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【摘 要】目的：筛选与鉴定根管再感染相关病原菌，找出导致根管治疗失败的主要微生物，对目前常用的根管机械和化学预备方法进行评价，提出根管再治疗的方法和手段，从而提高临床根管再治疗的疗效。方法：收集根管治疗失败再感染根管样本，提取并分析样本中细菌的检出率。结果：粪肠球菌占67%。普氏消化链球菌占10%，星座链球菌占10%，微小消化链球菌占6.5%，血链球菌占6.5%。结论：粪肠球菌与根管治疗失败关系密切，是根管内感染的重要致病菌，目前的消毒药物对控制根管内粪肠球菌的生长尚存在一定的局限性。
【关键词】再感染根管；病原菌；根管机械和化学预备方法；根管治疗术
【中图分类号】R780.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2868-01
根管治疗失败的发生率目前在临床上达到30%～50%，究其原因，主要与根管微生物的残留有关，而残留的微生物则以根管生物膜的形式存在于根管当中。根管生物膜（root canal biofilm）作为细菌赖以生存的环境，其细菌组成不仅具有种群多样性，而且具有比以往所理解的更为复杂的生命活动，不同菌种间协同作用，相互黏附和聚集形成微菌落，使细菌具有更强的致病性。生物膜内细菌的耐药性比悬浮状态高1000倍[1]，难以被常规的根管预备方法、根管冲洗和消毒药物所彻底清除，并且能够抵抗机体的防御作用，导致根管治疗的失败[2]。
本项研究针对筛选与鉴定根管再感染相关病原菌，找出导致根管治疗失败的主要微生物，對目前常用的根管机械和化学预备方法进行评价，提出根管再治疗的方法和手段，从而提高临床根管再治疗的疗效。在国内，尚未见有应用PCR- DGGE方法对根管微生物进行检测的研究报道。
1 资料与方法
1.1临床资料 病例分组：
1）慢性根尖周炎组10例；2）根管治疗失败再治疗组10例。
1.2方法 隔湿，消毒，去除釉质、牙本质或残存充填材料，1%碘酊棉球消毒窝洞，低速球钻揭去髓室顶。髓腔清理，消毒，吹干；首先用15#K锉探通根管，到达根尖孔位置（根尖定位仪），将K锉置于含0.5mlRNA保护剂的Eppendorf管中，震荡。反复扩锉根管至40#。然后将消毒纸尖插入根管中30s，吸取根管内液（干燥根管滴入少许生理盐水），剪去纸尖上端干燥部分后置于Eppendorf管中，连续采样3次。-70℃冰箱保存样本备用。感染根管生物膜细菌群落多样性PCR-DGGE研究：Trizol提根管生物膜样本的总RNA，逆转录cDNA。利用细菌16SrRNA基因V3～ V5可变区的通用引物PCR扩增，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物，随后采用本课题组先期建立的口腔微生物PCR-DGGE检测技术，进行分离，将电泳条带切割、回收、克隆、测序，将所得序列输入到GeneBANK中比对，从而鉴定细菌种类，并构建系统发育树。同时对不同组别细菌构成对比分析；感染根管生物膜细菌Real-time PCR研究：针对前一部分试验PCR-DGGE筛选出的根管中优势菌属（如牙龈卟啉菌、粪肠球菌等），查找设计SYBR GreenⅠReal-time PCR 特异引物，并对上述样本进行定量检测分析。
1.3疗效评定标准 1） 慢性根尖周炎诊断标准：见《牙体牙髓病学》第二版，樊明文主编，人民卫生出版社出版。
2）根管治疗失败诊断标准：完善根管治疗一年以后，无症状和体征，咬合有轻度不适，X线片显示根尖周透射区变化不大；或有较明显症状和体征，不能行使咀嚼功能、X线片显示根尖周透射区变大或原来根尖周无异常者出现了透射区。（见《牙体牙髓病学》第二版，樊明文主编，人民卫生出版社出版。）
1.4统计学处理 计算各组细菌的检出率，采用X检验。利用SAS6.12软件包对结果进行统计学分析。
2 结果 再感染根管中，粪肠球菌是主要致病菌，其主要以生物膜形式存在，粪肠球菌具有很强的渗透能力，有助于其侵入牙本质小管内。研究表明，采用PCR法对根管治疗后持续感染的患牙进行细菌检测，粪肠球菌占67%。普氏消化链球菌占10%，星座链球菌占10%，微小消化链球菌占6.5%，血链球菌占6.5%。粪肠球菌在主根管不同部位的定植密度不同，在根尖段较密集，中上段较稀疏。粪肠球菌还可以渗透到机械及化学预备不到的根管分叉区、不规则区、根管峡部、侧支根管以及牙本质小管深部。
3 讨论 综上所述，粪肠球菌在治疗失败根管内的检出率较高，是根管持续感染和再感染的重要微生物之一。该菌可以与其他一些革兰阴性肠杆菌及酵母菌如假单胞菌、白色念珠菌混合感染根管。但根管中的细菌组成具有明显多样性，其中又有相当部分未获得培养，或难以通过常规的培养加以研究。粪肠球菌与根管治疗失败关系密切，是根管内感染的重要致病菌，目前的消毒药物对控制根管内粪肠球菌的生长尚存在一定的局限性。因此，寻找更有效的抑制粪肠球菌生长的根管消毒方法，提高临床上根管治疗的成功率，将成为今后研究的重点。
参考文献
[1] Johnson SA，Goddard PA，Iliffe C，et al.Comparative susceptibility of resident and transient hand bacteria to para-chloro-meta-xylenol and triclosan.J Appl Microbiol， 2002，93：336-344.
[2] Lewis K. Riddle of biofilm resistance.Antimicrob Agents Chemother，2001，45： 999-1007.
[3] Ferrari PH， Cai S， Bombana AC. Effect of endodontic procedures on enterococci， nteric bacteria and yeasts in primary endodontic infections.Int Endod J. 2005，38：372-380.
[4] Hubble TS， Hatton JF， Nallapareddy SR， et al. Influence of Enterococcus faecalis proteases and the collagen-binding protein， Ace， on adhesion to dentin. Oral Microbiol Immunol. 2003，18（2）：121-126.
【关键词】再感染根管；病原菌；根管机械和化学预备方法；根管治疗术
【中图分类号】R780.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2868-01
根管治疗失败的发生率目前在临床上达到30%～50%，究其原因，主要与根管微生物的残留有关，而残留的微生物则以根管生物膜的形式存在于根管当中。根管生物膜（root canal biofilm）作为细菌赖以生存的环境，其细菌组成不仅具有种群多样性，而且具有比以往所理解的更为复杂的生命活动，不同菌种间协同作用，相互黏附和聚集形成微菌落，使细菌具有更强的致病性。生物膜内细菌的耐药性比悬浮状态高1000倍[1]，难以被常规的根管预备方法、根管冲洗和消毒药物所彻底清除，并且能够抵抗机体的防御作用，导致根管治疗的失败[2]。
本项研究针对筛选与鉴定根管再感染相关病原菌，找出导致根管治疗失败的主要微生物，對目前常用的根管机械和化学预备方法进行评价，提出根管再治疗的方法和手段，从而提高临床根管再治疗的疗效。在国内，尚未见有应用PCR- DGGE方法对根管微生物进行检测的研究报道。
1 资料与方法
1.1临床资料 病例分组：
1）慢性根尖周炎组10例；2）根管治疗失败再治疗组10例。
1.2方法 隔湿，消毒，去除釉质、牙本质或残存充填材料，1%碘酊棉球消毒窝洞，低速球钻揭去髓室顶。髓腔清理，消毒，吹干；首先用15#K锉探通根管，到达根尖孔位置（根尖定位仪），将K锉置于含0.5mlRNA保护剂的Eppendorf管中，震荡。反复扩锉根管至40#。然后将消毒纸尖插入根管中30s，吸取根管内液（干燥根管滴入少许生理盐水），剪去纸尖上端干燥部分后置于Eppendorf管中，连续采样3次。-70℃冰箱保存样本备用。感染根管生物膜细菌群落多样性PCR-DGGE研究：Trizol提根管生物膜样本的总RNA，逆转录cDNA。利用细菌16SrRNA基因V3～ V5可变区的通用引物PCR扩增，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物，随后采用本课题组先期建立的口腔微生物PCR-DGGE检测技术，进行分离，将电泳条带切割、回收、克隆、测序，将所得序列输入到GeneBANK中比对，从而鉴定细菌种类，并构建系统发育树。同时对不同组别细菌构成对比分析；感染根管生物膜细菌Real-time PCR研究：针对前一部分试验PCR-DGGE筛选出的根管中优势菌属（如牙龈卟啉菌、粪肠球菌等），查找设计SYBR GreenⅠReal-time PCR 特异引物，并对上述样本进行定量检测分析。
1.3疗效评定标准 1） 慢性根尖周炎诊断标准：见《牙体牙髓病学》第二版，樊明文主编，人民卫生出版社出版。
2）根管治疗失败诊断标准：完善根管治疗一年以后，无症状和体征，咬合有轻度不适，X线片显示根尖周透射区变化不大；或有较明显症状和体征，不能行使咀嚼功能、X线片显示根尖周透射区变大或原来根尖周无异常者出现了透射区。（见《牙体牙髓病学》第二版，樊明文主编，人民卫生出版社出版。）
1.4统计学处理 计算各组细菌的检出率，采用X检验。利用SAS6.12软件包对结果进行统计学分析。
2 结果 再感染根管中，粪肠球菌是主要致病菌，其主要以生物膜形式存在，粪肠球菌具有很强的渗透能力，有助于其侵入牙本质小管内。研究表明，采用PCR法对根管治疗后持续感染的患牙进行细菌检测，粪肠球菌占67%。普氏消化链球菌占10%，星座链球菌占10%，微小消化链球菌占6.5%，血链球菌占6.5%。粪肠球菌在主根管不同部位的定植密度不同，在根尖段较密集，中上段较稀疏。粪肠球菌还可以渗透到机械及化学预备不到的根管分叉区、不规则区、根管峡部、侧支根管以及牙本质小管深部。
3 讨论 综上所述，粪肠球菌在治疗失败根管内的检出率较高，是根管持续感染和再感染的重要微生物之一。该菌可以与其他一些革兰阴性肠杆菌及酵母菌如假单胞菌、白色念珠菌混合感染根管。但根管中的细菌组成具有明显多样性，其中又有相当部分未获得培养，或难以通过常规的培养加以研究。粪肠球菌与根管治疗失败关系密切，是根管内感染的重要致病菌，目前的消毒药物对控制根管内粪肠球菌的生长尚存在一定的局限性。因此，寻找更有效的抑制粪肠球菌生长的根管消毒方法，提高临床上根管治疗的成功率，将成为今后研究的重点。
参考文献
[1] Johnson SA，Goddard PA，Iliffe C，et al.Comparative susceptibility of resident and transient hand bacteria to para-chloro-meta-xylenol and triclosan.J Appl Microbiol， 2002，93：336-344.
[2] Lewis K. Riddle of biofilm resistance.Antimicrob Agents Chemother，2001，45： 999-1007.
[3] Ferrari PH， Cai S， Bombana AC. Effect of endodontic procedures on enterococci， nteric bacteria and yeasts in primary endodontic infections.Int Endod J. 2005，38：372-380.
[4] Hubble TS， Hatton JF， Nallapareddy SR， et al. Influence of Enterococcus faecalis proteases and the collagen-binding protein， Ace， on adhesion to dentin. Oral Microbiol Immunol. 2003，18（2）：121-126.