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摘要：为加强高致病性禽流感的防控，采集了宁远县某蛋鸡场血样，对（ H5+H7）二价灭活疫苗的抗体水平进行了检测，结果表明该蛋鸡场免疫效果良好，（ H5+H7）二价灭活疫苗能提供有效保护。
关键词：（ H5+H7）抗体水平;检测;鸡
中图分类号：S858.31
文献标识码：B
doi：1 0.3969/j.issn.2096-3637.2019.17.005
0引言
高致病性禽流感病毒全称禽类流行性感冒病毒，是由禽甲型流感病毒毒株引起的急性呼吸道传染病[1]，其中H5、H7是近年较流行且对人类健康及其生态环境造成巨大危害的疫病[2]。为加强动物H5、H7的防控，本文结合永州市宁远县某蛋鸡场实际情况，采用血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）方法对永州市宁远县某蛋鸡场（H5+H7）二价灭活疫苗抗体水平进行检测，根据《永州市高致病性禽流感免疫计划通知》[永牧办发（ 2019）3号]相关规定，结果表明该蛋鸡场免疫效果良好， （ H5+H7）二价灭活疫苗能提供有效保护。
1 材料
1.1被检血清
被检血清来自湖南省永州市宁远县冷水镇毛家村7组毛真斌蛋鸡场，共10份。血清新鲜清亮，不溶血。
1.2检测试剂
抗原选自哈尔滨国生生物科技有限公司，批号为201808150107，PBS缓冲液（PH 7.2，0.01mol/L）自配。
1.3器材
96孔V型（ 90°）微量反应板、10～100uL单道及多道微量移液器（配有吸头）、微量振荡器、恒温培养箱等器材。
2方法与步骤
2.1血凝（HA）试验
H5、H7各设2排，96孔V型（90°）微量反应板的1 ～12孔加入0.025 mL的PBS液;换新的滴头，加入0.025mL抗原到第1孔吹吸混匀，对倍稀释至第11孔。从第11孔吸入0.025 mL后弃去，换滴头进行下一步操作;1～ 12孔加入0.025 mL的PBS;1～12孔加入0.025 mL的1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液放置室温充分混匀后再使用）。振荡混匀1 ～2 min，室温（20 ～ 25℃）下静置25～ 30 min。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底后观察结果。
2.2抗原回滴试验
H5、H7各设2排，每排设6孔;1～6列每孔加0.025 mL的PBS液;1-2列每孔加0.025 mL的4HAU病毒抗原，从第2列稀释到第5列，第5列弃去。2～6列每孔补加0.025 mL的PBS;每孔加入0.025 mL的1%红细胞悬液，震荡摇匀1～2mm后静置30 min，观察结果。此试验主要是检测4HAU抗原浓度是否配制正确[3]。
2.3血凝抑制（HI）试验
微量反应板的1～11孔加入0.025 mL的PBS，第12孔加入0.05 mL的PBS液;按顺序从标记好的样本血清中吸取0.025 mL加入到第1孔吹洗混匀，倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025 mL弃去，换滴头进行下一步操作;1～11孔均加入4HAU已稀释混匀的抗原液0.025 mL，在室温（约20℃）静置30～40 min后进行下一步操作;1～12孔加入0.025 mL的1%的鸡红细胞悬液，置微量振荡器上混匀约1～2 min，静置约25～30 min（室温20℃左右），对照孔出现明显纽扣状沉入孔底后观察结果。
3注意事项
需严格控制试验条件如控制红细胞悬液和抗原工作浓度、试验温度与其作用时间;应使用pH值为7.0～7.2的PBS作稀釋液;配好后做抗原回滴试验确保浓度的准确性;冻干抗原开封溶解后，置-15℃冷冻保存，反复冻融应不超过20次。2～8℃保存时会出现凝胶现象。
4结果
检测结果纪录如下：“#”表示凝集，“+”表示稍显凝集者， “-”表示RBC沉于孔底：（不凝集）。血凝（ HA）效价：呈“#”凝集时的最高稀释倍数为它的效价，此时的稀释度为1个血凝单位，除以4即为含4HUA的抗原稀释倍数。血凝抑制（ HI）效价：呈“-”完全抑制血凝的最高血清稀释度为它的效价。由表1可知，H5 HA的最高稀释倍数为第6孔、4HUA抗原稀释倍数为1：16，H7 HA的最高稀释倍数为第7孔、4HUA抗原稀释倍数为1：32;由表2可知第3孔完全凝集，第4孔半流，抗原浓度配制正确。由表3可知，样品H5 HI的效价均>26，由表4可知，样品H7 HI的效价均>24。
5结论
根据《永州市高致病性禽流感免疫计划通知》（永牧办发[2019]3号）中规定，血凝抑制试验（HI）抗体滴度≥4log2判为合格;样品H5 HI的效价均≥26，H7 HI的效价均≥24，均判为抗体阳性，免疫效果良好，能提供有效保护。
参考文献
[1]薛敏开，徐正军，董永毅，等.重组禽流感病毒（ H5+H7）二价灭活疫苗免疫高邮鸭效果观察[J].中国家禽，2018，40（15）：63-65.
[2]冯肖肖，吴赟兹，吴雪军，等.重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗对鸡和鸭的免疫效果观察[J].中国兽医杂志，2019，55 （2）：8-14.
[3]李志贤，虞与理，禹婷婷.三黄鸡免疫重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗血清抗体检测试验报告[J].兽医导刊，2018（ 19）：69-71.
作者简介：李荣祥（1963-），湖南宁远人，兽医师，研究方向：动物养殖技术指导与疫病防控。
通信作者：宋果，研究方向：畜禽疫病的预防与诊断，邮箱：302609397@qq.com。
关键词：（ H5+H7）抗体水平;检测;鸡
中图分类号：S858.31
文献标识码：B
doi：1 0.3969/j.issn.2096-3637.2019.17.005
0引言
高致病性禽流感病毒全称禽类流行性感冒病毒，是由禽甲型流感病毒毒株引起的急性呼吸道传染病[1]，其中H5、H7是近年较流行且对人类健康及其生态环境造成巨大危害的疫病[2]。为加强动物H5、H7的防控，本文结合永州市宁远县某蛋鸡场实际情况，采用血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）方法对永州市宁远县某蛋鸡场（H5+H7）二价灭活疫苗抗体水平进行检测，根据《永州市高致病性禽流感免疫计划通知》[永牧办发（ 2019）3号]相关规定，结果表明该蛋鸡场免疫效果良好， （ H5+H7）二价灭活疫苗能提供有效保护。
1 材料
1.1被检血清
被检血清来自湖南省永州市宁远县冷水镇毛家村7组毛真斌蛋鸡场，共10份。血清新鲜清亮，不溶血。
1.2检测试剂
抗原选自哈尔滨国生生物科技有限公司，批号为201808150107，PBS缓冲液（PH 7.2，0.01mol/L）自配。
1.3器材
96孔V型（ 90°）微量反应板、10～100uL单道及多道微量移液器（配有吸头）、微量振荡器、恒温培养箱等器材。
2方法与步骤
2.1血凝（HA）试验
H5、H7各设2排，96孔V型（90°）微量反应板的1 ～12孔加入0.025 mL的PBS液;换新的滴头，加入0.025mL抗原到第1孔吹吸混匀，对倍稀释至第11孔。从第11孔吸入0.025 mL后弃去，换滴头进行下一步操作;1～ 12孔加入0.025 mL的PBS;1～12孔加入0.025 mL的1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液放置室温充分混匀后再使用）。振荡混匀1 ～2 min，室温（20 ～ 25℃）下静置25～ 30 min。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底后观察结果。
2.2抗原回滴试验
H5、H7各设2排，每排设6孔;1～6列每孔加0.025 mL的PBS液;1-2列每孔加0.025 mL的4HAU病毒抗原，从第2列稀释到第5列，第5列弃去。2～6列每孔补加0.025 mL的PBS;每孔加入0.025 mL的1%红细胞悬液，震荡摇匀1～2mm后静置30 min，观察结果。此试验主要是检测4HAU抗原浓度是否配制正确[3]。
2.3血凝抑制（HI）试验
微量反应板的1～11孔加入0.025 mL的PBS，第12孔加入0.05 mL的PBS液;按顺序从标记好的样本血清中吸取0.025 mL加入到第1孔吹洗混匀，倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025 mL弃去，换滴头进行下一步操作;1～11孔均加入4HAU已稀释混匀的抗原液0.025 mL，在室温（约20℃）静置30～40 min后进行下一步操作;1～12孔加入0.025 mL的1%的鸡红细胞悬液，置微量振荡器上混匀约1～2 min，静置约25～30 min（室温20℃左右），对照孔出现明显纽扣状沉入孔底后观察结果。
3注意事项
需严格控制试验条件如控制红细胞悬液和抗原工作浓度、试验温度与其作用时间;应使用pH值为7.0～7.2的PBS作稀釋液;配好后做抗原回滴试验确保浓度的准确性;冻干抗原开封溶解后，置-15℃冷冻保存，反复冻融应不超过20次。2～8℃保存时会出现凝胶现象。
4结果
检测结果纪录如下：“#”表示凝集，“+”表示稍显凝集者， “-”表示RBC沉于孔底：（不凝集）。血凝（ HA）效价：呈“#”凝集时的最高稀释倍数为它的效价，此时的稀释度为1个血凝单位，除以4即为含4HUA的抗原稀释倍数。血凝抑制（ HI）效价：呈“-”完全抑制血凝的最高血清稀释度为它的效价。由表1可知，H5 HA的最高稀释倍数为第6孔、4HUA抗原稀释倍数为1：16，H7 HA的最高稀释倍数为第7孔、4HUA抗原稀释倍数为1：32;由表2可知第3孔完全凝集，第4孔半流，抗原浓度配制正确。由表3可知，样品H5 HI的效价均>26，由表4可知，样品H7 HI的效价均>24。
5结论
根据《永州市高致病性禽流感免疫计划通知》（永牧办发[2019]3号）中规定，血凝抑制试验（HI）抗体滴度≥4log2判为合格;样品H5 HI的效价均≥26，H7 HI的效价均≥24，均判为抗体阳性，免疫效果良好，能提供有效保护。
参考文献
[1]薛敏开，徐正军，董永毅，等.重组禽流感病毒（ H5+H7）二价灭活疫苗免疫高邮鸭效果观察[J].中国家禽，2018，40（15）：63-65.
[2]冯肖肖，吴赟兹，吴雪军，等.重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗对鸡和鸭的免疫效果观察[J].中国兽医杂志，2019，55 （2）：8-14.
[3]李志贤，虞与理，禹婷婷.三黄鸡免疫重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗血清抗体检测试验报告[J].兽医导刊，2018（ 19）：69-71.
作者简介：李荣祥（1963-），湖南宁远人，兽医师，研究方向：动物养殖技术指导与疫病防控。
通信作者：宋果，研究方向：畜禽疫病的预防与诊断，邮箱：302609397@qq.com。