【摘 要】
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目的 探讨转染与筛选技术获取稳定携带有HPV11基因组DNA的细胞的可能性.方法 对含有pBR322.HPV11质粒的大肠杆菌培养扩增,然后进行质粒的提取与纯化,并用限制性内切酶BamH Ⅰ切割下HPV11全长基因.低熔点琼脂糖回收后,用T4 DNA连接酶进行线状DNA的自身环化,再与pIK-neo质粒、用Lipofectamine试剂共转染HaCaT细胞.通过G418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆
【机 构】
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武汉大学中南医院皮肤科,430071,210042,南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所,210042,南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所
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目的 探讨转染与筛选技术获取稳定携带有HPV11基因组DNA的细胞的可能性.方法 对含有pBR322.HPV11质粒的大肠杆菌培养扩增,然后进行质粒的提取与纯化,并用限制性内切酶BamH Ⅰ切割下HPV11全长基因.低熔点琼脂糖回收后,用T4 DNA连接酶进行线状DNA的自身环化,再与pIK-neo质粒、用Lipofectamine试剂共转染HaCaT细胞.通过G418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆细胞合并与培养扩增后,用FQ-PCR技术检测细胞内HPV11DNA的存在,用巢式RT-PCR技术检测HPV11E1^E4 mRNA的表达.结果 HPV11型基因组DNA转染至HaCaT细胞后,经G418筛选约2周,培养皿内即可见对G418抵抗的阳性细胞克隆出现,其形态与普通HaCaT细胞相似.用FQ-PCR在筛选后的HaCaT细胞中检测到HPV11DNA的存在,平均病毒DNA载量为(15.9±16.8)拷贝/细胞.传代3次后细胞内病毒DNA无丢失,载量为(23.9±1.1)拷贝/细胞.与未传代细胞相比,二者间差异无统计学意义(t=-0.822,P>0.05).巢式RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV11 E1^E4 mRNA表达的特异性628 bp条带.结论 HPV11基因组DNA可通过脂质体转染法成功导入HaCaT细胞内,通过筛选可获得阳性细胞,且经3次传代后HPV11DNA仍然存在。
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