论文部分内容阅读
玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和烟曲霉毒素的各种生物标记物可用来证明两种酶制剂降解玉米赤霉烯酮和烟曲霉毒素的体内功效和两种木质纤维素吸附剂无法吸附猪胃肠道中的玉米赤霉烯酮。
1 生物标记物
体外试验是开发霉菌毒素脱毒剂的关键步骤。然而，为了评估霉菌毒素脱毒剂在动物体内的功效，体内研究是必需的。评估霉菌毒素暴露和脱毒程度的最适指标，是霉菌毒素的生物标记物。生物标记物和生物基质的选择取决于很多因素，如日粮中霉菌毒素的浓度，暴露时间长度，霉菌毒素本身及其脱毒产品的吸收、代谢和排泄，还取决于霉菌毒素改变动物代谢过程和对动物物种影响的能力。非创伤性的生物标记最合适，选择生物基质的其他标准是霉菌毒素灭活的机理。本文将着重介绍用来研究猪胃肠道中镰刀菌属霉菌毒素（玉米赤霉烯酮）和烟曲霉毒素B1 B2（Fumonisins B1 B2，FB1 FB2，FUMs）失活的生物标记物。
2 尿液肌酸酐作为生物标记物
饲料中添加霉菌毒素脱毒剂的主要目的是降低霉菌毒素的生物利用率。此目标可以通过使用与吸附剂发生不可逆吸附或利用酶或微生物降解使毒素失活来实现。评估这两种类型饲料添加剂功效最直接的方法是监测效应生物标记物的变化（然而，这只适用于某些霉菌毒素）或者比较正对照组和试验组中吸收的霉菌毒素母体及其天然代谢物的总摩尔浓度。对猪来讲，测定被吸收化合物总浓度的两种可能基质是尿液和血清。由于尿液样本水分含量的不同，将总浓度（一种排泄速度相对恒定的生物标志物）为参照进行标准化是进行可靠比较的关键。
3 霉菌毒素代谢物作为其他生物标记物
吸附剂的适用性取决于对霉菌毒素母体生物利用率的降低程度，而根据动物肠道中酶或微生物的降解，酶或微生物降解类饲料添加剂可作为测试饲料添加剂适用性的其他生物标记物。较难被吸收的霉菌毒素降解产物以及通过胆汁排泄部分被运送到胃肠道中的霉菌毒素降解作用，都可以通过分析粪便中霉菌毒素代谢产物组成来进行评估。 表1列出了测定吸附剂、酶和微生物在猪胃肠道中灭活玉米赤霉烯酮和烟曲霉毒素功效的可能生物标记物。
玉米赤霉烯酮很容易被猪的胃肠道吸收，一部分降解成为α-玉米赤霉醇（α-Zeranol，α-ZEL）。玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉醇大部分可以发生葡糖醛酸化反应，并通过尿液排出。因此，可以根据尿中ZEN代谢物的总摩尔浓度来选择检测饲料添加剂功效的生物标记物，总摩尔浓度可以通过直接分析葡糖醛酸苷态的ZEN浓度或分析经β-葡糖醛酸酶水解后的ZEN浓度获得。与玉米赤霉烯酮不同，烟曲霉毒素不易被猪的胃肠道吸收，从而导致粪便中烟曲霉毒素浓度很高，而血液和尿液中浓度很低。因此，粪便中烟曲霉毒素的组成状况是最容易检测的毒素暴露生物标记物。然而，这并不能准确反映吸收时烟曲霉毒素的组成状况，因为未被吸收的烟曲霉毒素在通过粪便排出前可能会被进一步转化。此外，检测粪便中烟曲霉毒素的浓度不适用于评定吸附剂的功效。然而，与玉米赤霉烯酮相比，效应生物标记物的存在简化了烟曲霉毒素的体内试验研究：烟曲霉毒素暴露会扰乱鞘脂类代谢，导致血液中鞘氨基醇碱鞘胺醇（Sphinganine，Sa）对二氢鞘氨醇（Sphingosine，So）的比例发生变化。然而Sa/So比例的升高取决于烟曲霉毒素的浓度和暴露的时间长度。因此，通常将作为暴露生物标记物的粪便中烟曲霉毒素组成与作为效应生物标记物的Sa/So比例结合起来，用来评估烟曲霉毒素脱毒剂类饲料添加剂的功效。
4 生物标记方法在动物试验中的应用
霉菌毒素脱毒剂体内功效的可靠研究需要精心设计动物试验，包括1个饲喂基础日粮的负对照组，1个被目标霉菌毒素污染的正对照组以及1个或多个添加饲料添加剂的受霉菌毒素污染的试验组日粮。此外，每个处理组的动物要足够多，这样才能消除动物个体差异对霉菌毒素母体的代谢和降解造成的影响。
利用生物标记物研究ZEN的酶解效应的一个实例，是评估能在体外将ZEN转化为水解玉米赤霉烯酮（Hydrolyzed Zearalenone，HZEN）的内酯水解酶的体内功效（图1）。试验猪采食含500 μg/kg ZEN的日粮（正对照）或添加了内酯水解酶的相同日粮4 d，然后收集尿样和粪样。处理组动物尿液中未检出ZEN和ZEN-葡糖苷酸，再加上检出HZEN、脱羧水解玉米赤霉烯酮（HZEN自发脱羧的产物）以及这些物质的葡糖苷酸代谢物，这就证实了具有在猪胃肠道中把ZEN水解为HZEN的能力。粪便样本分析发现，试验组的一些猪粪便含有微量的ZEN，但未检测到任何葡糖醛酸化态物质，从另一个方面证实了尿样分析的结果。
与ZEN不同，烟曲霉毒素很难被猪的胃肠道吸收，这使得粪便中的烟曲霉毒素浓度最高，而血液和尿液中浓度较低。
另一个试验评估了之前在体外试验中显示90%以上吸收率的两种木质纤维素吸附剂在猪体内的功效。将尿液中ZEN代谢物的总摩尔浓度用作生物标记物。由于日粮中ZEN的含量较低——仅150 μg/kg，ZEN-葡糖苷酸是尿液中唯一含量高于该检测线的代谢产物。按肌酸酐含量进行标准化后，ZEN正对照组和两个木质纤维素吸附剂处理组的试验猪尿液中ZEN-葡糖苷酸浓度没有显著差异，表明木质纤维素吸附剂在本试验中不能阻止玉米赤霉烯酮的吸收。
5 测定烟曲霉毒素酯酶效果的试验
最后，进行了两个猪饲养试验，以此研究烟曲霉毒素酶（以下称为饲料添加剂）效果和最适添加量；烟曲霉毒素酶是一种羧酸酯酶，旨在将FB1分解为毒性较小的水解衍生物（Hydrolyzed Fumonisin B1，HFB1）（图1）。
在第一个试验中，每个处理6头猪，试验日粮为：正对照日粮（日粮的FB1、FB2含量分别为5 mg/kg和1 mg/kg）、处理日粮（日粮相同但加入饲料添加剂）、或负对照日粮（未被污染的日粮），试验为期5周。只采集血浆样本，并且只检测试验猪血清Sa/So比值。连续饲喂3周后，正对照组的试验猪血清Sa/So比值显著增加。在试验结束时，正对照组的平均Sa/So比值从原来的0.12进一步增加至0.85，然而负对照组和添加剂组则保持不变。
在第二个试验中，日粮FB1 FB2浓度增加到（30 9） mg/kg。试验猪分入1个日粮受烟曲霉毒素污染的正对照组、4个污染日粮及加有不同浓度添加剂的处理组以及1个日粮未被烟曲霉毒素污染的负对照组。本试验检测了血清Sa/So比值、粪便和尿液的烟曲霉毒素浓度。仅一周后，正对照组的试验猪血清Sa/So比值从0.20显著提高到0.92，而负对照组和含有添加剂的处理组试验猪都没有显著变化。通过分析粪便样本证实，血清Sa/So比值的提高与饲料添加剂的浓度有着间接的相关性。随着饲料添加剂浓度的增加，粪便中FB1和FB2的浓度逐渐降低，然而HFB1和HFB2的浓度却逐渐增加。和预想的一样，与粪便样相比，尿液中烟曲霉毒素稍微偏向于非水解态，但是从尿液样本中可明显地发现，随着添加剂添加量的增加，尿液中的FB1和FB2的浓度逐渐降低。原题名：Assessing mycotoxin detoxification methods in feed（英文）
原作者：Heidi Schwartz-Zimmermann[自然资源与生命科学大学（BOKU），维也纳]
1 生物标记物
体外试验是开发霉菌毒素脱毒剂的关键步骤。然而，为了评估霉菌毒素脱毒剂在动物体内的功效，体内研究是必需的。评估霉菌毒素暴露和脱毒程度的最适指标，是霉菌毒素的生物标记物。生物标记物和生物基质的选择取决于很多因素，如日粮中霉菌毒素的浓度，暴露时间长度，霉菌毒素本身及其脱毒产品的吸收、代谢和排泄，还取决于霉菌毒素改变动物代谢过程和对动物物种影响的能力。非创伤性的生物标记最合适，选择生物基质的其他标准是霉菌毒素灭活的机理。本文将着重介绍用来研究猪胃肠道中镰刀菌属霉菌毒素（玉米赤霉烯酮）和烟曲霉毒素B1 B2（Fumonisins B1 B2，FB1 FB2，FUMs）失活的生物标记物。
2 尿液肌酸酐作为生物标记物
饲料中添加霉菌毒素脱毒剂的主要目的是降低霉菌毒素的生物利用率。此目标可以通过使用与吸附剂发生不可逆吸附或利用酶或微生物降解使毒素失活来实现。评估这两种类型饲料添加剂功效最直接的方法是监测效应生物标记物的变化（然而，这只适用于某些霉菌毒素）或者比较正对照组和试验组中吸收的霉菌毒素母体及其天然代谢物的总摩尔浓度。对猪来讲，测定被吸收化合物总浓度的两种可能基质是尿液和血清。由于尿液样本水分含量的不同，将总浓度（一种排泄速度相对恒定的生物标志物）为参照进行标准化是进行可靠比较的关键。
3 霉菌毒素代谢物作为其他生物标记物
吸附剂的适用性取决于对霉菌毒素母体生物利用率的降低程度，而根据动物肠道中酶或微生物的降解，酶或微生物降解类饲料添加剂可作为测试饲料添加剂适用性的其他生物标记物。较难被吸收的霉菌毒素降解产物以及通过胆汁排泄部分被运送到胃肠道中的霉菌毒素降解作用，都可以通过分析粪便中霉菌毒素代谢产物组成来进行评估。 表1列出了测定吸附剂、酶和微生物在猪胃肠道中灭活玉米赤霉烯酮和烟曲霉毒素功效的可能生物标记物。
玉米赤霉烯酮很容易被猪的胃肠道吸收，一部分降解成为α-玉米赤霉醇（α-Zeranol，α-ZEL）。玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉醇大部分可以发生葡糖醛酸化反应，并通过尿液排出。因此，可以根据尿中ZEN代谢物的总摩尔浓度来选择检测饲料添加剂功效的生物标记物，总摩尔浓度可以通过直接分析葡糖醛酸苷态的ZEN浓度或分析经β-葡糖醛酸酶水解后的ZEN浓度获得。与玉米赤霉烯酮不同，烟曲霉毒素不易被猪的胃肠道吸收，从而导致粪便中烟曲霉毒素浓度很高，而血液和尿液中浓度很低。因此，粪便中烟曲霉毒素的组成状况是最容易检测的毒素暴露生物标记物。然而，这并不能准确反映吸收时烟曲霉毒素的组成状况，因为未被吸收的烟曲霉毒素在通过粪便排出前可能会被进一步转化。此外，检测粪便中烟曲霉毒素的浓度不适用于评定吸附剂的功效。然而，与玉米赤霉烯酮相比，效应生物标记物的存在简化了烟曲霉毒素的体内试验研究：烟曲霉毒素暴露会扰乱鞘脂类代谢，导致血液中鞘氨基醇碱鞘胺醇（Sphinganine，Sa）对二氢鞘氨醇（Sphingosine，So）的比例发生变化。然而Sa/So比例的升高取决于烟曲霉毒素的浓度和暴露的时间长度。因此，通常将作为暴露生物标记物的粪便中烟曲霉毒素组成与作为效应生物标记物的Sa/So比例结合起来，用来评估烟曲霉毒素脱毒剂类饲料添加剂的功效。
4 生物标记方法在动物试验中的应用
霉菌毒素脱毒剂体内功效的可靠研究需要精心设计动物试验，包括1个饲喂基础日粮的负对照组，1个被目标霉菌毒素污染的正对照组以及1个或多个添加饲料添加剂的受霉菌毒素污染的试验组日粮。此外，每个处理组的动物要足够多，这样才能消除动物个体差异对霉菌毒素母体的代谢和降解造成的影响。
利用生物标记物研究ZEN的酶解效应的一个实例，是评估能在体外将ZEN转化为水解玉米赤霉烯酮（Hydrolyzed Zearalenone，HZEN）的内酯水解酶的体内功效（图1）。试验猪采食含500 μg/kg ZEN的日粮（正对照）或添加了内酯水解酶的相同日粮4 d，然后收集尿样和粪样。处理组动物尿液中未检出ZEN和ZEN-葡糖苷酸，再加上检出HZEN、脱羧水解玉米赤霉烯酮（HZEN自发脱羧的产物）以及这些物质的葡糖苷酸代谢物，这就证实了具有在猪胃肠道中把ZEN水解为HZEN的能力。粪便样本分析发现，试验组的一些猪粪便含有微量的ZEN，但未检测到任何葡糖醛酸化态物质，从另一个方面证实了尿样分析的结果。
与ZEN不同，烟曲霉毒素很难被猪的胃肠道吸收，这使得粪便中的烟曲霉毒素浓度最高，而血液和尿液中浓度较低。
另一个试验评估了之前在体外试验中显示90%以上吸收率的两种木质纤维素吸附剂在猪体内的功效。将尿液中ZEN代谢物的总摩尔浓度用作生物标记物。由于日粮中ZEN的含量较低——仅150 μg/kg，ZEN-葡糖苷酸是尿液中唯一含量高于该检测线的代谢产物。按肌酸酐含量进行标准化后，ZEN正对照组和两个木质纤维素吸附剂处理组的试验猪尿液中ZEN-葡糖苷酸浓度没有显著差异，表明木质纤维素吸附剂在本试验中不能阻止玉米赤霉烯酮的吸收。
5 测定烟曲霉毒素酯酶效果的试验
最后，进行了两个猪饲养试验，以此研究烟曲霉毒素酶（以下称为饲料添加剂）效果和最适添加量；烟曲霉毒素酶是一种羧酸酯酶，旨在将FB1分解为毒性较小的水解衍生物（Hydrolyzed Fumonisin B1，HFB1）（图1）。
在第一个试验中，每个处理6头猪，试验日粮为：正对照日粮（日粮的FB1、FB2含量分别为5 mg/kg和1 mg/kg）、处理日粮（日粮相同但加入饲料添加剂）、或负对照日粮（未被污染的日粮），试验为期5周。只采集血浆样本，并且只检测试验猪血清Sa/So比值。连续饲喂3周后，正对照组的试验猪血清Sa/So比值显著增加。在试验结束时，正对照组的平均Sa/So比值从原来的0.12进一步增加至0.85，然而负对照组和添加剂组则保持不变。
在第二个试验中，日粮FB1 FB2浓度增加到（30 9） mg/kg。试验猪分入1个日粮受烟曲霉毒素污染的正对照组、4个污染日粮及加有不同浓度添加剂的处理组以及1个日粮未被烟曲霉毒素污染的负对照组。本试验检测了血清Sa/So比值、粪便和尿液的烟曲霉毒素浓度。仅一周后，正对照组的试验猪血清Sa/So比值从0.20显著提高到0.92，而负对照组和含有添加剂的处理组试验猪都没有显著变化。通过分析粪便样本证实，血清Sa/So比值的提高与饲料添加剂的浓度有着间接的相关性。随着饲料添加剂浓度的增加，粪便中FB1和FB2的浓度逐渐降低，然而HFB1和HFB2的浓度却逐渐增加。和预想的一样，与粪便样相比，尿液中烟曲霉毒素稍微偏向于非水解态，但是从尿液样本中可明显地发现，随着添加剂添加量的增加，尿液中的FB1和FB2的浓度逐渐降低。原题名：Assessing mycotoxin detoxification methods in feed（英文）
原作者：Heidi Schwartz-Zimmermann[自然资源与生命科学大学（BOKU），维也纳]