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【摘要】目的：建立反相色谱法测定依替巴肽的氨基酸比值。方法：采用以 6- 氨基喹啉- N- 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）與各氨基酸柱前定量衍生后，经反相色谱测定。结果：在范围内各氨基酸的线性关系良好，精密度，溶液稳定性，回收率均良好。结论：该方法准确可靠，重现性好，易于操作，可用于依替巴肽中氨基酸组成的测定。
【关键词】AccQ- Tag；依替巴肽；氨基酸比值
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish an HPLC method for determination of Amino acid ratio in eptifibatide . METHODS：the 6-amino decoquinate-N-hydroxyl succinyl imide formicether （ AQC） was taken as the derivative reagent to make for the column quantitative derivatization with each amino acid and then to elute by Reverse phase chromatography.RESULTS：Good linearities were obtained for all amino acids.The method showed high selectivity，good repeatability，accuracy and stability . CONCLUSION：The method is simple and rapid and it is applicable for determination of Amino acid ratio in eptifibatide.
KEY WORDS AccQ- Tag； ptifibatide；Amino acid ratio；
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）01-0015-02
氨基酸比值测定是多肽药物质量控制的重要环节，也是多肽原料药质量标准的重要组成部分，通过测定多肽药物的氨基酸理论个数比，从侧面佐证多肽的结构。因此，对氨基酸比值的分析，可为多肽的结构确证提供理论指导。建立准确可靠的氨基酸比值分析方法是一项有意义的工作。国内外研究和应用于实际样品中氨基酸比值分析的方法主要是色谱方法， 包括离子交换法、 反相高效液相色谱法、 气相色谱法[1]， 按检测方法可分为化学分析法、 电化学方法、 分光光度法等， 按衍生反应的先后， 可分为柱前衍生[2]和柱后衍生法。氨基酸分析仪是柱后衍生反相高效液相色谱法的代表，已有很广泛的应用。在柱前衍生反相高效液相色谱法方面，不同的衍生剂对应不同的方法，是目前研究的主体模式。笔者采用 WATERS 公司的 AccQ- Tag 试剂包[3]作为构建方法的基本条件，通过优化依替巴肽中氨基酸的前处理和色谱条件，以 6- 氨基喹啉- N- 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂与各氨基酸柱前定量衍生后，再经普通C18柱梯度洗脱， 建立了依替巴肽中氨基酸比值的 AccQ- Tag 测试方法， 应用于实际样品的分析。结果表明， 此方法具有专属性，灵敏度高、 重现性好。
1 实验部分
1.1仪器及试药
L-门冬氨酸（批号：A0546）、甘氨酸（批号：G0099）、L-高精氨酸（批号：GJ01）、L-脯氨酸（批号：P0481）、L-胱氨酸（批号：C0519）对照品均购于：东京化成工业株式会社；依替巴肽原料药（批号：20071019 连云港宏创药业有限公司）； AccQ- Tag试剂盒（Waters）；乙腈、磷酸为色谱纯，三乙胺、盐酸、氢氧化钠、无水乙酸钠，乙二胺四乙酸钠均为分析纯。
Agilent 1200系列（G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B紫外-可见光检测器），Agilent化学工作站；梅特勒XS105 电子分析天平 ；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
1.2 实验方法
1.2.1 AccQ-Tag 衍生溶液的制备 取衍生化试剂（2A）加人1ml乙腈，于55℃恒温鼓风干燥箱内使溶解，得衍生溶液。
1.2.2 供试品溶液的制备 取依替巴肽原料药约10.5mg，于裂解瓶中，加入5mL 6mol/L的盐酸溶液，充氮密闭，于120℃条件下反应24小时，取出放置至室温，用氢氧化钠溶液中和至中性，转移至50ml量瓶中，用水定容，精密移取100μl置进样瓶中，加入700μl硼砂缓冲溶液，再加入200μl已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，放入已恒温至55℃的电热恒温鼓风干燥箱中，反应10分钟后，作为供试品溶液。
1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取门冬氨酸（Asp）对照品16.6mg，甘氨酸（Gly）对照品9.4mg，高精氨酸（Harg）对照品28.0mg，脯氨酸（Pro）对照品14.4mg，胱氨酸（Cys）对照品15.0mg，置于50ml量瓶中，用水溶解并稀释到刻度，混匀；精密移取2ml置裂解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，充氮密闭，于120℃条件下反应24小时，取出放置至室温，用NaOH中和至中性，转移20ml量瓶中，用水定容，用水稀释到刻度，混匀；精密移取100μl置进样瓶中，加入700μl硼砂缓冲溶液，再加入200μl已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，放入已恒温至55℃的电热恒温鼓风干燥箱中，反应10分钟后，取出放置至室温，作为对照品溶液。
1.2.4色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L醋酸钠缓冲液（取乙酸钠11.5g，溶于900ml水中，加入1ml 1mg/ml乙二胺四乙酸二钠，再加入2.4ml三乙胺，磷酸调pH值至4.95，加水至1000ml）为流动相A；乙腈-水（60∶40）为流动相B；检测波长254nm；进样体积10μl；流速1.0mL/min；柱温37℃。；采用梯度洗脱： 2结果与讨论
2.1系统适用性试验
以衍生化后的对照品溶液检查系统适应性，按 “1.2.4”色谱条件，连续进 5 针对照品溶液，门冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、高精氨酸（Harg）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）的衍生化产物依次出峰，色谱图中相邻的两个峰最小分离度符合规定（R≥1.5），分别计算各氨基酸峰面积的相对标准偏差（RSD），结果显示 RSD 值均小于 2. 0%，表明该色谱系统稳定可靠。取：“1.2.2”、“1.2.3”项下两种溶液适量，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示。两种溶液色谱图见图1、2。
2.2方法专属性
为了验证衍生试剂对氨基酸衍生物是否产生干扰，以水为样品，按照 “1. 2. 2”进行衍生，得衍生空白溶液。按照 “1. 2. 1”制备衍生样品溶液，分别进样衍生空白溶液及衍生样品溶液。结果表明，衍生试剂峰对各氨基酸衍生物峰均无干扰，各氨基酸获得良好分离。
2.3检测限与定量限
配置各氨基酸浓度为100μmol/L的贮备液，用纯水稀释分别测定各氨基酸的检测限定量限。
2.4线性与范围
取氨基酸对照品配制成约为供试品浓度10%～500%相应溶液测定氨基酸的线性与范围，结果如下：门冬氨酸浓度在0.99nmol/ml～49.71nmol/ml范围内，线性关系良好（n=7）；A = 18.4477×C+1.9320，r=0.9992。甘氨酸浓度在0.99nmol/ml～102.86nmol/ml范围内，线性关系良好（n=8）；A =25.1343×C+7.5896，r=0.9993精氨酸浓度在1.00nmol/ml～100.27nmol/ml范围内，线性关系良好（n=8）；A = 28.6629×C -11.6078，r=0.9999脯氨酸浓度在1.00nmol/ml～50.17nmol/ml范围内，线性关系良好（n=7）；A = 23.5634×C +4.2263，r=0.9998。
2.5稳定性试验
取样品（批号：20071019），按“1.2.2”項下方法制备供试品溶液，并在室温下放置，分别与2、4、6、8、12、24时进行测定。结果，门冬氨酸浓度平均值为90.32mol/L，SD=0.86%；甘氨酸浓度平均值为86.64mol/L，SD= 0.37%；脯氨酸浓度平均值为87.04mol/L，SD=0.31%；半胱氨酸浓度平均值为108.60mol/L，SD= 0.57%；，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.6重复性试验
取同一样品（批号：20071019），按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定各氨基酸的含量，重复测定6次。门冬氨酸浓度平均值为90.32mol/L，SD=0.86%；甘氨酸浓度平均值为86.64mol/L，SD= 0.37%；脯氨酸浓度平均值为87.04mol/L，SD=0.31%；半胱氨酸浓度平均值为108.60mol/L，SD= 0.57%，表明方法重复性良好。
2.7回收率试验
取样品（批号：20071019），按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，作为回收率基质，分别配置80%、100%与120%的对照品溶液进行加样回收试验，结果如下：门冬氨酸平均回收率为97.9%，RSD为1.71%，甘氨酸平均回收率为94.4%，RSD为1.36%，精氨酸平均回收率为99.7%，RSD为1.65%，脯氨酸平均回收率为100.4%，RSD为1.26%。
2.8样品测定
3 结论
本文建立了HPLC与柱后衍生相结合检测依替巴肽中氨基酸比值的分析方法，对该分析方法进行了方法学验证。实验结果表明，该方法选择性好，具有良好的线性、专属性、准确性和重复性，能快速高效地测定依替巴肽中的氨基酸比值，可满足生产企业及检测机构的实际要求，同时可为其他多肽类药物中氨基酸的检测分析提供参考。
参考文献：
[1]李方楼，姬小明，魏跃伟等.AccQ-Tag-HPLC 法测定烟叶生长过程中游离氨基酸的变化[J].安徽农业科学.2011，39（27）：17010-17012
[2]张 怡，孙晋红，叶汝汉.反相高效液相色谱测定依替巴肽注射液中氨基酸的含量[J].分析测试学报.2013，32（8）：1003-1006
[3]朱伟伟，蓝建京.犀牛角氨基酸组成分析与营养价值评价[J].江苏农业科学.2013，41（4）：289-290
【关键词】AccQ- Tag；依替巴肽；氨基酸比值
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish an HPLC method for determination of Amino acid ratio in eptifibatide . METHODS：the 6-amino decoquinate-N-hydroxyl succinyl imide formicether （ AQC） was taken as the derivative reagent to make for the column quantitative derivatization with each amino acid and then to elute by Reverse phase chromatography.RESULTS：Good linearities were obtained for all amino acids.The method showed high selectivity，good repeatability，accuracy and stability . CONCLUSION：The method is simple and rapid and it is applicable for determination of Amino acid ratio in eptifibatide.
KEY WORDS AccQ- Tag； ptifibatide；Amino acid ratio；
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）01-0015-02
氨基酸比值测定是多肽药物质量控制的重要环节，也是多肽原料药质量标准的重要组成部分，通过测定多肽药物的氨基酸理论个数比，从侧面佐证多肽的结构。因此，对氨基酸比值的分析，可为多肽的结构确证提供理论指导。建立准确可靠的氨基酸比值分析方法是一项有意义的工作。国内外研究和应用于实际样品中氨基酸比值分析的方法主要是色谱方法， 包括离子交换法、 反相高效液相色谱法、 气相色谱法[1]， 按检测方法可分为化学分析法、 电化学方法、 分光光度法等， 按衍生反应的先后， 可分为柱前衍生[2]和柱后衍生法。氨基酸分析仪是柱后衍生反相高效液相色谱法的代表，已有很广泛的应用。在柱前衍生反相高效液相色谱法方面，不同的衍生剂对应不同的方法，是目前研究的主体模式。笔者采用 WATERS 公司的 AccQ- Tag 试剂包[3]作为构建方法的基本条件，通过优化依替巴肽中氨基酸的前处理和色谱条件，以 6- 氨基喹啉- N- 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）为衍生试剂与各氨基酸柱前定量衍生后，再经普通C18柱梯度洗脱， 建立了依替巴肽中氨基酸比值的 AccQ- Tag 测试方法， 应用于实际样品的分析。结果表明， 此方法具有专属性，灵敏度高、 重现性好。
1 实验部分
1.1仪器及试药
L-门冬氨酸（批号：A0546）、甘氨酸（批号：G0099）、L-高精氨酸（批号：GJ01）、L-脯氨酸（批号：P0481）、L-胱氨酸（批号：C0519）对照品均购于：东京化成工业株式会社；依替巴肽原料药（批号：20071019 连云港宏创药业有限公司）； AccQ- Tag试剂盒（Waters）；乙腈、磷酸为色谱纯，三乙胺、盐酸、氢氧化钠、无水乙酸钠，乙二胺四乙酸钠均为分析纯。
Agilent 1200系列（G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B紫外-可见光检测器），Agilent化学工作站；梅特勒XS105 电子分析天平 ；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
1.2 实验方法
1.2.1 AccQ-Tag 衍生溶液的制备 取衍生化试剂（2A）加人1ml乙腈，于55℃恒温鼓风干燥箱内使溶解，得衍生溶液。
1.2.2 供试品溶液的制备 取依替巴肽原料药约10.5mg，于裂解瓶中，加入5mL 6mol/L的盐酸溶液，充氮密闭，于120℃条件下反应24小时，取出放置至室温，用氢氧化钠溶液中和至中性，转移至50ml量瓶中，用水定容，精密移取100μl置进样瓶中，加入700μl硼砂缓冲溶液，再加入200μl已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，放入已恒温至55℃的电热恒温鼓风干燥箱中，反应10分钟后，作为供试品溶液。
1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取门冬氨酸（Asp）对照品16.6mg，甘氨酸（Gly）对照品9.4mg，高精氨酸（Harg）对照品28.0mg，脯氨酸（Pro）对照品14.4mg，胱氨酸（Cys）对照品15.0mg，置于50ml量瓶中，用水溶解并稀释到刻度，混匀；精密移取2ml置裂解瓶中，加入6mol/L的盐酸5ml，充氮密闭，于120℃条件下反应24小时，取出放置至室温，用NaOH中和至中性，转移20ml量瓶中，用水定容，用水稀释到刻度，混匀；精密移取100μl置进样瓶中，加入700μl硼砂缓冲溶液，再加入200μl已配制好的衍生化试剂溶液，混匀后，放入已恒温至55℃的电热恒温鼓风干燥箱中，反应10分钟后，取出放置至室温，作为对照品溶液。
1.2.4色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L醋酸钠缓冲液（取乙酸钠11.5g，溶于900ml水中，加入1ml 1mg/ml乙二胺四乙酸二钠，再加入2.4ml三乙胺，磷酸调pH值至4.95，加水至1000ml）为流动相A；乙腈-水（60∶40）为流动相B；检测波长254nm；进样体积10μl；流速1.0mL/min；柱温37℃。；采用梯度洗脱： 2结果与讨论
2.1系统适用性试验
以衍生化后的对照品溶液检查系统适应性，按 “1.2.4”色谱条件，连续进 5 针对照品溶液，门冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、高精氨酸（Harg）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）的衍生化产物依次出峰，色谱图中相邻的两个峰最小分离度符合规定（R≥1.5），分别计算各氨基酸峰面积的相对标准偏差（RSD），结果显示 RSD 值均小于 2. 0%，表明该色谱系统稳定可靠。取：“1.2.2”、“1.2.3”项下两种溶液适量，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示。两种溶液色谱图见图1、2。
2.2方法专属性
为了验证衍生试剂对氨基酸衍生物是否产生干扰，以水为样品，按照 “1. 2. 2”进行衍生，得衍生空白溶液。按照 “1. 2. 1”制备衍生样品溶液，分别进样衍生空白溶液及衍生样品溶液。结果表明，衍生试剂峰对各氨基酸衍生物峰均无干扰，各氨基酸获得良好分离。
2.3检测限与定量限
配置各氨基酸浓度为100μmol/L的贮备液，用纯水稀释分别测定各氨基酸的检测限定量限。
2.4线性与范围
取氨基酸对照品配制成约为供试品浓度10%～500%相应溶液测定氨基酸的线性与范围，结果如下：门冬氨酸浓度在0.99nmol/ml～49.71nmol/ml范围内，线性关系良好（n=7）；A = 18.4477×C+1.9320，r=0.9992。甘氨酸浓度在0.99nmol/ml～102.86nmol/ml范围内，线性关系良好（n=8）；A =25.1343×C+7.5896，r=0.9993精氨酸浓度在1.00nmol/ml～100.27nmol/ml范围内，线性关系良好（n=8）；A = 28.6629×C -11.6078，r=0.9999脯氨酸浓度在1.00nmol/ml～50.17nmol/ml范围内，线性关系良好（n=7）；A = 23.5634×C +4.2263，r=0.9998。
2.5稳定性试验
取样品（批号：20071019），按“1.2.2”項下方法制备供试品溶液，并在室温下放置，分别与2、4、6、8、12、24时进行测定。结果，门冬氨酸浓度平均值为90.32mol/L，SD=0.86%；甘氨酸浓度平均值为86.64mol/L，SD= 0.37%；脯氨酸浓度平均值为87.04mol/L，SD=0.31%；半胱氨酸浓度平均值为108.60mol/L，SD= 0.57%；，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.6重复性试验
取同一样品（批号：20071019），按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定各氨基酸的含量，重复测定6次。门冬氨酸浓度平均值为90.32mol/L，SD=0.86%；甘氨酸浓度平均值为86.64mol/L，SD= 0.37%；脯氨酸浓度平均值为87.04mol/L，SD=0.31%；半胱氨酸浓度平均值为108.60mol/L，SD= 0.57%，表明方法重复性良好。
2.7回收率试验
取样品（批号：20071019），按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，作为回收率基质，分别配置80%、100%与120%的对照品溶液进行加样回收试验，结果如下：门冬氨酸平均回收率为97.9%，RSD为1.71%，甘氨酸平均回收率为94.4%，RSD为1.36%，精氨酸平均回收率为99.7%，RSD为1.65%，脯氨酸平均回收率为100.4%，RSD为1.26%。
2.8样品测定
3 结论
本文建立了HPLC与柱后衍生相结合检测依替巴肽中氨基酸比值的分析方法，对该分析方法进行了方法学验证。实验结果表明，该方法选择性好，具有良好的线性、专属性、准确性和重复性，能快速高效地测定依替巴肽中的氨基酸比值，可满足生产企业及检测机构的实际要求，同时可为其他多肽类药物中氨基酸的检测分析提供参考。
参考文献：
[1]李方楼，姬小明，魏跃伟等.AccQ-Tag-HPLC 法测定烟叶生长过程中游离氨基酸的变化[J].安徽农业科学.2011，39（27）：17010-17012
[2]张 怡，孙晋红，叶汝汉.反相高效液相色谱测定依替巴肽注射液中氨基酸的含量[J].分析测试学报.2013，32（8）：1003-1006
[3]朱伟伟，蓝建京.犀牛角氨基酸组成分析与营养价值评价[J].江苏农业科学.2013，41（4）：289-290