的研究已经证明MC1R在大脑、脊髓中都有发挥作用，本研究采用腺相关病毒PAAV，构建含有小鼠MC1R基因的腺相关病毒载体（rAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R），通过感染小鼠大脑海马齿状回区域，验证MC1R基因的表达效果，为MC1R相关疾病，可能是包括阿尔兹海默症在内的长期记忆损伤等相关疾病提供治疗靶点。
一、材料与方法
（一）材料
大肠杆菌DH5α、Stbl3感受态购自康体生命公司;重组腺病毒构建系统（DJ/8包装系统）购自CELLBIOLABs公司（美国）、HEK293T细胞由中国科学院深圳先进技术研究院李红昌课题组惠赠;EcoRI、HindIII酶，T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶、DMEM/HighGlucose培养基、胰酶、胎牛血清、青霉素、链霉素等购自ThermoFisherScientific公司（美国）;RNA提取试剂盒购自生工;逆转录试剂盒购自promega公司（美国）;质粒DNA提取试剂盒购、AAV纯化试剂盒购自biomiga公司（美国）;小鼠脑立体定位仪购自瑞沃德公司;冰冻切片机购自ThermoFisherScientific公司（美国）;旷场、条件恐惧、软件及硬件均购自上海欣软公司。
（二）实验方法
1.目的基因的获取
腹腔注射水合氯醛麻醉C57小鼠后，灌注取脑，使用trizol提取的方法快速抽提总RNA，按照promega公司的逆转录试剂盒说明书使用所提取的总RNA逆转录为cDNA。
2.重组腺相关病毒（rAAV）表达载体pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R的构建
PCR纯化产物和pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a（自己构建）使用EcoRI和HindIII在37℃水浴中进行双酶切，pAAV-CaMKIIα-eGFP-Dnmt3a所得酶切大片段，和PCR酶切所得目的基因在T4DNA连接酶的作用下连接22℃、2小时，所得连接产物转化stbl3感受态（连接产物），冰浴后放入无抗LB培养基复苏，复苏完成后，取适量已转化好的的感受态细胞涂抹于Amp+药液的LB平板上37℃培养过夜，24小时后挑选阳性单克隆的单个菌落，接种于含Amp+药液的培养液中培养24小时，提取质粒进行酶切鉴定，鉴定大小正确的质粒样品送到华大基因进行测序。
3.pAAV-CaMKIIα-eGFP-MC1R腺相关病毒的包装、纯化和滴度测定
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