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摘要： 通過对甘草属乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis）、光果甘草（G. glabra）、胀果甘草（G. inflata）及其人工杂交种组合G. uralensis♀ × G. glabra♂、G. glabra♀ × G. uralensis♂、G. uralensis♀ × G. inflata♂、G. inflata♀ × G. uralensis♂共68份材料的核基因ITS序列、叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA基因的序列分析，探讨了甘草属叶绿体DNA遗传方式。结果表明：（1）亲本种和人工杂交种ITS序列长度均为614 bp，其中34份人工杂交种ITS序列存在4处变异位点，且人工杂交种均检测出来自父本、母本ITS序列相同位点碱基的叠加，检测率为100%。（2）亲本种与人工杂交种的叶绿体基因rbcL、matK、trnHpsbA序列长度相同，共有4处变异位点，人工杂交种在变异位点处的碱基与其相对应的父本碱基一致率高达97.1%。以上结果说明，该研究获得34份人工杂交种为100%杂交成功的F1子代，核基因ITS序列可用于甘草属杂交种的遗传鉴定；甘草属叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA基因具有父系遗传特性，推测甘草属质体的遗传方式主要表现为父系遗传，这种质体遗传方式的发现为甘草属杂交种和遗传多样性研究提供了新的认识，也为杂交种的亲本鉴定提供分子依据。
关键词： 甘草属，种间杂交， ITS， 叶绿体DNA， 父系遗传
中图分类号： Q943，Q37文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）02016208
Abstract： The goal of this paper was to have a better understanding of chloroplast inheritance patterns and identify the hybrid parent in Glycyrrhiza. A total of 68 individuals of Glycyrrhiza were selected including 34 parental species， G. uralensis， G. glabra， G. inflata and 34 artificial interspecific crosses， G. uralensis♀ × G. glabra♂， G. glabra♀ × G. uralensis♂， G. uralensis♀ × G. inflata♂ and G. inflata♀ × G. uralensis♂. Thirtyfour artificial interspecific crosses were performed and the sequence polymorphisms of chloroplast DNA （cpDNA） and internal transcribed spacer （ITS） of nuclear gene of parents and progenies were studied. Sequence analysis showed that ITS sequences of parents and progenies had the same length of 614 bp and altogether four variable sites， with three genotypes. Two different ITS sequence copies at four variable sites were found in each individual of F1 hybrids， one from the paternal and the other from the female parent， about which the detection ratio was 100%. It suggested that 34 artificial interspecific crosses produced successful F1 hybrids in this research and genetic trait of ITS could infer parents of Glycyrrhiza. Sequence analysis showed that the cpDNA rbcL， matK and trnHpsbA sequences of parents and artificial interspecific crosses had the same length， within a total of four variable sites and six genotypes. Two different cpDNA haplotypes were found in Glycyrrhiza. The cpDNA haplotypes of F1 hybrids matched those of the male parents and that ratio was up to 97.1%， indicating that the genetic trait was mainly inherited from the paternal parent. This result demonstrated that the chloroplast inheritance pattern of Glycyrrhiza was mostly paternal inheritance， which provides new insights into the use of cpDNA markers in studies of natural hybrids and genetic polymorphism in Glycyrrhiza. Key words： Glycyrrhiza， interspecific crossing， ITS， chloroplast DNA， paternal inheritance
豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza L.）植物全世界约20种，主要分布在中亚、北美及东欧，我国甘草属植物以新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为主要分布区（李学禹和陆嘉惠，2015）。相关研究均提出在甘草属中可能存在自然杂交种，张鹏云和彭泽祥（1960）根据甘草的形态推测，认为存在胀果甘草（Glycyrrhiza inflate）和乌拉尔甘草（G. uralensis）的天然雜交种；而苏联学者认为自然界存在光果甘草（G. glabra）与乌拉尔甘草（G. uralensis）的杂交种（李学禹，1993）；谢良碧等（2014）通过甘草属种间杂交亲和性分析和杂交种的幼苗形态观察，提出同域分布区内的乌拉尔甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）、胀果甘草（G. inflata），由于花期重叠，共有传粉昆虫，种间有自然杂交的可能；李晓岚等（2015）利用ESTSSR分子标记技术，构建甘草属植物遗传分化聚类图，结果表明存在G. inflata × G. uralensis或者G. inflata × G. glabra的天然杂交种。但有关疑似杂交种的杂交起源及其亲本的推断，目前仍需要进一步寻找证据。自然杂交种父本、母本的确定是揭示其杂交起源和分类地位的关键。由于核DNA是双亲遗传，比较核DNA序列组成，通常能够找出其双亲起源，例如位于核糖体18S rDNA和26S rDNA基因间隔的ITS序列（李小娟等，2007； Steiner & Cruz，2009）。大多被子植物的叶绿体DNA通过雌配子以母系遗传的方式传递（胡适宜，1997； 方晓华等，2003； Zhang et al，2003），比较杂交个体及其可能亲本的叶绿体DNA序列，可以揭示其母本起源（余姣君等，2014； 王莹等，2015）。但也有一些类群叶绿体基因被证明为父系遗传，例如大部分的裸子植物（Neale & Sederoff，1989； 刘兴梁和胡适宜，1995； Gou et al，2005），被子植物中的胡萝卜属（Boblenz et al，1990）、牵牛属（胡赞民等，1996）、猕猴桃属（Testolin & Cipriani，1997）、蒺藜属（Yang et al，2000）等。甘草属植物的叶绿体基因为母系遗传还是父系遗传？尚未见有相关报道。阐明甘草属叶绿体基因遗传特性，才能准确、客观地对杂交种的父本、母本做出科学判断，为揭示疑似杂交种的杂交起源和分类地位提供依据。
本研究在前期研究已获得的甘草属种间杂交种幼苗的基础上（谢良碧等，2014），以不同杂交组合的子代及其已知亲本为材料，通过核DNA的ITS和叶绿体DNA的rbcL、matK、trnHpsbA片段扩增和测序，分析了亲本种及杂交种的序列。其主要目的在于：（1）通过双亲遗传的ITS序列分析，筛选出杂交成功，含有已知父本、母本基因的F1代，以用于叶绿体遗传规律的分析。（2）通过叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA基因的分析，揭示亲本和F1代叶绿体DNA遗传方式。（3）在以上研究基础上，分析甘草属ITS及叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA序列在甘草属杂交种的鉴定研究中的应用价值，为甘草属疑似杂交种的鉴定及其分类地位探讨提供分子依据。
1材料与方法
1.1 材料
用于测序分析的材料包括34个亲本种和34个人工杂交种：乌拉尔甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）、胀果甘草（G. inflata）和正反交人工杂交种G. uralensis♀ × G. glabra♂、G. glabra♀ × G. uralensis♂、G. uralensis♀ × G. inflata♂、G. inflata♀ × G. uralensis♂，共68份。取亲本种植株的成熟健康叶片和人工杂交后获得的杂交种幼苗的新鲜叶片，采集后迅速用硅胶干燥，待叶片彻底干燥后存放于-20 ℃冰箱备用。
1.2 方法
每份材料，称取叶片20 mg研磨成粉状，用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根公司），按说明书操作提取总DNA。
核DNA的ITS序列和叶绿体DNA中rbcL、matK、trnHpsbA序列引物参照Kondo et al（2007）的设计，引物经生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增反应在Biometera 070851 PCR仪上进行。采用50 μL的PCR反应体系：TaKaRa PrimeSTAR Max DNA Polymerase （北京六合通经贸有限公司）25 μL，引物各2 μL，模板DNA 4 μL，最后超纯水（ddH2O）补足至50 μL。PCR反应条件为98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共36个循环，最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测片段后，在凝胶成像仪上观察，切下目的条带，经凝胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]回收处理后，送往北京六合华大基因科技股份有限公司，采用ABI 3700型自动测序仪进行重复测序。
1.3 数据分析
测序结果使用SnapGene观察峰图后，借助MEGA 4.0进行人工校对，手动删除不可信的位点，并用DNAman软件进行多序列比对及分析。通过豆科中的锦鸡儿属（侯鑫等，2008）、甘草属ITS序列的研究（刘春生等，2005），确定本实验的ITS序列边界，对照峰图，手工筛选碱基叠加位点，分析杂交位点。叶绿体基因型的确定，参照Kondo et al（2007）的设计。 2结果与分析
2.1 ITS序列分析
亲本种和人工杂交种共68份的核基因ITS序列测序结果表明，其长度均为614 bp。如图1所示，ITS有4种多态性位点，其中ITS1含有1处变异位点；ITS2含有3处变异位点。根据变异位点分析，可以将核基因ITS基因型分为3种，分别是I1、I2、I3型，其中I2型为杂合型（表1）。乌拉尔甘草的17个样本均有4处变异位点，分别为187（C）、411（T）、412（G）、413（C），显示了种内较高的保守性；光果甘草和胀果甘草具有相同的变异位点，均为187（T）、411（C）、412（A）、413（A），说明其亲缘关系较近；34份人工杂交种在4个变异位点处均出现其亲本种的叠加峰现象，分别为187（Y）、411（Y）、412（L）、413（M），应为杂合位点，说明已经获得成功的人工杂交种。
2.2 叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA基因序列分析
亲本种和人工杂交种的叶绿体基因测序结果经比对、剪切后，得到rbcL、matK、trnHpsbA序列长度分别为124、96、177 bp，共有4处变异位点，有6种基因型（表2），其中rbcL有2种基因型，为R1、R4；matK有2种基因型为M1、M2；trnHpsbA有2种基因型为T1、T2。如图24所示，乌拉尔甘草17个样本，基因型均为R1、M1、T1，记为H1型，所测叶绿体基因片段一致，说明该物种种内保守性较高；光果甘草和胀果甘草叶绿体基因型为R4、M2、T2，记为H2型，说明光果甘草和胀果甘草亲缘关系较近；人工杂交种rbcL序列为2处碱基替换突变；matK序列为1处碱基缺失突变；trnHpsbA序列有1处碱基替换突变。人工杂交种的叶绿体DNA与其母本的基因型相同的个数为1株，占总体人工杂交种的比例为2.9%，而与其相对应的父本基因型相同的个数为33株，占总体人工杂交种的比例为97.1%（表2，图2-4）。故人工杂交种叶绿体DNA遗传方式主要表现为父系遗传。
3讨论
3.1 核基因ITS序列在甘草属植物杂交种鉴定的应用
随着分子技术的发展，核基因ITS序列测序技术也应用到杂交种的鉴定中。ITS序列为双亲遗传，子代在双亲相同位点会出现碱基的叠加（范文月等，2011）。该序列被认为是鉴定杂交种有用的分子标记基因（严容，2009）。通常，如果一些植物类群的疑难种是杂交造成的，则在这些疑难种ITS序列的突变位点中会检测到其双亲碱基的叠加，进而可以对疑似亲本做出判断。如杨威等（2011）借助ITS序列分析，揭示了自然杂交种的亲本为兴安白头翁和朝鲜白头翁；吴杰等（2015）对分布于云南的旱柳和云南柳之间的自然杂交种进行研究，结果表明疑似杂交种ITS序列的基因型为疑似亲本的嵌合体。以上研究表明，核基因ITS序列能揭示一些疑似杂交种的真实身份。本研究中，亲本种和人工杂交种的ITS序列长度均为614 bp，34个人工杂交种的ITS序列均有4处杂合位点，均表现为相应亲本种的碱基叠加，这与Kondo et al（2007）对甘草属野生疑似杂交种及其自然种群的乌拉尔甘草、光果甘草及胀果甘草ITS序列分析的4个变异位点的研究结果是一致的。因此，本研究所获得的人工杂交种是可信并可进一步用于双亲与子代遗传关系的分析。同时，本研究对可控双亲及人工杂交后代的ITS序列分析的结果，也将为揭示自然界甘草属杂交现象和杂交种鉴定提供更有利的分子证据。
3.2 甘草属叶绿体DNA父系遗传的推定
到目前为止，关于豆科植物叶绿体DNA遗传方式的研究报道表明，该科不同属、种的质体遗传方式并不一致：Parker（1934）通过对菜豆花叶突变体杂交的实验，首次证明了菜豆质体遗传方式为双亲遗传；之后一些学者借助细胞学的方法，证明豌豆（刘兴梁和胡适宜，1995）、大豆、野生大豆（胡适宜，1997）、菜豆（刘兴梁，1997）的质体遗传方式为母系遗传；父系遗传的报道仅见苜蓿属的紫花苜蓿（Schumann & Hancock，1989； Masoud et al，1990； Dudas et al，2012）。本研究通过对甘草属已知亲本种及其杂交种的叶绿体基因中rbcL、matK、trnHpsbA片段的序列分析，共得到4处变异位点，基因型可分成两种，一种类型为H1型，另一种为H2型。正反交的人工杂交种的叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA的变异位点、基因型与其相应父本的基因型一致率高达97.1%。以上结果表明，甘草属叶绿体中的rbcL、matK、trnHpsbA片段主要为父系遗传。初步推测甘草属的质体遗传方式主要表现为父系遗传，而是否为低、高频父系遗传，还有待进一步研究和验证。
3.3 甘草属叶绿体基因遗传的复杂性
在同属植物中质体的遗传方式基本一致，所以叶绿体基因遗传方式在属内是可以推测的（Zhong et al，2011）。本研究中叶绿体遗传方式为父系遗传的比率高达97.1%，说明在甘草属中主要表现为父系遗传；其次，叶绿体遗传方式表现为母系遗传的比率为2.9%，说明甘草属叶绿体基因遗传方式并不是单向的父系或母系遗传，而是混合的，但以父系遗传为主，这种混合的叶绿体遗传模式在猕猴桃等其它双子叶植物均有发现（Li et al，2013； Anja et al，2015）。叶绿体基因遗传方式的多樣性可能会降低杂交频率和转移基因渐渗的方向（Li et al，2013），影响种群结构和物种的遗传分化。甘草属植物叶绿体基因遗传的复杂性的发现，将为进一步对该属种群结构、遗传分化及物种进化的研究提供了有力证据。
3.4 甘草属叶绿体基因父系遗传方式对物种遗传多样性的影响
叶绿体是绿色植物质体的主要类型，叶绿体DNA为母系遗传的植物，在同一母株上形成的后代，其叶绿体单倍型是完全一致的。但叶绿体DNA为父系遗传方式的植物，如果自然环境中有稳定的花粉传播途径，如风媒或虫媒，可以使叶绿体单倍型通过花粉散布，这样，同一母株上有多个父系的叶绿体单倍型，因而可能比母系遗传植物具有更高的叶绿体单倍型多态性（张田等，2007）。现已证明在裸子植物中父系遗传较为普遍（Neale & Sederoff，1989； 刘兴梁和胡适宜，1995； Gou et al，2005），此遗传方式，也为裸子植物遗传多样性提供了证据。在被子植物中，猕猴桃属叶绿体遗传方式前期被认为是严格的父系遗传（Testolin & Cipriani，1997； Cipriani et al，1995； Chat et al，1999），后Li et al （2013）通过AFLP和测序技术对猕猴桃属种间杂交植物进行研究，得出猕猴桃属叶绿体不仅具有父系遗传的特性，还具有母系及双亲遗传的特性。猕猴桃属虫媒或风媒的混合传粉，使该属植物维持了较高水平的遗传多样性，同时也是一个具有自然杂交和基因渐渗的类群（张田等，2007； Li et al，2002； Chat et al，2004）。由此可见，叶绿体DNA为父系遗传的植物类群，其遗传多样性的组成应该比母系遗传的类群更为复杂和丰富。 在前期研究工作中，对甘草属自然种群的繁殖系统和杂交现象、遗传多样性研究与猕猴桃属植物研究结果相似，其种间过渡类型复杂（李学禹和陆嘉惠，2015），同域分布种存在花期重叠、杂交亲和现象（廖云海，2011； 田润炜等，2013），种间杂交亲和性最高可达96.67%（谢良碧等，2014）。较高的种间亲和性使种间花粉交流变得更为频繁，本研究发现的叶绿体父系遗传方式则使这种由花粉流动而带来的遗传基因的变化更为丰富。可以推测，在属内的同域种分布区，种间和种内由于频繁的花粉交流，其叶绿体单倍型在同一母株的不同花序或果序上将会呈现多样性。这不仅丰富了种内的遗传多样性，也使种间的杂交和遗传变异更为复杂。因此，甘草属叶绿体父系遗传的特性和种间较高的杂交亲和度，使花粉流在不同个体间、种内和种间进出，基因的频繁交流是导致甘草属野生种群种内较高的遗传多样性（李晓岚等，2015； 张富民，1995； 陆嘉惠等，2006）和种间过渡类型大量出现的原因之一，也是导致该属成为疑难种和争议种较多的“困难属”的原因。本研究发现的甘草属叶绿体主要为父系遗传特性，将为科学、客观地对自然杂交种的杂交起源和亲本鉴定提供有力依据，同时也为被子植物尤其是双子叶豆科植物的物种进化和演化提供了新的资料。
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关键词： 甘草属，种间杂交， ITS， 叶绿体DNA， 父系遗传
中图分类号： Q943，Q37文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）02016208
Abstract： The goal of this paper was to have a better understanding of chloroplast inheritance patterns and identify the hybrid parent in Glycyrrhiza. A total of 68 individuals of Glycyrrhiza were selected including 34 parental species， G. uralensis， G. glabra， G. inflata and 34 artificial interspecific crosses， G. uralensis♀ × G. glabra♂， G. glabra♀ × G. uralensis♂， G. uralensis♀ × G. inflata♂ and G. inflata♀ × G. uralensis♂. Thirtyfour artificial interspecific crosses were performed and the sequence polymorphisms of chloroplast DNA （cpDNA） and internal transcribed spacer （ITS） of nuclear gene of parents and progenies were studied. Sequence analysis showed that ITS sequences of parents and progenies had the same length of 614 bp and altogether four variable sites， with three genotypes. Two different ITS sequence copies at four variable sites were found in each individual of F1 hybrids， one from the paternal and the other from the female parent， about which the detection ratio was 100%. It suggested that 34 artificial interspecific crosses produced successful F1 hybrids in this research and genetic trait of ITS could infer parents of Glycyrrhiza. Sequence analysis showed that the cpDNA rbcL， matK and trnHpsbA sequences of parents and artificial interspecific crosses had the same length， within a total of four variable sites and six genotypes. Two different cpDNA haplotypes were found in Glycyrrhiza. The cpDNA haplotypes of F1 hybrids matched those of the male parents and that ratio was up to 97.1%， indicating that the genetic trait was mainly inherited from the paternal parent. This result demonstrated that the chloroplast inheritance pattern of Glycyrrhiza was mostly paternal inheritance， which provides new insights into the use of cpDNA markers in studies of natural hybrids and genetic polymorphism in Glycyrrhiza. Key words： Glycyrrhiza， interspecific crossing， ITS， chloroplast DNA， paternal inheritance
豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza L.）植物全世界约20种，主要分布在中亚、北美及东欧，我国甘草属植物以新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为主要分布区（李学禹和陆嘉惠，2015）。相关研究均提出在甘草属中可能存在自然杂交种，张鹏云和彭泽祥（1960）根据甘草的形态推测，认为存在胀果甘草（Glycyrrhiza inflate）和乌拉尔甘草（G. uralensis）的天然雜交种；而苏联学者认为自然界存在光果甘草（G. glabra）与乌拉尔甘草（G. uralensis）的杂交种（李学禹，1993）；谢良碧等（2014）通过甘草属种间杂交亲和性分析和杂交种的幼苗形态观察，提出同域分布区内的乌拉尔甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）、胀果甘草（G. inflata），由于花期重叠，共有传粉昆虫，种间有自然杂交的可能；李晓岚等（2015）利用ESTSSR分子标记技术，构建甘草属植物遗传分化聚类图，结果表明存在G. inflata × G. uralensis或者G. inflata × G. glabra的天然杂交种。但有关疑似杂交种的杂交起源及其亲本的推断，目前仍需要进一步寻找证据。自然杂交种父本、母本的确定是揭示其杂交起源和分类地位的关键。由于核DNA是双亲遗传，比较核DNA序列组成，通常能够找出其双亲起源，例如位于核糖体18S rDNA和26S rDNA基因间隔的ITS序列（李小娟等，2007； Steiner & Cruz，2009）。大多被子植物的叶绿体DNA通过雌配子以母系遗传的方式传递（胡适宜，1997； 方晓华等，2003； Zhang et al，2003），比较杂交个体及其可能亲本的叶绿体DNA序列，可以揭示其母本起源（余姣君等，2014； 王莹等，2015）。但也有一些类群叶绿体基因被证明为父系遗传，例如大部分的裸子植物（Neale & Sederoff，1989； 刘兴梁和胡适宜，1995； Gou et al，2005），被子植物中的胡萝卜属（Boblenz et al，1990）、牵牛属（胡赞民等，1996）、猕猴桃属（Testolin & Cipriani，1997）、蒺藜属（Yang et al，2000）等。甘草属植物的叶绿体基因为母系遗传还是父系遗传？尚未见有相关报道。阐明甘草属叶绿体基因遗传特性，才能准确、客观地对杂交种的父本、母本做出科学判断，为揭示疑似杂交种的杂交起源和分类地位提供依据。
本研究在前期研究已获得的甘草属种间杂交种幼苗的基础上（谢良碧等，2014），以不同杂交组合的子代及其已知亲本为材料，通过核DNA的ITS和叶绿体DNA的rbcL、matK、trnHpsbA片段扩增和测序，分析了亲本种及杂交种的序列。其主要目的在于：（1）通过双亲遗传的ITS序列分析，筛选出杂交成功，含有已知父本、母本基因的F1代，以用于叶绿体遗传规律的分析。（2）通过叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA基因的分析，揭示亲本和F1代叶绿体DNA遗传方式。（3）在以上研究基础上，分析甘草属ITS及叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA序列在甘草属杂交种的鉴定研究中的应用价值，为甘草属疑似杂交种的鉴定及其分类地位探讨提供分子依据。
1材料与方法
1.1 材料
用于测序分析的材料包括34个亲本种和34个人工杂交种：乌拉尔甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）、胀果甘草（G. inflata）和正反交人工杂交种G. uralensis♀ × G. glabra♂、G. glabra♀ × G. uralensis♂、G. uralensis♀ × G. inflata♂、G. inflata♀ × G. uralensis♂，共68份。取亲本种植株的成熟健康叶片和人工杂交后获得的杂交种幼苗的新鲜叶片，采集后迅速用硅胶干燥，待叶片彻底干燥后存放于-20 ℃冰箱备用。
1.2 方法
每份材料，称取叶片20 mg研磨成粉状，用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根公司），按说明书操作提取总DNA。
核DNA的ITS序列和叶绿体DNA中rbcL、matK、trnHpsbA序列引物参照Kondo et al（2007）的设计，引物经生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增反应在Biometera 070851 PCR仪上进行。采用50 μL的PCR反应体系：TaKaRa PrimeSTAR Max DNA Polymerase （北京六合通经贸有限公司）25 μL，引物各2 μL，模板DNA 4 μL，最后超纯水（ddH2O）补足至50 μL。PCR反应条件为98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共36个循环，最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测片段后，在凝胶成像仪上观察，切下目的条带，经凝胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]回收处理后，送往北京六合华大基因科技股份有限公司，采用ABI 3700型自动测序仪进行重复测序。
1.3 数据分析
测序结果使用SnapGene观察峰图后，借助MEGA 4.0进行人工校对，手动删除不可信的位点，并用DNAman软件进行多序列比对及分析。通过豆科中的锦鸡儿属（侯鑫等，2008）、甘草属ITS序列的研究（刘春生等，2005），确定本实验的ITS序列边界，对照峰图，手工筛选碱基叠加位点，分析杂交位点。叶绿体基因型的确定，参照Kondo et al（2007）的设计。 2结果与分析
2.1 ITS序列分析
亲本种和人工杂交种共68份的核基因ITS序列测序结果表明，其长度均为614 bp。如图1所示，ITS有4种多态性位点，其中ITS1含有1处变异位点；ITS2含有3处变异位点。根据变异位点分析，可以将核基因ITS基因型分为3种，分别是I1、I2、I3型，其中I2型为杂合型（表1）。乌拉尔甘草的17个样本均有4处变异位点，分别为187（C）、411（T）、412（G）、413（C），显示了种内较高的保守性；光果甘草和胀果甘草具有相同的变异位点，均为187（T）、411（C）、412（A）、413（A），说明其亲缘关系较近；34份人工杂交种在4个变异位点处均出现其亲本种的叠加峰现象，分别为187（Y）、411（Y）、412（L）、413（M），应为杂合位点，说明已经获得成功的人工杂交种。
2.2 叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA基因序列分析
亲本种和人工杂交种的叶绿体基因测序结果经比对、剪切后，得到rbcL、matK、trnHpsbA序列长度分别为124、96、177 bp，共有4处变异位点，有6种基因型（表2），其中rbcL有2种基因型，为R1、R4；matK有2种基因型为M1、M2；trnHpsbA有2种基因型为T1、T2。如图24所示，乌拉尔甘草17个样本，基因型均为R1、M1、T1，记为H1型，所测叶绿体基因片段一致，说明该物种种内保守性较高；光果甘草和胀果甘草叶绿体基因型为R4、M2、T2，记为H2型，说明光果甘草和胀果甘草亲缘关系较近；人工杂交种rbcL序列为2处碱基替换突变；matK序列为1处碱基缺失突变；trnHpsbA序列有1处碱基替换突变。人工杂交种的叶绿体DNA与其母本的基因型相同的个数为1株，占总体人工杂交种的比例为2.9%，而与其相对应的父本基因型相同的个数为33株，占总体人工杂交种的比例为97.1%（表2，图2-4）。故人工杂交种叶绿体DNA遗传方式主要表现为父系遗传。
3讨论
3.1 核基因ITS序列在甘草属植物杂交种鉴定的应用
随着分子技术的发展，核基因ITS序列测序技术也应用到杂交种的鉴定中。ITS序列为双亲遗传，子代在双亲相同位点会出现碱基的叠加（范文月等，2011）。该序列被认为是鉴定杂交种有用的分子标记基因（严容，2009）。通常，如果一些植物类群的疑难种是杂交造成的，则在这些疑难种ITS序列的突变位点中会检测到其双亲碱基的叠加，进而可以对疑似亲本做出判断。如杨威等（2011）借助ITS序列分析，揭示了自然杂交种的亲本为兴安白头翁和朝鲜白头翁；吴杰等（2015）对分布于云南的旱柳和云南柳之间的自然杂交种进行研究，结果表明疑似杂交种ITS序列的基因型为疑似亲本的嵌合体。以上研究表明，核基因ITS序列能揭示一些疑似杂交种的真实身份。本研究中，亲本种和人工杂交种的ITS序列长度均为614 bp，34个人工杂交种的ITS序列均有4处杂合位点，均表现为相应亲本种的碱基叠加，这与Kondo et al（2007）对甘草属野生疑似杂交种及其自然种群的乌拉尔甘草、光果甘草及胀果甘草ITS序列分析的4个变异位点的研究结果是一致的。因此，本研究所获得的人工杂交种是可信并可进一步用于双亲与子代遗传关系的分析。同时，本研究对可控双亲及人工杂交后代的ITS序列分析的结果，也将为揭示自然界甘草属杂交现象和杂交种鉴定提供更有利的分子证据。
3.2 甘草属叶绿体DNA父系遗传的推定
到目前为止，关于豆科植物叶绿体DNA遗传方式的研究报道表明，该科不同属、种的质体遗传方式并不一致：Parker（1934）通过对菜豆花叶突变体杂交的实验，首次证明了菜豆质体遗传方式为双亲遗传；之后一些学者借助细胞学的方法，证明豌豆（刘兴梁和胡适宜，1995）、大豆、野生大豆（胡适宜，1997）、菜豆（刘兴梁，1997）的质体遗传方式为母系遗传；父系遗传的报道仅见苜蓿属的紫花苜蓿（Schumann & Hancock，1989； Masoud et al，1990； Dudas et al，2012）。本研究通过对甘草属已知亲本种及其杂交种的叶绿体基因中rbcL、matK、trnHpsbA片段的序列分析，共得到4处变异位点，基因型可分成两种，一种类型为H1型，另一种为H2型。正反交的人工杂交种的叶绿体rbcL、matK、trnHpsbA的变异位点、基因型与其相应父本的基因型一致率高达97.1%。以上结果表明，甘草属叶绿体中的rbcL、matK、trnHpsbA片段主要为父系遗传。初步推测甘草属的质体遗传方式主要表现为父系遗传，而是否为低、高频父系遗传，还有待进一步研究和验证。
3.3 甘草属叶绿体基因遗传的复杂性
在同属植物中质体的遗传方式基本一致，所以叶绿体基因遗传方式在属内是可以推测的（Zhong et al，2011）。本研究中叶绿体遗传方式为父系遗传的比率高达97.1%，说明在甘草属中主要表现为父系遗传；其次，叶绿体遗传方式表现为母系遗传的比率为2.9%，说明甘草属叶绿体基因遗传方式并不是单向的父系或母系遗传，而是混合的，但以父系遗传为主，这种混合的叶绿体遗传模式在猕猴桃等其它双子叶植物均有发现（Li et al，2013； Anja et al，2015）。叶绿体基因遗传方式的多樣性可能会降低杂交频率和转移基因渐渗的方向（Li et al，2013），影响种群结构和物种的遗传分化。甘草属植物叶绿体基因遗传的复杂性的发现，将为进一步对该属种群结构、遗传分化及物种进化的研究提供了有力证据。
3.4 甘草属叶绿体基因父系遗传方式对物种遗传多样性的影响
叶绿体是绿色植物质体的主要类型，叶绿体DNA为母系遗传的植物，在同一母株上形成的后代，其叶绿体单倍型是完全一致的。但叶绿体DNA为父系遗传方式的植物，如果自然环境中有稳定的花粉传播途径，如风媒或虫媒，可以使叶绿体单倍型通过花粉散布，这样，同一母株上有多个父系的叶绿体单倍型，因而可能比母系遗传植物具有更高的叶绿体单倍型多态性（张田等，2007）。现已证明在裸子植物中父系遗传较为普遍（Neale & Sederoff，1989； 刘兴梁和胡适宜，1995； Gou et al，2005），此遗传方式，也为裸子植物遗传多样性提供了证据。在被子植物中，猕猴桃属叶绿体遗传方式前期被认为是严格的父系遗传（Testolin & Cipriani，1997； Cipriani et al，1995； Chat et al，1999），后Li et al （2013）通过AFLP和测序技术对猕猴桃属种间杂交植物进行研究，得出猕猴桃属叶绿体不仅具有父系遗传的特性，还具有母系及双亲遗传的特性。猕猴桃属虫媒或风媒的混合传粉，使该属植物维持了较高水平的遗传多样性，同时也是一个具有自然杂交和基因渐渗的类群（张田等，2007； Li et al，2002； Chat et al，2004）。由此可见，叶绿体DNA为父系遗传的植物类群，其遗传多样性的组成应该比母系遗传的类群更为复杂和丰富。 在前期研究工作中，对甘草属自然种群的繁殖系统和杂交现象、遗传多样性研究与猕猴桃属植物研究结果相似，其种间过渡类型复杂（李学禹和陆嘉惠，2015），同域分布种存在花期重叠、杂交亲和现象（廖云海，2011； 田润炜等，2013），种间杂交亲和性最高可达96.67%（谢良碧等，2014）。较高的种间亲和性使种间花粉交流变得更为频繁，本研究发现的叶绿体父系遗传方式则使这种由花粉流动而带来的遗传基因的变化更为丰富。可以推测，在属内的同域种分布区，种间和种内由于频繁的花粉交流，其叶绿体单倍型在同一母株的不同花序或果序上将会呈现多样性。这不仅丰富了种内的遗传多样性，也使种间的杂交和遗传变异更为复杂。因此，甘草属叶绿体父系遗传的特性和种间较高的杂交亲和度，使花粉流在不同个体间、种内和种间进出，基因的频繁交流是导致甘草属野生种群种内较高的遗传多样性（李晓岚等，2015； 张富民，1995； 陆嘉惠等，2006）和种间过渡类型大量出现的原因之一，也是导致该属成为疑难种和争议种较多的“困难属”的原因。本研究发现的甘草属叶绿体主要为父系遗传特性，将为科学、客观地对自然杂交种的杂交起源和亲本鉴定提供有力依据，同时也为被子植物尤其是双子叶豆科植物的物种进化和演化提供了新的资料。
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