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摘 要 针对目前我国蒙药材质量标准相对落后、检测指标不能代表蒙药材质量的真实情况的现状，利用现代科技方法对蒙药材常用品种“金莲花”的鉴别和含量测定进行了探索。主要利用薄层色谱法摸索了金莲花药材的定性鉴别条件，利用高效液相色谱法摸索了金莲花药材中绿原酸的含量测定条件，还进行了绿原酸含量测定的方法学验证。实验证明，定性鉴别和含量测定的方法可行、条件合适，可以作为金莲花药材质量标准的检验方法。还拟订了金莲花药材质量标准草案，供有关部门在制定相应标准时参考。
关键词 蒙药材 金莲花 绿原酸 质量标准 薄层色谱法 高效液相色谱法
实验条件选择
实验仪器：①仪器：美国Alltech高效液相色谱仪，Alltech426PLC泵，Alltech UVIS200型检测器，Alltech ChromStation色谱工作站，Diamonsil C18色谱柱(5μ 200×4.6mm)，KQ3200DB型数控超声波清洗器。②试剂：乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。③对照品：绿原酸（供含量检测用）。
性状：为金莲花药材外观形态的描述。本实验参考《内蒙古蒙药材标准》1987［1］,对三个产地的金莲花药材进行了实际观察和分析，客观地描述了金莲花药材外观形态的主要特征。
鉴别（1）：为金莲花药材植物组织形态的鉴别。主要参考了《中国药典》2000年版一部［3］和“金莲花的生药学研究”［2］，对金莲花药材粉末的组织形态进行了显微观察和分析比较，实际描述了金莲花药材粉末的组织形态要点。
鉴别（2）：为金莲花药材中绿原酸的LC鉴别。除参考《中国药典》2000年版一部［3］等有关资料外，主要参考了“薄层扫描法测定复方金莲花口服液中绿原酸的含量”［4］的薄层色谱条件。①提取条件：采用了超声处理、浸泡过夜、萃取、水浴回流、过聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱等不同条件进行了对比实验。②吸附剂：采用了硅胶G薄层板和聚酰胺薄膜进行了比较。③展开系统：选用了八种展开剂进行了对比实验。醋酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上层液；醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)；醋酸丁酯-甲酸-水(7∶4∶3)的上层液；乙醇-丙酮-水(7∶5∶6)的上层液；醋酸乙酯-氯仿-甲酸(6∶2∶2)；石油醚-醋酸乙酯(6∶4)；环已烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸(6∶15∶15∶4)；36% 醋酸。④检视条件：选用了紫外光灯（365nm）下检视和10%的氯化铝溶液、饱和氨蒸气、5%的香草醛硫酸溶液等五种显色剂。
实验证明，鉴别（2）的实验条件为“醋酸乙酯水浴回流1小时，硅胶G薄层板，以醋酸丁酯-甲酸-水（14∶5∶5）的上层溶液为展开剂，紫外光灯（365nm）下检视”，效果比较理想，Rf值0.42，比较适中。
含量测定：采用PLC法测定有效成分绿原酸的方法，主要参考《中国药典》2000年版一部［3］的方法，具有分离好、灵敏度高、准确度高等优点。①检测波长的选择：参考有关文献，绿原酸的紫外吸收一般在327nm。经光谱测定实验验证，绿原酸的最大吸收波长是327nm。故含量测定中的测定波长定为327nm。②流动相的选择：对二种流动相作了实验比较，甲醇-水-冰醋酸-三乙氨（15∶85∶1∶0.3），乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）。经试验确证，选用乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）为流动相，出峰时间适当，色谱峰峰形理想。绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5；按绿原酸峰计算，理论塔板数（n）为2000以上。③供试品的制备：分别进行了超声处理、加乙醇回流、盐酸酸性乙醇回流、加醋酸乙酯回流等实验方法，实验确证，盐酸酸性乙醇回流的提取条件最理想。④空白实验：同时取乙醇加流动相的空白溶液进样，结果表明，空白溶液在绿原酸色谱峰位置处无色谱峰出现。
经实验考察，金莲花药材中绿原酸含量测定的实验条件确定为：盐酸酸性乙醇回流的提取，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）作为流动相；流速为1ml/分；柱温为30℃；检测波长327nm；进样量10μl。
含量测定方法
线性范围的考察：取绿原酸对照品约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇10ml使溶解，加流动相至刻度，摇匀。精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。按2.5的色谱条件进行测定，以峰面积值对进样量进行回归分析，结果绿原酸在1.936～11.616μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=26284X-1074.4，r=0.9999（Y为峰面积积分值，X为对照品量），结果见表1。
精密度试验：取阿盟1号样品溶液按上述含量测定色谱条件，连续进样5次，测定样品中绿原酸峰面积积分值。RSD﹤2%，结果见表2。
稳定性实验：取阿盟1号样品按上述含量测定方法，制备供试品溶液，于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时分别进样10μl，测得样品中绿原酸峰面积积分值，RSD﹤2%。试验结果表明，样品溶液在8小时内稳定性良好。
重复性实验：取样品按上述含量测定方法，分别制备样品溶液，测得峰面积积分值并计算含量，RSD﹤2%。结果，平均含量0.0312%，RSD=0.536。
加样回收实验：取已知绿原酸含量的样品6份，每份1.5g，精密称定，分别加入绿原酸对照品适量，精密称定。按上述含量测定方法制备供试品溶液，分别测定氯原酸的含量，计算回收率。结果平均回收率为98.0%，RSD为0.53%。
样品含量测定：取供试品3g，精密称定，按上述含量测定方法制备供试品溶液，测定并计算供试品中绿原酸的含量，结果阿盟1平均含量0.0312%，阿盟2平均含量0.0311%，锡盟平均含量0.0142%。
讨论
大部分文献记载金莲花的活性成分主要为黄酮类化合物（例：荭草苷、牡荆苷）和绿原酸，多采用分光光度法测定总黄铜类化合物，也有部分文献采用薄层色谱法对其黄酮类成分进行定量分析。由于没有荭草苷、牡荆苷对照品，故无法对金莲花中的荭草苷或牡荆苷的PLC法进行分析研究。而绿原酸有国家指定的对照品，本实验选择了绿原酸作为金莲花鉴别和含量测定的对象。
金莲花鉴别（2）选择用醋酸乙酯回流法而不选择其他提取方法，是因为该方法对绿原酸的提取效率较高，薄层色谱中绿原酸的斑点明显。而其他提取方法的提取不充分，在薄层鉴别试验中在与对照品相应的位置上没有明显的斑点或斑点颜色较浅。
在摸索测定含量实验条件时选择了两种不同的流动相进行实验，用甲醇-水-冰醋酸-三乙氨（15∶85∶1∶0.3）作为流动相，所得色谱峰峰形不理想；用乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）和（10∶90）作为流动相，所得色谱峰出峰时间不合适（25分钟以上）；而用乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）作为流动相时，出峰时间适当（5分钟左右），色谱峰峰形比较理想。
含量测定的方法学考察中，线性范围的考察等各实验的结果较好，相关系数和RSD值都非常理想。说明本实验所选择的含量测定方法及条件是可行的，可以作为金莲花药材质量标准中含量测定的方法。
参考文献
1 内蒙古蒙药材标准，1986：440.
2 山西医科大学学报，2001，2-26-32（1）：27-28.
3 中国药典.一部.2000：177，419-420，474，488.
4 中医药学报，1998，5：50.
关键词 蒙药材 金莲花 绿原酸 质量标准 薄层色谱法 高效液相色谱法
实验条件选择
实验仪器：①仪器：美国Alltech高效液相色谱仪，Alltech426PLC泵，Alltech UVIS200型检测器，Alltech ChromStation色谱工作站，Diamonsil C18色谱柱(5μ 200×4.6mm)，KQ3200DB型数控超声波清洗器。②试剂：乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。③对照品：绿原酸（供含量检测用）。
性状：为金莲花药材外观形态的描述。本实验参考《内蒙古蒙药材标准》1987［1］,对三个产地的金莲花药材进行了实际观察和分析，客观地描述了金莲花药材外观形态的主要特征。
鉴别（1）：为金莲花药材植物组织形态的鉴别。主要参考了《中国药典》2000年版一部［3］和“金莲花的生药学研究”［2］，对金莲花药材粉末的组织形态进行了显微观察和分析比较，实际描述了金莲花药材粉末的组织形态要点。
鉴别（2）：为金莲花药材中绿原酸的LC鉴别。除参考《中国药典》2000年版一部［3］等有关资料外，主要参考了“薄层扫描法测定复方金莲花口服液中绿原酸的含量”［4］的薄层色谱条件。①提取条件：采用了超声处理、浸泡过夜、萃取、水浴回流、过聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱等不同条件进行了对比实验。②吸附剂：采用了硅胶G薄层板和聚酰胺薄膜进行了比较。③展开系统：选用了八种展开剂进行了对比实验。醋酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上层液；醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)；醋酸丁酯-甲酸-水(7∶4∶3)的上层液；乙醇-丙酮-水(7∶5∶6)的上层液；醋酸乙酯-氯仿-甲酸(6∶2∶2)；石油醚-醋酸乙酯(6∶4)；环已烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸(6∶15∶15∶4)；36% 醋酸。④检视条件：选用了紫外光灯（365nm）下检视和10%的氯化铝溶液、饱和氨蒸气、5%的香草醛硫酸溶液等五种显色剂。
实验证明，鉴别（2）的实验条件为“醋酸乙酯水浴回流1小时，硅胶G薄层板，以醋酸丁酯-甲酸-水（14∶5∶5）的上层溶液为展开剂，紫外光灯（365nm）下检视”，效果比较理想，Rf值0.42，比较适中。
含量测定：采用PLC法测定有效成分绿原酸的方法，主要参考《中国药典》2000年版一部［3］的方法，具有分离好、灵敏度高、准确度高等优点。①检测波长的选择：参考有关文献，绿原酸的紫外吸收一般在327nm。经光谱测定实验验证，绿原酸的最大吸收波长是327nm。故含量测定中的测定波长定为327nm。②流动相的选择：对二种流动相作了实验比较，甲醇-水-冰醋酸-三乙氨（15∶85∶1∶0.3），乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）。经试验确证，选用乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）为流动相，出峰时间适当，色谱峰峰形理想。绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5；按绿原酸峰计算，理论塔板数（n）为2000以上。③供试品的制备：分别进行了超声处理、加乙醇回流、盐酸酸性乙醇回流、加醋酸乙酯回流等实验方法，实验确证，盐酸酸性乙醇回流的提取条件最理想。④空白实验：同时取乙醇加流动相的空白溶液进样，结果表明，空白溶液在绿原酸色谱峰位置处无色谱峰出现。
经实验考察，金莲花药材中绿原酸含量测定的实验条件确定为：盐酸酸性乙醇回流的提取，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）作为流动相；流速为1ml/分；柱温为30℃；检测波长327nm；进样量10μl。
含量测定方法
线性范围的考察：取绿原酸对照品约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇10ml使溶解，加流动相至刻度，摇匀。精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。按2.5的色谱条件进行测定，以峰面积值对进样量进行回归分析，结果绿原酸在1.936～11.616μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=26284X-1074.4，r=0.9999（Y为峰面积积分值，X为对照品量），结果见表1。
精密度试验：取阿盟1号样品溶液按上述含量测定色谱条件，连续进样5次，测定样品中绿原酸峰面积积分值。RSD﹤2%，结果见表2。
稳定性实验：取阿盟1号样品按上述含量测定方法，制备供试品溶液，于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时分别进样10μl，测得样品中绿原酸峰面积积分值，RSD﹤2%。试验结果表明，样品溶液在8小时内稳定性良好。
重复性实验：取样品按上述含量测定方法，分别制备样品溶液，测得峰面积积分值并计算含量，RSD﹤2%。结果，平均含量0.0312%，RSD=0.536。
加样回收实验：取已知绿原酸含量的样品6份，每份1.5g，精密称定，分别加入绿原酸对照品适量，精密称定。按上述含量测定方法制备供试品溶液，分别测定氯原酸的含量，计算回收率。结果平均回收率为98.0%，RSD为0.53%。
样品含量测定：取供试品3g，精密称定，按上述含量测定方法制备供试品溶液，测定并计算供试品中绿原酸的含量，结果阿盟1平均含量0.0312%，阿盟2平均含量0.0311%，锡盟平均含量0.0142%。
讨论
大部分文献记载金莲花的活性成分主要为黄酮类化合物（例：荭草苷、牡荆苷）和绿原酸，多采用分光光度法测定总黄铜类化合物，也有部分文献采用薄层色谱法对其黄酮类成分进行定量分析。由于没有荭草苷、牡荆苷对照品，故无法对金莲花中的荭草苷或牡荆苷的PLC法进行分析研究。而绿原酸有国家指定的对照品，本实验选择了绿原酸作为金莲花鉴别和含量测定的对象。
金莲花鉴别（2）选择用醋酸乙酯回流法而不选择其他提取方法，是因为该方法对绿原酸的提取效率较高，薄层色谱中绿原酸的斑点明显。而其他提取方法的提取不充分，在薄层鉴别试验中在与对照品相应的位置上没有明显的斑点或斑点颜色较浅。
在摸索测定含量实验条件时选择了两种不同的流动相进行实验，用甲醇-水-冰醋酸-三乙氨（15∶85∶1∶0.3）作为流动相，所得色谱峰峰形不理想；用乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）和（10∶90）作为流动相，所得色谱峰出峰时间不合适（25分钟以上）；而用乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80）作为流动相时，出峰时间适当（5分钟左右），色谱峰峰形比较理想。
含量测定的方法学考察中，线性范围的考察等各实验的结果较好，相关系数和RSD值都非常理想。说明本实验所选择的含量测定方法及条件是可行的，可以作为金莲花药材质量标准中含量测定的方法。
参考文献
1 内蒙古蒙药材标准，1986：440.
2 山西医科大学学报，2001，2-26-32（1）：27-28.
3 中国药典.一部.2000：177，419-420，474，488.
4 中医药学报，1998，5：50.