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摘 要：为研究川西藏区自然发酵牦牛酸醡肉的标准化工艺及品质特性，以感官评分为目标参数，综合评分为响应值进行响应面设计，优化其发酵工艺，并进行成品品质特性分析。结果表明：最优发酵工艺为22 ℃发酵40 h。成品牦牛酸醡肉含氨基酸16 种，氨基酸总含量21.8 g/100 g，必需氨基酸/总氨基酸比值为40.98%，苏氨酸与天冬氨酸为主要呈味氨基酸；成品牦牛酸醡肉中挥发性物质共检测出114 种，主要包括碳氢化合物（53 种）、醇类（35 种）、酯类（27 种）和醚类（3 种），相对含量均大于5%，此外还含有醛类（12 种）、酚类（7 种）、酸类（7 种）、酮类（14 种）和含氮化合物（9 种）。
关键词：牦牛酸醡肉；自然发酵；工艺标准化；品质特性
Processing Standardization and Quality Characteristics of Naturally Fermented Sour Yak Meat in
Tibetan Areas of West Sichuan
PENG Yiqin1， DING Jie1，2，*， SHU Xiaofang1， LIU Chunyan1， LU Xuesong1， HE Jianghong1， XIAO Meng1， WU Huachang1
（1.College of Food Science， Sichuan Tourism University， Chengdu 610100， China；
2.College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）
Abstract： This study was carried out aiming to optimize fermentation conditions for the production of naturally fermented sour yak meat in the Tibetan areas of west Sichuan and to evaluate its quality characteristics. Optimization was carried out using response surface methodology. Sensory evaluation score was used as response variable. The optimal fermentation temperature and time were determined as 22 ℃ and 40 h， respectively. The product prepared under these conditions contained 16 amino acids； the total amino acid content was 21.8 g/100 g and the ratio of essential amino acid to total amino acid was 40.98%. Threonine and aspartic acid were identified as the main flavor amino acids. A total of 114 volatile compounds were identified in the fermented meat including 53 hydrocarbons， 35 alcohols， 27 esters and 3 ethers， accounting respectively for more than 5%， as well as 12 aldehydes， 7 phenols， 7 acids， 14 ketones and 9 nitrogenous compounds.
Keywords： sour yak meat； natural fermentation； processing standardization； quality characteristics
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807006
中圖分类号：TS251.52 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）07-0029-08
引文格式：
彭毅秦， 丁捷， 舒小芳， 等. 川西藏区自然发酵牦牛酸醡肉工艺标准化及品质特性[J]. 肉类研究， 2018， 32（7）： 29-36. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807006. http：//www.rlyj.pub
PENG Yiqin， DING Jie， SHU Xiaofang， et al. Processing standardization and quality characteristics of naturally fermented sour yak meat in tibetan areas of west sichuan[J]. Meat Research， 2018， 32（7）： 29-36. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807006. http：//www.rlyj.pub
酸醡肉是我国西南少数民族地区的传统发酵肉制品[1]，以鲜肉为主料，玉米粉、米粉或青稞粉及多种调味料为辅料，经自然发酵而成，品种主要分为三大类：湘西地区侗族传统酸肉、贵州荔波传统酸肉和四川扎坝臭猪肉。酸醡肉因其营养丰富、口感独特且极具地域民族特色，而深受消费者欢迎，市场潜力巨大。李丽华等[2]对传统湘西酸醡肉的加工工艺进行改造研究；谢垚垚等[3]使用混合乳酸菌进行快速发酵，将侗族传统酸醡肉的发酵时间缩短至30 h；赵庄等[4]使用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法快速测定酸肉中10 种挥发性N-亚硝胺类化合物；Leisner等[5]研究不同类型乳酸菌的生长对酸醡肉在厌氧（真空）和有氧条件下贮藏期限的影响；Hu Yanxin等[6]将细菌素运用于传统酸醡肉的防腐；卢雪松等[7]探究多种烹饪方式对糊辣风味酸醡肉食用品质的影响。 牦牛肉高蛋白低脂肪[8-10]，营养丰富，富含不饱和脂肪酸、氨基酸、磷、钙及胡萝卜素等，是公认的绿色食品。我国是牦牛肉的主要生产国，牦牛资源占全世界的90%以上，同时也是牦牛肉的消费大国。目前，为解决牦牛肉加工过程中保鲜、保水及排酸等难点问题，侯晓卫等[11]将壳聚糖、茶多酚及乳酸链球菌素（Nisin）制作成保鲜涂膜液，将冷鲜牦牛肉保鲜时间延长至16 d；陈驰等[12]
发现用微波加热牦牛肉糜时，随着NaCl添加量的增加，牦牛肉糜的凝胶保水率显著增大。目前，牦牛肉食用品质改良的相关报道集中在直投式发酵[13-14]和高压处理[15]等方面；营养特性研究集中在不同产地牦牛肉的营养对比[16]、牦牛肉与猪肉的营养成分对比[17]、熟化过程中蛋白酶的含量变化[18]及热处理对钙、铜、铁、镁等元素含量的影响[19]方面；产品的开发多为肉干[20]、肉肠[21]、肉串[22]、肉酱[23]等，有关川西藏区传统自然发酵牦牛酸醡肉加工工艺标准化的研究尚未见报道。本研究利用响应面法优化川西藏区牦牛酸醡肉加工工艺中的关键控制点，对优化后成品酸醡肉的感官、理化及香气特性进行研究，为后续川西藏区牦牛酸醡肉的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青稞粉由甘孜州农业科学研究所八美农场提供的康青8号（2016、2017年产）自制；白砂糖 北京厨大妈食品集团有限公司；纯米醋 四川保宁醋有限公司；味精 四川国莎实业有限公司；绿色生态盐 四川久大制盐有限公司；调味料酒、窝窝醪糟 成都市巨龙生物科技有限公司；芫根、干辣椒、辣椒粉、花椒粉、生姜、大葱、蒜、八角粉、鲜牦牛肉（符合GB 18393—2001《牛羊屠宰产品品质检验规程》）均于实验当天购自四川省甘孜州白玉县综合农贸市场。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、HP-5MS UI气相色谱柱（0.25 mm×60 m，0.25 μm，Agilent 19091s-436UI）、固相微萃取装置（57330-U，Supelco）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取针（57348-U，supelco） 美国安捷伦科技有限公司；L-8900高速氨基酸分析仪 日立高新技术株式会社；TMS-PRO高精度专业食品物性分析仪 美国FTC公司；DC-P3新型全自动测色差计 北京市兴光测色差仪器
公司；08-2T恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 牦牛酸醡肉的基础加工工艺及操作要点
操作要点：1）以新鲜牦牛肉总质量计，主要辅料配方如下：芫根丝50%、炒青稞粉40%、干辣椒面7.5%、白砂糖5%、食盐4%、酒酿2.5%、姜末2.5%；2）炒青稞粉：翻炒温度120～200 ℃，时间1～5 min，得到含水量为6%的炒青稞粉；3）牦牛肉预处理：新鲜牦牛肉清洗、整理、剔筋，切成长10 cm、宽5 cm的块状；将肉条浸泡在20 ℃新鲜牦牛乳中30 min（固液比1∶2）；4）芫根丝加工：将新鲜芫根清洗干净后切成约长10 cm、宽1 cm、高0.6 cm的条状，用15%食盐腌制10 h后将芫根丝与20 ℃清水（固液比1∶7）混合，脱盐浸泡12 h；脱盐后的芫根丝置于烘箱内在温度40 ℃、风速1 m/min条件下烘至水分含量为50%即可；5）将炒青稞粉、香辛料、酒酿、白砂糖和食盐按比例混合，均匀涂抹在处理后的牦牛肉上，再与处理后的芫根丝混合，于密闭容器中20 ℃条件下发酵48 h后，切条真空包装或罐装后，高温高压杀菌即得成品。
1.3.2 关键工艺参数单因素试验
在最优辅料配方和基础工艺条件下，分别研究发酵温度（15、20、25、30、35 ℃）和發酵时间（30、36、42、48、54 h）对牦牛酸醡肉感官品质、色泽特性、质构特性及理化特性的影响。
1.3.3 关键工艺参数响应面优化试验
根据响应面试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取发酵温度和发酵时间2 个因素，以成品品质综合评分为考察指标，采取2因素3水平的响应面方法对川西藏区牦牛酸醡肉的自然发酵工艺进行优化。试验因素与水平编码如表1所示。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 感官评价
根据GB/T 22210—2008《肉及肉制品感官评价规范》，主要围绕色泽、气味、滋味和组织形态4 个方面制定感官评分标准。由10 名具有副高级以上烹饪专业职称的人员组成感官评价小组，对牦牛肉酸醡肉进行感官评定。感官评分标准如表2所示，感官品质评分为各项指标评分后取平均值，再乘以其权重后的和。
1.3.4.2 理化特性测定
总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》；亚硝酸盐含量：参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》；水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；总酸含量：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；色差：参照JJG 595—2002《测色色差计检定规程测定》；质构特性：质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）程序，单刀复合式剪切探头，形变量60%，测试速率60 mm/min，最小感应力0.375 N，停顿2 s。
1.3.4.3 氨基酸含量测定
氨基酸含量测定：采用氨基酸自动分析仪，参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。色谱柱：磺酸型阳离子树脂；检测波长570、440 nm；以外标法通过峰面积计算样品中氨基酸的含量。 氨基酸分（amino acid score，AAS）和化学分（chemistry score，CS）按照公式（1）、（2）计算，评价氨基酸品质。
1.3.4.4 挥发性成分分析
样品处理：取5 g样品置于萃取瓶中，80 ℃水浴萃取30 min。萃取针使用前，在GC-MS仪进样口活化20 min（250 ℃）。
GC条件：进样口温度250 ℃，GC-MS仪接口温度250 ℃，载气流速1.5 mL/min；升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温到100 ℃保持5 min；以4 ℃/min升温到140 ℃保持10 min；以4 ℃/min升温到180 ℃保持10 min；以4 ℃/min升温到250 ℃保持5 min。
MS条件：离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子轰击（electron impact，EI）电离70 eV，50～550 m/z全扫描。通过保留时间与NIST 2.0质谱数据库比对进行鉴定，相似指数和反相似指数均大于800的为鉴定化合物；通过峰面积计算化合物的相对含量。
1.3.4.5 品质综合评价
根据前期研究，确定感官评分（U1）、总色差（ΔEab）（U2）、水分含量（U3）、总酸含量（U4）、TVB-N含量（U5）、亚硝酸盐含量（U6）、硬度（U7）、弹性（U8）和咀嚼性（U9）的指标范围：U1=55～70 分，U2=6～15，U3=50%～65%，U4=3～5 g/kg，
U5=25%～45%，U6=0.5～4.0 mg/kg，U7=10～60 N，U8=2～3 mm，U9=10～25 mJ。为进行模糊综合评价，计算隶属度值，根据线性模型建立如下隶属度：
1.4 数据处理
采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行回归分析、方差分析及邓肯检验。使用数据均为6 次平行实验的平均值。
2 结果与分析
2.1 关键工艺参数单因素试验结果
2.1.1 发酵温度
由表3可知，随着发酵温度的升高，牦牛酸醡肉各品质指标变化显著。随着发酵温度的升高，牦牛酸醡肉的ΔEab、硬度与咀嚼性显著提高，且均在35 ℃时达到最大值，分别为15.43、38.43 N和22.43 mJ，相较于15 ℃时高出114.01%、190.03%和85.06%；总酸、亚硝酸盐及TVB-N含量随着发酵温度的升高而显著增加，最大值分别为5.12 g/kg、4.74 mg/kg和82.29 mg/kg，相较于15 ℃时显著高出213.91%、228.25%和22.78%；水分含量显著降低，在35 ℃时出现最小值47%；感官评分与品质综合评分均呈现先显著增加后显著减小的趋势，在25 ℃出现峰值，分别为74.60 分和0.42 分。综上所述，适宜牦牛酸醡肉的发酵温度范围为20～25 ℃。
2.1.2 发酵时间
由表4可知，随着发酵时间的延长，牦牛酸醡肉的品质指标变化显著。随着发酵时间的延长，ΔEab、硬度与咀嚼性显著提高，峰值分别为13.23、58.50 N和21.99 mJ，相较于发酵30 h时显著提高42.26%、273.80%和145.97%；总酸、亚硝酸盐及TVB-N含量均呈显著增加趋势，且均在发酵54 h时含量最高，分别为
3.43 g/kg、4.27 mg/kg和45.85 mg/kg，相较发酵30 h时显著高出257.29%、42.56%和6.75%；感官评分与综合评分呈现先显著上升后显著下降的趋势，在发酵42 h时出现峰值，分别为74.60 分和0.35 分。综上所述，牦牛酸醡肉的適宜发酵时间范围为36～42 h。
2.2 关键工艺参数响应面优化试验结果
2.2.1 响应面试验设计与结果
以发酵温度和发酵时间为自变量，以综合评分为响应值进行Box-Benhnken实验设计，Box-Benhnken实验设计结构矩阵及实验结果如表5所示。
2.2.2 模型的建立与显著性检验
利用Design-Expert响应面分析软件进行回归拟合分析，得到的二次多项式模型为Y=0.848 6+0.005 0A+0.036 6B+0.017 5AB-0.080 1A2-0.075 1B2。
由表6可知，模型P=0.000 3<0.01（极显著），而失拟项不显著（P=0.221 3>0.05），表明模型具有较好的拟合性，试验误差较小。R2=0.946 5，R2Adj=0.908 3，表明90.83%的响应值数据可以用该模型进行解释，其变异系数2.91%低于15%，表明该模型的重现性较好，可用于酸醡肉的工艺优化。模型中A2、B2、B具有极显著影响
（P<0.01），各因子对综合评分的影响排序为B>A。
由图2可知，响应面坡度较陡，说明因素A、B对牦牛酸醡肉综合评分的影响较大。A在20～25 ℃，B在36～42 h的范围内存在极值。根据Box-Behnken响应面法，拟合所得的最优工艺条件为22.5 ℃发酵39 h，此条件下牦牛酸醡肉的综合评分预测值为0.934 分。为便于实际操作，将发酵条件调整为22 ℃发酵40 h，此条件下进行6 次平行实验，牦牛酸醡肉的综合评分（0.916±0.230） 分，与模型预测结果基本一致，表明该模型可信。
2.3 标准化加工川西藏区牦牛酸醡肉的质量标准
感官标准：成品呈深红褐色且有光泽；有适宜发酵香味，无胺味；酸辣咸甜酸味兼备，口感协调柔和；组织状态致密，口感富有弹性。
理化标准：水分含量50%～55%，总酸含量4.0～4.5 g/kg，亚硝酸盐含量<0.5 mg/kg，TVB-N 含量<30 mg/kg，蛋白质含量>20%。
2.4 标准化加工川西藏区牦牛酸醡肉的营养价值及风味成分分析
2.4.1 氨基酸成分分析
由表7可知，牦牛酸醡肉氨基酸结构合理，含量较高，共检测出16 种氨基酸，总量为21.3 g/100 g，其中必需氨基酸7 种，总量为9.11 g/100 g，检测过程中色氨酸及半胱氨酸被破坏。根据FAO/WHO的规定[24-25]，优质蛋白质的EAA/TAA应在40%左右，EAA/NEAA应在60%以上。牦牛酸醡肉的EAA/NEAA值为69.43%，EAA/TAA值为40.98%，其氨基酸组成符合FAO/WHO关于优质蛋白质的规定，表明牦牛酸醡肉含优质蛋白质，营养价值较高。牦牛酸醡肉中呈味氨基酸的总含量为8.90 g/100 g，占总氨基酸含量的45.08%，其中谷氨酸含量最高，天冬氨酸次之。通过必需氨基酸评分可知，牦牛酸醡肉中赖氨酸的AAS和CS最高，分别为36.00和30.51，而酪氨酸的AAS和CS最低，分别为19.17和12.04，为牦牛酸醡肉的第一限制性氨基酸。因此，川西藏区牦牛酸醡肉在精深加工时可通过强化酪氨酸进一步提高其氨基酸生物利用率和蛋白質的营养价值。
2.4.2 挥发性风味成分分析
利用顶空固相微萃取-GC-MS技术检测成品牦牛酸醡肉的挥发性成分，其总离子流图如图3所示。
由表8可知，经标准图谱库比对，共鉴定出114 种挥发性物质，以碳氢化合物（53 种）、醇类（35 种）、酯类（27 种）、醚类（3 种）为主，总含量均大于5%，主要为2-甲氧基-4-乙烯苯酚（1.733 4%）、姜烯（1.684 2%）、芳樟醇（29.520 3%）、乙醇（3.422 6%）、2，3-丁二醇（2.659 1%）、松油烯醇-4（1.160 9%）、乙酸乙酯（1.598 6%）、乙酸芳樟酯（1.292 2%）和反-茴香脑（31.833 6%）。此外，还有醛类（12 种）、酚类（7 种）、酸类（7 种）、酮类（14 种）和含氮化合物（9 种），主要为十六醛（1.860 6%）、丁香酚（1.434 1%）和乙酸（1.500 0%）。
醇类占挥发性物质总含量的41.926%，为肉制品提供花果香、甜香和黄油香等香味物质，样品中的芳樟醇阈值较低（6×10-3 mg/L[26]），含量较高，是肉制品的特征风味物质之一。酯类物质占总挥发性物质含量的5.781%，阈值低，不仅能够给人花香、乳香等生理印象，还可以掩盖游离脂肪酸带来的不愉快味道[27]，对肉制品的风味有重要贡献。酸类物质占总挥发性物质含量的2.180%，其主要来源于微生物的代谢反应，在牦牛酸醡肉成熟过程中起较大作用[28]，是酸味的主要来源，对产品风味有重要贡献。
3 结 论
以感官评分为目标参数，综合评分为响应值进行响应面设计优化牦牛酸醡肉的发酵工艺，并进行成品品质特性分析。通过单因素试验可知，在20～25 ℃温度范围内，发酵36～48 h时牦牛酸醡肉的感官品质较好，综合得分较高。关键工艺参数响应面优化试验结果表明，发酵时间与发酵温度对牦牛酸醡肉品质有较大影响，其中发酵温度显著影响酸醡肉的综合得分（P<0.05），最佳发酵工艺参数为22 ℃发酵40 h。优化的成品川西藏区牦牛酸醡肉中含16 种氨基酸，其中必需氨基酸7 种，
EAA/TAA为40.98%；呈味氨基酸的总含量为4.67 g/100 g，占总氨基酸含量的45.08%；酪氨酸的AAS和CS最低，是牦牛酸醡肉的第一限制性氨基酸。标准化加工后的川西藏区牦牛酸醡肉中共检出挥发性物质114 种，以碳氢化合物（53 种）、醇类（35 种）、酯类（27 种）及醚类（3 种）为主，酸醡肉的主体香味可能由醇类、酯类及酸类物质提供。
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关键词：牦牛酸醡肉；自然发酵；工艺标准化；品质特性
Processing Standardization and Quality Characteristics of Naturally Fermented Sour Yak Meat in
Tibetan Areas of West Sichuan
PENG Yiqin1， DING Jie1，2，*， SHU Xiaofang1， LIU Chunyan1， LU Xuesong1， HE Jianghong1， XIAO Meng1， WU Huachang1
（1.College of Food Science， Sichuan Tourism University， Chengdu 610100， China；
2.College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）
Abstract： This study was carried out aiming to optimize fermentation conditions for the production of naturally fermented sour yak meat in the Tibetan areas of west Sichuan and to evaluate its quality characteristics. Optimization was carried out using response surface methodology. Sensory evaluation score was used as response variable. The optimal fermentation temperature and time were determined as 22 ℃ and 40 h， respectively. The product prepared under these conditions contained 16 amino acids； the total amino acid content was 21.8 g/100 g and the ratio of essential amino acid to total amino acid was 40.98%. Threonine and aspartic acid were identified as the main flavor amino acids. A total of 114 volatile compounds were identified in the fermented meat including 53 hydrocarbons， 35 alcohols， 27 esters and 3 ethers， accounting respectively for more than 5%， as well as 12 aldehydes， 7 phenols， 7 acids， 14 ketones and 9 nitrogenous compounds.
Keywords： sour yak meat； natural fermentation； processing standardization； quality characteristics
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807006
中圖分类号：TS251.52 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）07-0029-08
引文格式：
彭毅秦， 丁捷， 舒小芳， 等. 川西藏区自然发酵牦牛酸醡肉工艺标准化及品质特性[J]. 肉类研究， 2018， 32（7）： 29-36. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807006. http：//www.rlyj.pub
PENG Yiqin， DING Jie， SHU Xiaofang， et al. Processing standardization and quality characteristics of naturally fermented sour yak meat in tibetan areas of west sichuan[J]. Meat Research， 2018， 32（7）： 29-36. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807006. http：//www.rlyj.pub
酸醡肉是我国西南少数民族地区的传统发酵肉制品[1]，以鲜肉为主料，玉米粉、米粉或青稞粉及多种调味料为辅料，经自然发酵而成，品种主要分为三大类：湘西地区侗族传统酸肉、贵州荔波传统酸肉和四川扎坝臭猪肉。酸醡肉因其营养丰富、口感独特且极具地域民族特色，而深受消费者欢迎，市场潜力巨大。李丽华等[2]对传统湘西酸醡肉的加工工艺进行改造研究；谢垚垚等[3]使用混合乳酸菌进行快速发酵，将侗族传统酸醡肉的发酵时间缩短至30 h；赵庄等[4]使用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法快速测定酸肉中10 种挥发性N-亚硝胺类化合物；Leisner等[5]研究不同类型乳酸菌的生长对酸醡肉在厌氧（真空）和有氧条件下贮藏期限的影响；Hu Yanxin等[6]将细菌素运用于传统酸醡肉的防腐；卢雪松等[7]探究多种烹饪方式对糊辣风味酸醡肉食用品质的影响。 牦牛肉高蛋白低脂肪[8-10]，营养丰富，富含不饱和脂肪酸、氨基酸、磷、钙及胡萝卜素等，是公认的绿色食品。我国是牦牛肉的主要生产国，牦牛资源占全世界的90%以上，同时也是牦牛肉的消费大国。目前，为解决牦牛肉加工过程中保鲜、保水及排酸等难点问题，侯晓卫等[11]将壳聚糖、茶多酚及乳酸链球菌素（Nisin）制作成保鲜涂膜液，将冷鲜牦牛肉保鲜时间延长至16 d；陈驰等[12]
发现用微波加热牦牛肉糜时，随着NaCl添加量的增加，牦牛肉糜的凝胶保水率显著增大。目前，牦牛肉食用品质改良的相关报道集中在直投式发酵[13-14]和高压处理[15]等方面；营养特性研究集中在不同产地牦牛肉的营养对比[16]、牦牛肉与猪肉的营养成分对比[17]、熟化过程中蛋白酶的含量变化[18]及热处理对钙、铜、铁、镁等元素含量的影响[19]方面；产品的开发多为肉干[20]、肉肠[21]、肉串[22]、肉酱[23]等，有关川西藏区传统自然发酵牦牛酸醡肉加工工艺标准化的研究尚未见报道。本研究利用响应面法优化川西藏区牦牛酸醡肉加工工艺中的关键控制点，对优化后成品酸醡肉的感官、理化及香气特性进行研究，为后续川西藏区牦牛酸醡肉的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青稞粉由甘孜州农业科学研究所八美农场提供的康青8号（2016、2017年产）自制；白砂糖 北京厨大妈食品集团有限公司；纯米醋 四川保宁醋有限公司；味精 四川国莎实业有限公司；绿色生态盐 四川久大制盐有限公司；调味料酒、窝窝醪糟 成都市巨龙生物科技有限公司；芫根、干辣椒、辣椒粉、花椒粉、生姜、大葱、蒜、八角粉、鲜牦牛肉（符合GB 18393—2001《牛羊屠宰产品品质检验规程》）均于实验当天购自四川省甘孜州白玉县综合农贸市场。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、HP-5MS UI气相色谱柱（0.25 mm×60 m，0.25 μm，Agilent 19091s-436UI）、固相微萃取装置（57330-U，Supelco）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取针（57348-U，supelco） 美国安捷伦科技有限公司；L-8900高速氨基酸分析仪 日立高新技术株式会社；TMS-PRO高精度专业食品物性分析仪 美国FTC公司；DC-P3新型全自动测色差计 北京市兴光测色差仪器
公司；08-2T恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 牦牛酸醡肉的基础加工工艺及操作要点
操作要点：1）以新鲜牦牛肉总质量计，主要辅料配方如下：芫根丝50%、炒青稞粉40%、干辣椒面7.5%、白砂糖5%、食盐4%、酒酿2.5%、姜末2.5%；2）炒青稞粉：翻炒温度120～200 ℃，时间1～5 min，得到含水量为6%的炒青稞粉；3）牦牛肉预处理：新鲜牦牛肉清洗、整理、剔筋，切成长10 cm、宽5 cm的块状；将肉条浸泡在20 ℃新鲜牦牛乳中30 min（固液比1∶2）；4）芫根丝加工：将新鲜芫根清洗干净后切成约长10 cm、宽1 cm、高0.6 cm的条状，用15%食盐腌制10 h后将芫根丝与20 ℃清水（固液比1∶7）混合，脱盐浸泡12 h；脱盐后的芫根丝置于烘箱内在温度40 ℃、风速1 m/min条件下烘至水分含量为50%即可；5）将炒青稞粉、香辛料、酒酿、白砂糖和食盐按比例混合，均匀涂抹在处理后的牦牛肉上，再与处理后的芫根丝混合，于密闭容器中20 ℃条件下发酵48 h后，切条真空包装或罐装后，高温高压杀菌即得成品。
1.3.2 关键工艺参数单因素试验
在最优辅料配方和基础工艺条件下，分别研究发酵温度（15、20、25、30、35 ℃）和發酵时间（30、36、42、48、54 h）对牦牛酸醡肉感官品质、色泽特性、质构特性及理化特性的影响。
1.3.3 关键工艺参数响应面优化试验
根据响应面试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取发酵温度和发酵时间2 个因素，以成品品质综合评分为考察指标，采取2因素3水平的响应面方法对川西藏区牦牛酸醡肉的自然发酵工艺进行优化。试验因素与水平编码如表1所示。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 感官评价
根据GB/T 22210—2008《肉及肉制品感官评价规范》，主要围绕色泽、气味、滋味和组织形态4 个方面制定感官评分标准。由10 名具有副高级以上烹饪专业职称的人员组成感官评价小组，对牦牛肉酸醡肉进行感官评定。感官评分标准如表2所示，感官品质评分为各项指标评分后取平均值，再乘以其权重后的和。
1.3.4.2 理化特性测定
总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》；亚硝酸盐含量：参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》；水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；总酸含量：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；色差：参照JJG 595—2002《测色色差计检定规程测定》；质构特性：质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）程序，单刀复合式剪切探头，形变量60%，测试速率60 mm/min，最小感应力0.375 N，停顿2 s。
1.3.4.3 氨基酸含量测定
氨基酸含量测定：采用氨基酸自动分析仪，参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。色谱柱：磺酸型阳离子树脂；检测波长570、440 nm；以外标法通过峰面积计算样品中氨基酸的含量。 氨基酸分（amino acid score，AAS）和化学分（chemistry score，CS）按照公式（1）、（2）计算，评价氨基酸品质。
1.3.4.4 挥发性成分分析
样品处理：取5 g样品置于萃取瓶中，80 ℃水浴萃取30 min。萃取针使用前，在GC-MS仪进样口活化20 min（250 ℃）。
GC条件：进样口温度250 ℃，GC-MS仪接口温度250 ℃，载气流速1.5 mL/min；升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温到100 ℃保持5 min；以4 ℃/min升温到140 ℃保持10 min；以4 ℃/min升温到180 ℃保持10 min；以4 ℃/min升温到250 ℃保持5 min。
MS条件：离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子轰击（electron impact，EI）电离70 eV，50～550 m/z全扫描。通过保留时间与NIST 2.0质谱数据库比对进行鉴定，相似指数和反相似指数均大于800的为鉴定化合物；通过峰面积计算化合物的相对含量。
1.3.4.5 品质综合评价
根据前期研究，确定感官评分（U1）、总色差（ΔEab）（U2）、水分含量（U3）、总酸含量（U4）、TVB-N含量（U5）、亚硝酸盐含量（U6）、硬度（U7）、弹性（U8）和咀嚼性（U9）的指标范围：U1=55～70 分，U2=6～15，U3=50%～65%，U4=3～5 g/kg，
U5=25%～45%，U6=0.5～4.0 mg/kg，U7=10～60 N，U8=2～3 mm，U9=10～25 mJ。为进行模糊综合评价，计算隶属度值，根据线性模型建立如下隶属度：
1.4 数据处理
采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行回归分析、方差分析及邓肯检验。使用数据均为6 次平行实验的平均值。
2 结果与分析
2.1 关键工艺参数单因素试验结果
2.1.1 发酵温度
由表3可知，随着发酵温度的升高，牦牛酸醡肉各品质指标变化显著。随着发酵温度的升高，牦牛酸醡肉的ΔEab、硬度与咀嚼性显著提高，且均在35 ℃时达到最大值，分别为15.43、38.43 N和22.43 mJ，相较于15 ℃时高出114.01%、190.03%和85.06%；总酸、亚硝酸盐及TVB-N含量随着发酵温度的升高而显著增加，最大值分别为5.12 g/kg、4.74 mg/kg和82.29 mg/kg，相较于15 ℃时显著高出213.91%、228.25%和22.78%；水分含量显著降低，在35 ℃时出现最小值47%；感官评分与品质综合评分均呈现先显著增加后显著减小的趋势，在25 ℃出现峰值，分别为74.60 分和0.42 分。综上所述，适宜牦牛酸醡肉的发酵温度范围为20～25 ℃。
2.1.2 发酵时间
由表4可知，随着发酵时间的延长，牦牛酸醡肉的品质指标变化显著。随着发酵时间的延长，ΔEab、硬度与咀嚼性显著提高，峰值分别为13.23、58.50 N和21.99 mJ，相较于发酵30 h时显著提高42.26%、273.80%和145.97%；总酸、亚硝酸盐及TVB-N含量均呈显著增加趋势，且均在发酵54 h时含量最高，分别为
3.43 g/kg、4.27 mg/kg和45.85 mg/kg，相较发酵30 h时显著高出257.29%、42.56%和6.75%；感官评分与综合评分呈现先显著上升后显著下降的趋势，在发酵42 h时出现峰值，分别为74.60 分和0.35 分。综上所述，牦牛酸醡肉的適宜发酵时间范围为36～42 h。
2.2 关键工艺参数响应面优化试验结果
2.2.1 响应面试验设计与结果
以发酵温度和发酵时间为自变量，以综合评分为响应值进行Box-Benhnken实验设计，Box-Benhnken实验设计结构矩阵及实验结果如表5所示。
2.2.2 模型的建立与显著性检验
利用Design-Expert响应面分析软件进行回归拟合分析，得到的二次多项式模型为Y=0.848 6+0.005 0A+0.036 6B+0.017 5AB-0.080 1A2-0.075 1B2。
由表6可知，模型P=0.000 3<0.01（极显著），而失拟项不显著（P=0.221 3>0.05），表明模型具有较好的拟合性，试验误差较小。R2=0.946 5，R2Adj=0.908 3，表明90.83%的响应值数据可以用该模型进行解释，其变异系数2.91%低于15%，表明该模型的重现性较好，可用于酸醡肉的工艺优化。模型中A2、B2、B具有极显著影响
（P<0.01），各因子对综合评分的影响排序为B>A。
由图2可知，响应面坡度较陡，说明因素A、B对牦牛酸醡肉综合评分的影响较大。A在20～25 ℃，B在36～42 h的范围内存在极值。根据Box-Behnken响应面法，拟合所得的最优工艺条件为22.5 ℃发酵39 h，此条件下牦牛酸醡肉的综合评分预测值为0.934 分。为便于实际操作，将发酵条件调整为22 ℃发酵40 h，此条件下进行6 次平行实验，牦牛酸醡肉的综合评分（0.916±0.230） 分，与模型预测结果基本一致，表明该模型可信。
2.3 标准化加工川西藏区牦牛酸醡肉的质量标准
感官标准：成品呈深红褐色且有光泽；有适宜发酵香味，无胺味；酸辣咸甜酸味兼备，口感协调柔和；组织状态致密，口感富有弹性。
理化标准：水分含量50%～55%，总酸含量4.0～4.5 g/kg，亚硝酸盐含量<0.5 mg/kg，TVB-N 含量<30 mg/kg，蛋白质含量>20%。
2.4 标准化加工川西藏区牦牛酸醡肉的营养价值及风味成分分析
2.4.1 氨基酸成分分析
由表7可知，牦牛酸醡肉氨基酸结构合理，含量较高，共检测出16 种氨基酸，总量为21.3 g/100 g，其中必需氨基酸7 种，总量为9.11 g/100 g，检测过程中色氨酸及半胱氨酸被破坏。根据FAO/WHO的规定[24-25]，优质蛋白质的EAA/TAA应在40%左右，EAA/NEAA应在60%以上。牦牛酸醡肉的EAA/NEAA值为69.43%，EAA/TAA值为40.98%，其氨基酸组成符合FAO/WHO关于优质蛋白质的规定，表明牦牛酸醡肉含优质蛋白质，营养价值较高。牦牛酸醡肉中呈味氨基酸的总含量为8.90 g/100 g，占总氨基酸含量的45.08%，其中谷氨酸含量最高，天冬氨酸次之。通过必需氨基酸评分可知，牦牛酸醡肉中赖氨酸的AAS和CS最高，分别为36.00和30.51，而酪氨酸的AAS和CS最低，分别为19.17和12.04，为牦牛酸醡肉的第一限制性氨基酸。因此，川西藏区牦牛酸醡肉在精深加工时可通过强化酪氨酸进一步提高其氨基酸生物利用率和蛋白質的营养价值。
2.4.2 挥发性风味成分分析
利用顶空固相微萃取-GC-MS技术检测成品牦牛酸醡肉的挥发性成分，其总离子流图如图3所示。
由表8可知，经标准图谱库比对，共鉴定出114 种挥发性物质，以碳氢化合物（53 种）、醇类（35 种）、酯类（27 种）、醚类（3 种）为主，总含量均大于5%，主要为2-甲氧基-4-乙烯苯酚（1.733 4%）、姜烯（1.684 2%）、芳樟醇（29.520 3%）、乙醇（3.422 6%）、2，3-丁二醇（2.659 1%）、松油烯醇-4（1.160 9%）、乙酸乙酯（1.598 6%）、乙酸芳樟酯（1.292 2%）和反-茴香脑（31.833 6%）。此外，还有醛类（12 种）、酚类（7 种）、酸类（7 种）、酮类（14 种）和含氮化合物（9 种），主要为十六醛（1.860 6%）、丁香酚（1.434 1%）和乙酸（1.500 0%）。
醇类占挥发性物质总含量的41.926%，为肉制品提供花果香、甜香和黄油香等香味物质，样品中的芳樟醇阈值较低（6×10-3 mg/L[26]），含量较高，是肉制品的特征风味物质之一。酯类物质占总挥发性物质含量的5.781%，阈值低，不仅能够给人花香、乳香等生理印象，还可以掩盖游离脂肪酸带来的不愉快味道[27]，对肉制品的风味有重要贡献。酸类物质占总挥发性物质含量的2.180%，其主要来源于微生物的代谢反应，在牦牛酸醡肉成熟过程中起较大作用[28]，是酸味的主要来源，对产品风味有重要贡献。
3 结 论
以感官评分为目标参数，综合评分为响应值进行响应面设计优化牦牛酸醡肉的发酵工艺，并进行成品品质特性分析。通过单因素试验可知，在20～25 ℃温度范围内，发酵36～48 h时牦牛酸醡肉的感官品质较好，综合得分较高。关键工艺参数响应面优化试验结果表明，发酵时间与发酵温度对牦牛酸醡肉品质有较大影响，其中发酵温度显著影响酸醡肉的综合得分（P<0.05），最佳发酵工艺参数为22 ℃发酵40 h。优化的成品川西藏区牦牛酸醡肉中含16 种氨基酸，其中必需氨基酸7 种，
EAA/TAA为40.98%；呈味氨基酸的总含量为4.67 g/100 g，占总氨基酸含量的45.08%；酪氨酸的AAS和CS最低，是牦牛酸醡肉的第一限制性氨基酸。标准化加工后的川西藏区牦牛酸醡肉中共检出挥发性物质114 种，以碳氢化合物（53 种）、醇类（35 种）、酯类（27 种）及醚类（3 种）为主，酸醡肉的主体香味可能由醇类、酯类及酸类物质提供。
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