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摘要 为了明确黑龙江省水稻纹枯病菌遗传多样性，为水稻抗病育种和水稻纹枯病的综合防治提供依据。本文对采自13个水稻种植地区的29个水稻纹枯病菌菌株进行了致病力测定和AFLP分析。结果表明9对AFLP引物对供试菌株扩增出396条带，其中多态性带187条，占总扩增带数的47.22％。黑龙江省水稻纹枯病菌的遗传距离变化在0.50～0.92之间，平均为0.71，群体遗传多样性较为丰富。UPGMA法可以将供试菌株分成4个AFLP聚类组群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，相同地理来源的菌株基本上聚集在同一组群内，表明AFLP类群划分与菌株的地理来源有较强的相关性。黑龙江省水稻纹枯病菌致病性分化较为明显，并且AFLP类群划分与菌株的致病性鉴定之间存在一定相关性。
关键词 水稻纹枯病菌；AFLP；致病力；遗传多样性
中图分类号S 435.111.42
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia sola-ni Kuhn)，引起的一种世界性水稻病害，也是目前水稻生产危害最严重的病害之一。水稻是黑龙江省的重要粮食作物，种植面积达到220万hm2以上，占全省粮食作物种植面积的22％。近些年来，由于施肥水平的提高和不注重此病的防治，使纹枯病的危害日趋严重，发病严重地块，损失达20％～30％。了解病原菌的遗传多样性对于更好地理解病害的发生和流行以及进一步预测病害的发展是十分必要的。虽然国内外已有一些研究者采用不同的方法对纹枯病群体进行了研究，但目前国内外关于该病原菌的遗传聚类群与其致病力、地理来源的关系，至今结论不一。AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism)标记技术是结合了RFLP的准确性和PCR的高效性的一种DNA指纹技术。AFLP技术以其重复性好、效率高的特点已被广泛应用于动物、植物研究，也成功地应用于植物病原真菌研究中，但在水稻纹枯病菌的研究中未见报道。因此，本研究利用AFLP技术从分子水平上对黑龙江省水稻纹枯病菌的遗传分化进行分析，并测定其致病力，探讨黑龙江省水稻纹枯病菌群体遗传结构特征及地理来源与致病力之间的关系，为水稻抗病育种和水稻纹枯病的综合防治提供依据。
1 材料与方法
1.1供试菌株
根据黑龙江省农业气候生态区划类型，按水稻主产区不同生态条件，在黑龙江水稻主产区13市县的稻田采集了具有典型症状的水稻纹枯病病株206份，经室内常规分离纯化，采用番红染色法，镜检各菌株细胞核数目以区分双核和多核丝核菌，根据Parmeter等人描述的立枯丝核菌种的鉴定标准，通过核相观察与形态观察对菌株进行鉴定，共获得29个水稻纹枯病菌菌株(表1)。
1.2致病力测定
采用温室人工接种测定不同菌株的致病力。接种方法采用牙签接种法。具体如下：用经过高压灭菌的1.0cm长牙签接种病菌，在PDB培养基上培养3d。然后，用镊子将牙签嵌入稻株自上向下第3叶鞘内侧。病级调查标准参照国际水稻研究所的0～9级标准。供试水稻品种为粳稻合江19号。
1.3菌丝培养和DNA提取
将菌株接种到装有100mLPDB(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)培养基的250mL三角瓶中，25℃静置培养4d，在菌核形成前收集菌丝。菌丝基因组DNA的提取参照周而勋等的方法。
1.4 AFLP试验
采用Vos等的方法。选择性扩增用EcoRI和MseI双酶切，EcoRI引物E-AAC、E-ACT和E-ACG与MseI引物M-CAA、M-CAT和M-CTC组合的9个组合作为选择扩增引物组合。利用5％聚丙烯酰胺变性胶进行电泳，80W恒功率电泳1.5h。银染检测扩增产物。
1.5数据分析
对电泳结果采用有带记为“1”、无带记为“0”的方法记录谱带。利用NTSYS分析软件计算两两菌株间的Dice相似系数，并利用UPGMA法进行聚类分析，建立聚类树状图。
2 结果分析
2.1致病力鉴定
由表1可以看出，供试的29个菌株对水稻品种合江19都有致病性，并且水稻纹枯病菌菌株之间的致病力存在不同程度差异，按菌株的平均病级大小划分为强、中、弱3种类型：强致病力菌株3个，占10.3％；中等致病力菌株18个，占62.1％；弱致病力菌株8个，占27.6％。致病力与地理分布存在一定的相关性，采自桦川县、萝北县、富锦和庆安县的菌株致病力相对较弱。
2.2水稻纹枯病菌株遗传多样性分析
试验使用9对引物对29个供试水稻纹枯病菌菌株进行AFLP分析，均获得清晰AFLP谱带(图1)。9对引物组合产生条带总数为396条，其中多态性条带为187条，占总扩增带数的47.22％。应用NTSYS软件对扩增出的187条多态性条带进行分析，结果显示黑龙江省水稻纹枯病菌Dice相似系数在0.5～0.92之间，平均为0.71，说明黑龙江省水稻纹枯病菌遗传分化比较大，群体遗传多样性较为丰富。利用AFLP分析得到的分子标记可将不同地理来源的菌株区分开。在Dice相似系数0.62水平上，供试的29个菌株可以划分为4个类群(图2)。类群工分别由来自勃利、宝清和桦南的6个菌株组成，BL-1与来自桦南的2个菌株HN-1和HN-2关系较近。类群Ⅱ为宁安、尚志和五常菌株，其中来自宁安的2个菌株分化较大，并且宁安菌株与尚志菌株的关系较近。来自虎林、密山和鸡东的菌株为类群Ⅲ，该类群可进一步分为3个亚群，其中HL-2与其他菌株的遗传距离较远，独立成为一个亚群；在其他两个亚群中，菌株HL-3与MS-3、JD-1与MS-2、JD-2与MS-1关系较近。来自萝北、桦川、富锦和庆安的菌株组成类群Ⅳ，其中桦川和富锦两地菌株的关系较近。
2.3 AFLP类群分析与菌株致病力关系
从图2的聚类结果可以发现，在Dice相似系数0.56水平上，29个菌株可分为两大类群。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为一大类群，这一类群是由中等致病力和强致病力菌株组成；由来自萝北、桦川、富锦和庆安的菌株弱致病力菌株组成类群Ⅳ。这说明菌株的地理分布与菌株的遗传距离有一定的相关性。同一类群的菌株由于其亲缘关系较近，因而表现出较为一致的致病力，说明纹枯病菌的AFLP类群与菌株的致病力有一定的相关性。
3 讨论
3.1水稻纹枯病菌的遗传多样性
基于本试验研究结果，黑龙江省水稻纹枯病菌的遗传相似系数变化在0.50～0.92之间，平均为0.71，从分子水平上证明水稻纹枯病菌群体遗传多样性比较丰富。这与广东、云南和福建省水稻纹枯病菌一样。导致黑龙江省水稻纹枯病菌遗传多样性复杂原因可能有以下几个方面。(1)黑龙江 省水稻种植品种多样化，主栽品种多达49个品种(系)，各地区主栽品种差异较大。由于寄主与病原菌在进化过程中相互依存，品种的多样化对纹枯病菌的长期选择使当地菌株发生突变，形成了适应相应品种的菌株。AFLP聚类群工的来源地主栽品种以9031、空育131、绥粳4号、富士光、系选1号为主；聚类群Ⅱ的来源地以松粳二号、龙选93-8、长粒香、五优一号、五稻三号作为主栽品种；聚类群Ⅲ的来源地主栽品种为空育131、垦鉴稻7号、松粳6号、垦稻10；聚类群Ⅳ的来源地以垦稻12、垦稻10、龙粳14、空育131、牡丹江19、绥粳4作为主栽品种。易润华等研究也证明了纹枯病菌菌株亲缘关系与寄主有一定的相关性。(2)黑龙江省各稻区的气候差异导致形成适应当地自然条件的新菌株。黑龙江省稻区主要分布在3个农业气候带，即温凉农业气候带(桦川、富锦、萝北、庆安)、温和农业气候带(宝清、桦南、勃利、鸡东、虎林、密山和尚志)和温暖农业气候带(宁安、五常)。由于自然环境和农业生态条件对水稻纹枯病菌基因型的分布具有一定的选择压力，造成不同地区菌株的遗传分化程度高，而同一地区的菌株所面临的环境选择压力相同，因而分化程度低，因此，相同地理来源的菌株间亲缘关系较近，而不同地理来源的菌株间遗传差异较大。(3)菌核随种子传入其他地区也可能是导致黑龙江省水稻纹枯病菌遗传多样性丰富的原因之一。从图2可以看到，类群Ⅲ的遗传结构较为复杂，出现了相同地理来源菌株的遗传距离较远，而一些不同来源菌株的遗传距离反而较近。这一现象与虎林、密山和鸡东三地水稻互相调种较为频繁有很大关系。频繁的引种过程增加了两地菌株的迁移，从而使纹枯病菌的群体间产生随机遗传漂变效应，使这个群体菌株与原群体产生较大差异。
3.2 AFLP类群与纹枯病菌致病力之间的关系
植物病原菌的遗传宗谱与其致病谱之间是否有一定的关系是植物病理学的研究热点之一。在分子水平上研究纹枯病菌的群体遗传结构可以从DNA水平探究病原菌的变异规律，寻找病菌系谱与致病性的关系，克服依据鉴别寄主来区分病菌生理小种的方法的局限性。目前人们对水稻纹枯病菌遗传多样性的了解较少，国内外只有少数报道，且结论不一。Pascual等研究结果表明，纹枯病菌菌株间毒力差异和RAPD聚类有一定程度的一致性，而易润华等研究表明纹枯病菌菌株的致病力与菌株的亲缘关系不大。本研究结果表明，在Dice相似系数0.56水平上，纹枯病菌菌株间毒力差异和AFLP聚类有一定程度的一致性。
由于R.solani的异核现象导致了其多变性，即使是属于同一融合亚群的水稻纹枯病菌的菌株间也存在致病性变异与生理分化现象。尽管目前对纹枯病菌克服水稻抗病性可能是由于遗传改变导致新致病性类型产生的推论还没有充足的证据，但是病菌遗传结构复杂的群体显然更容易克服寄主的抗病性，因此揭示纹枯病菌的真实遗传背景必然有助于减少水稻抗纹枯病育种的盲目性，提高品种布局的合理性，从而利于增加抗病品种的持久性。目前，运用分子标记技术对水稻纹枯病菌群体遗传结构的研究已经取得了一些进展，但是要解决水稻纹枯病抗性弱的问题，必须进一步监测水稻纹枯病菌群体遗传结构的变化规律，掌握其变化动态和潜在的变化趋势，同时也要明确水稻抗性品种的防御机制，并将水稻纹枯病菌遗传结构和水稻抗病品种遗传特性结合起来进行研究，这种研究策略才更科学、更有意义。
关键词 水稻纹枯病菌；AFLP；致病力；遗传多样性
中图分类号S 435.111.42
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia sola-ni Kuhn)，引起的一种世界性水稻病害，也是目前水稻生产危害最严重的病害之一。水稻是黑龙江省的重要粮食作物，种植面积达到220万hm2以上，占全省粮食作物种植面积的22％。近些年来，由于施肥水平的提高和不注重此病的防治，使纹枯病的危害日趋严重，发病严重地块，损失达20％～30％。了解病原菌的遗传多样性对于更好地理解病害的发生和流行以及进一步预测病害的发展是十分必要的。虽然国内外已有一些研究者采用不同的方法对纹枯病群体进行了研究，但目前国内外关于该病原菌的遗传聚类群与其致病力、地理来源的关系，至今结论不一。AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism)标记技术是结合了RFLP的准确性和PCR的高效性的一种DNA指纹技术。AFLP技术以其重复性好、效率高的特点已被广泛应用于动物、植物研究，也成功地应用于植物病原真菌研究中，但在水稻纹枯病菌的研究中未见报道。因此，本研究利用AFLP技术从分子水平上对黑龙江省水稻纹枯病菌的遗传分化进行分析，并测定其致病力，探讨黑龙江省水稻纹枯病菌群体遗传结构特征及地理来源与致病力之间的关系，为水稻抗病育种和水稻纹枯病的综合防治提供依据。
1 材料与方法
1.1供试菌株
根据黑龙江省农业气候生态区划类型，按水稻主产区不同生态条件，在黑龙江水稻主产区13市县的稻田采集了具有典型症状的水稻纹枯病病株206份，经室内常规分离纯化，采用番红染色法，镜检各菌株细胞核数目以区分双核和多核丝核菌，根据Parmeter等人描述的立枯丝核菌种的鉴定标准，通过核相观察与形态观察对菌株进行鉴定，共获得29个水稻纹枯病菌菌株(表1)。
1.2致病力测定
采用温室人工接种测定不同菌株的致病力。接种方法采用牙签接种法。具体如下：用经过高压灭菌的1.0cm长牙签接种病菌，在PDB培养基上培养3d。然后，用镊子将牙签嵌入稻株自上向下第3叶鞘内侧。病级调查标准参照国际水稻研究所的0～9级标准。供试水稻品种为粳稻合江19号。
1.3菌丝培养和DNA提取
将菌株接种到装有100mLPDB(马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)培养基的250mL三角瓶中，25℃静置培养4d，在菌核形成前收集菌丝。菌丝基因组DNA的提取参照周而勋等的方法。
1.4 AFLP试验
采用Vos等的方法。选择性扩增用EcoRI和MseI双酶切，EcoRI引物E-AAC、E-ACT和E-ACG与MseI引物M-CAA、M-CAT和M-CTC组合的9个组合作为选择扩增引物组合。利用5％聚丙烯酰胺变性胶进行电泳，80W恒功率电泳1.5h。银染检测扩增产物。
1.5数据分析
对电泳结果采用有带记为“1”、无带记为“0”的方法记录谱带。利用NTSYS分析软件计算两两菌株间的Dice相似系数，并利用UPGMA法进行聚类分析，建立聚类树状图。
2 结果分析
2.1致病力鉴定
由表1可以看出，供试的29个菌株对水稻品种合江19都有致病性，并且水稻纹枯病菌菌株之间的致病力存在不同程度差异，按菌株的平均病级大小划分为强、中、弱3种类型：强致病力菌株3个，占10.3％；中等致病力菌株18个，占62.1％；弱致病力菌株8个，占27.6％。致病力与地理分布存在一定的相关性，采自桦川县、萝北县、富锦和庆安县的菌株致病力相对较弱。
2.2水稻纹枯病菌株遗传多样性分析
试验使用9对引物对29个供试水稻纹枯病菌菌株进行AFLP分析，均获得清晰AFLP谱带(图1)。9对引物组合产生条带总数为396条，其中多态性条带为187条，占总扩增带数的47.22％。应用NTSYS软件对扩增出的187条多态性条带进行分析，结果显示黑龙江省水稻纹枯病菌Dice相似系数在0.5～0.92之间，平均为0.71，说明黑龙江省水稻纹枯病菌遗传分化比较大，群体遗传多样性较为丰富。利用AFLP分析得到的分子标记可将不同地理来源的菌株区分开。在Dice相似系数0.62水平上，供试的29个菌株可以划分为4个类群(图2)。类群工分别由来自勃利、宝清和桦南的6个菌株组成，BL-1与来自桦南的2个菌株HN-1和HN-2关系较近。类群Ⅱ为宁安、尚志和五常菌株，其中来自宁安的2个菌株分化较大，并且宁安菌株与尚志菌株的关系较近。来自虎林、密山和鸡东的菌株为类群Ⅲ，该类群可进一步分为3个亚群，其中HL-2与其他菌株的遗传距离较远，独立成为一个亚群；在其他两个亚群中，菌株HL-3与MS-3、JD-1与MS-2、JD-2与MS-1关系较近。来自萝北、桦川、富锦和庆安的菌株组成类群Ⅳ，其中桦川和富锦两地菌株的关系较近。
2.3 AFLP类群分析与菌株致病力关系
从图2的聚类结果可以发现，在Dice相似系数0.56水平上，29个菌株可分为两大类群。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为一大类群，这一类群是由中等致病力和强致病力菌株组成；由来自萝北、桦川、富锦和庆安的菌株弱致病力菌株组成类群Ⅳ。这说明菌株的地理分布与菌株的遗传距离有一定的相关性。同一类群的菌株由于其亲缘关系较近，因而表现出较为一致的致病力，说明纹枯病菌的AFLP类群与菌株的致病力有一定的相关性。
3 讨论
3.1水稻纹枯病菌的遗传多样性
基于本试验研究结果，黑龙江省水稻纹枯病菌的遗传相似系数变化在0.50～0.92之间，平均为0.71，从分子水平上证明水稻纹枯病菌群体遗传多样性比较丰富。这与广东、云南和福建省水稻纹枯病菌一样。导致黑龙江省水稻纹枯病菌遗传多样性复杂原因可能有以下几个方面。(1)黑龙江 省水稻种植品种多样化，主栽品种多达49个品种(系)，各地区主栽品种差异较大。由于寄主与病原菌在进化过程中相互依存，品种的多样化对纹枯病菌的长期选择使当地菌株发生突变，形成了适应相应品种的菌株。AFLP聚类群工的来源地主栽品种以9031、空育131、绥粳4号、富士光、系选1号为主；聚类群Ⅱ的来源地以松粳二号、龙选93-8、长粒香、五优一号、五稻三号作为主栽品种；聚类群Ⅲ的来源地主栽品种为空育131、垦鉴稻7号、松粳6号、垦稻10；聚类群Ⅳ的来源地以垦稻12、垦稻10、龙粳14、空育131、牡丹江19、绥粳4作为主栽品种。易润华等研究也证明了纹枯病菌菌株亲缘关系与寄主有一定的相关性。(2)黑龙江省各稻区的气候差异导致形成适应当地自然条件的新菌株。黑龙江省稻区主要分布在3个农业气候带，即温凉农业气候带(桦川、富锦、萝北、庆安)、温和农业气候带(宝清、桦南、勃利、鸡东、虎林、密山和尚志)和温暖农业气候带(宁安、五常)。由于自然环境和农业生态条件对水稻纹枯病菌基因型的分布具有一定的选择压力，造成不同地区菌株的遗传分化程度高，而同一地区的菌株所面临的环境选择压力相同，因而分化程度低，因此，相同地理来源的菌株间亲缘关系较近，而不同地理来源的菌株间遗传差异较大。(3)菌核随种子传入其他地区也可能是导致黑龙江省水稻纹枯病菌遗传多样性丰富的原因之一。从图2可以看到，类群Ⅲ的遗传结构较为复杂，出现了相同地理来源菌株的遗传距离较远，而一些不同来源菌株的遗传距离反而较近。这一现象与虎林、密山和鸡东三地水稻互相调种较为频繁有很大关系。频繁的引种过程增加了两地菌株的迁移，从而使纹枯病菌的群体间产生随机遗传漂变效应，使这个群体菌株与原群体产生较大差异。
3.2 AFLP类群与纹枯病菌致病力之间的关系
植物病原菌的遗传宗谱与其致病谱之间是否有一定的关系是植物病理学的研究热点之一。在分子水平上研究纹枯病菌的群体遗传结构可以从DNA水平探究病原菌的变异规律，寻找病菌系谱与致病性的关系，克服依据鉴别寄主来区分病菌生理小种的方法的局限性。目前人们对水稻纹枯病菌遗传多样性的了解较少，国内外只有少数报道，且结论不一。Pascual等研究结果表明，纹枯病菌菌株间毒力差异和RAPD聚类有一定程度的一致性，而易润华等研究表明纹枯病菌菌株的致病力与菌株的亲缘关系不大。本研究结果表明，在Dice相似系数0.56水平上，纹枯病菌菌株间毒力差异和AFLP聚类有一定程度的一致性。
由于R.solani的异核现象导致了其多变性，即使是属于同一融合亚群的水稻纹枯病菌的菌株间也存在致病性变异与生理分化现象。尽管目前对纹枯病菌克服水稻抗病性可能是由于遗传改变导致新致病性类型产生的推论还没有充足的证据，但是病菌遗传结构复杂的群体显然更容易克服寄主的抗病性，因此揭示纹枯病菌的真实遗传背景必然有助于减少水稻抗纹枯病育种的盲目性，提高品种布局的合理性，从而利于增加抗病品种的持久性。目前，运用分子标记技术对水稻纹枯病菌群体遗传结构的研究已经取得了一些进展，但是要解决水稻纹枯病抗性弱的问题，必须进一步监测水稻纹枯病菌群体遗传结构的变化规律，掌握其变化动态和潜在的变化趋势，同时也要明确水稻抗性品种的防御机制，并将水稻纹枯病菌遗传结构和水稻抗病品种遗传特性结合起来进行研究，这种研究策略才更科学、更有意义。