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【摘要】本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，制备N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸；并采用液相色谱对中间体和目标产物进行了表征。
【关键词】L-蛋氨酸；甘氨酸；二肽；N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸；DCC缩合
我国饲料市场资源严重短缺，市场上仅有的饲料供不应求，而对饲料添加剂的需求也急速扩大[1，2]。蛋氨酸是合成蛋白质的一种非常重要的必需氨基酸，它在植物性蛋白中含量较少，主要存在于动物性蛋白中。蛋氨酸在体内不能直接合成或转化速度不能满足动物的正常生理需要，只能靠外源补充来满足动物对它的需要。甘氨酸作为一种非必需氨基酸，虽然能在动物体内合，但一般动物对其的需求量大，单靠自身合成往往不能满足其正常的生理需求，依靠外界补充甘氨酸对于改善动物饲料营养，促进动物生长发育具有重要意义[3]。
氨基酸二肽类化合物的合成是近年来一个新的研究热点[4-6]。由于氨基酸二肽具有特殊的理化性质，使其在医药、临床、化妆品、农药、食品等方面有着非常广泛的应用。最近研究表明，肽与氨基酸的吸收，存在两种独立的转运机制，与氨基酸相比，小肽吸收具有转运快，耗能低、不易饱和等特点，因此肽营养已成为蛋白质营养研究的新热点。从动植物、微生物等中分离出的各种生物活性肽，具有抗氧化、抗生素、激素、激化以及调节道味等多种功能，可将其认为是一种新型营养性饲料添加剂。本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，制备二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸。通过对反应条件进行优化，获得了合成二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的最佳工艺。
1 实验部分
1.1 主要原料
L-蛋氨酸：分析纯，上海源聚生物科技有限公司；甘氨酸：分析纯，上海源聚生物科技有限公司；N-甲基吗啡啉：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司；4-氨基苯甲酸乙酯：分析純，国药集团化学试剂有限公司；DCC：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；四氢呋喃（THF）（AR）：湖南汇虹试剂有限公司，在氢化铝锂中加热回流12h，干燥情况下蒸馏备用；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器及测试
Aglient（安捷伦）高效液相色谱仪：色谱柱：C18 250×4.6mm 5μm；流动相：V（0.02M磷酸盐水溶液）：V（乙腈）= 85：15，柱温25℃，流速0.8 mL/min，检测波长220 nm。[7]
1.3 目标产物的合成
首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化剂作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，制备N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸.其合成路线如图1所示。
1.3.1 N-甲酰甘氨酸的合成
将4.50 g（60 mmol）甘氨酸置于250 mL圆底烧瓶中；加入126 mL甲酸，缓慢升温使之溶解；在45～50℃恒温水浴条件下，缓慢恒速滴加醋酸酐42 mL，反应2 h后水浴旋转蒸干溶剂，再加入适量冰水混合，蒸干，冷却后有白色晶状固体物质析出；最后将产物放在40℃真空干燥箱中，真空干燥。所得固体产物质量为5.48 g 。
1.3.2 L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的合成
在250 mL三口烧瓶中，加入90 mL无水甲醇；置于-5 ℃～-10 ℃环境下冷却10 min，恒滴缓慢加入二氯亚砜15 mL；搅拌30 min后，将8.94 g（60 mmol）甘氨酸加入其中；低速搅拌1 h后，缓慢升至室温，常温下搅拌24 h以上；减压旋转蒸干甲醇，得到的产物为白色的粉末状固体，放在40 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，所得固体产物质量为10.57 g 。
1.3.3 二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成
将3.09 g（30 mmol）N-甲酰甘氨酸和3.89 g（31.8 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）置于250 mL圆底烧瓶中；加入150 mL无水THF（四氢呋喃），置于-5 ℃～ -10 ℃环境中；缓慢滴加7.42 g（36 mmol）DCC（二环己基碳二亚胺）的无水四氢呋喃溶液，反应2 h。另取5.99 g（30 mmol）L-蛋氨酸甲酯盐酸盐，置于另一250 mL圆底烧瓶中；向其中加入120 mL四氢呋喃，3.60 g（35.6 mmol）N-甲基吗啡啉（NMM），搅拌1h。
将上述处理的蛋氨酸甲酯盐酸盐转移到装有N-甲酰甘氨酸的三口瓶中，混合搅拌10 min后，转移到常温下搅拌24 h；将反应液过滤，取滤液，蒸干溶剂。加乙酸乙酯300 mL，分别用1.0 mol.L-1的柠檬酸、饱和碳酸钠水溶液洗涤2次，饱和氯化钠洗涤1次，蒸干有机相；加入60 mL甲醇和1.0 mol.L-1的氢氧化钠30.0 mL；反应20分钟后，利用水浴旋转蒸发仪蒸出甲醇，用乙酸乙酯进行萃取，水层用 2.0 mol.L-1的柠檬酸调节pH=2；静置过夜，过滤，水洗至中性，40 ℃下真空干燥，得白色晶状固体物质11.27 g。
2 结果与讨论
2.1 N-甲酰甘氨酸的合成
取7.51g（0.1 mol）甘氨酸，采用乙酸酐做催化剂，在恒温水浴（45℃ ～ 50℃）条件下，反应时间均为8h。控制不同的甲酸用量，考察甲酸用量对反应收率的影响，其结果如下表所示。
由上表可知，N-甲酰甘氨酸的最佳合成条件为：温度50 ℃，甲酸用量为210 mL，乙酸酐用量为70 mL，得产物收率为79.92%，产物熔点测定值为190 ℃～195 ℃。 2.2 L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的合成
取L-蛋氨酸0.10 mol，采用氯化亚砜做催化剂，在冰盐浴（-5℃～ 10℃）条件下，与无水甲醇进行酯化反应，无水甲醇同时做反应物以及溶剂，故在保证反应完全的前提下，以节约成本为最佳选择。调节氯化亚砜的用量，考察氯化亚砜用量对反应收率的影响，其结果如下表所示。
由上表可知：L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的最佳合成条件为：温度-5?～ -10℃，甲醇用量为150 mL，氯化亚砜用量为0.1 mol（甘氨酸用量为0.1 mol），得产物收率为88.32%，产物熔点测定值为：115 ℃～ 118 ℃。
2.3 二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成
在二肽的合成阶段，N-甲酰甘氨酸在4-二甲基氨基吡啶（DMAP）催化条件下活化；L-蛋氨酸甲酯盐酸盐在N-甲基吗啡啉（NMM）催化条件下活化，然后通过DCC缩合反应制备N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸，其实验结果如下表所示：
由上表可知，合成条件：温度在-5 ℃～ -10 ℃条件下，两种原料各自活化，并在该低温条件下混合，然后常温反应；反应物的配比为：N-甲酰甘氨酸与L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1，N-甲酰甘氨酸与DMAP的摩尔比为1：1.1，L-蛋氨酸甲酯盐酸盐用量与NMM的摩尔比为1：1.2，收率80.26%。
2.4 产物的液相色谱数据
液相色譜检测结果表明：目标产物N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的含量为86.85%。
3 结论
本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，成功合成了二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸。实验结果表明：
（1）N-甲酰甘氨酸的最佳合成条件：温度50 ℃，甲酸用量为210 mL，乙酸酐用量为70 mL，收率79.92% 。
（2）L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的最佳合成条件：温度-5?～ -10℃，甲醇用量为150 mL，氯化亚砜用量为0.1 mol（甘氨酸用量为0.1 mol），收率88.32%。
（3）二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成条件：温度在-5 ℃～ -10 ℃条件下，N-甲酰甘氨酸与L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1，N-甲酰甘氨酸与DMAP的摩尔比为1：1.1，L-蛋氨酸甲酯盐酸盐用量与NMM的摩尔比为1：1.2。目标产物N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的含量为86.85%，收率80.26%。
参考文献：
[1]王文风，徐玲.绿色饲料添加剂的研究与应用[J].中国饲料添加剂，2010，14：6-9.
[2]王莹，万伶俐.绿色饲料添加剂的研究进展及其应用现状[J].现代农业科技，2009，（9）：241-244.
[3]蒋挺大，张春萍著.胶原蛋白[M].北京：化学工业出版社，2001，135-138.
[4]Armido studer.Amino acids and derivatives as stoichiometric auxiliaries in asymmetric synthesis[J]，Synthesis 1996，（7）：793-815.
[5]闫乾顺，张娟.采取二酰氯法合成三肽[J].宁夏医学院学报，2001，23：242-244.
[6]廖一静，杨康辉，王举涛，张瑞环，徐文方.N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸（fMLP）三肽的合成[J].中国药物化学杂志，2007，17：299-301.
[7]于慧娟.反相离子对液相色谱法分析天冬二肽[J].分析测试学报，2003，22：79-81.
【关键词】L-蛋氨酸；甘氨酸；二肽；N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸；DCC缩合
我国饲料市场资源严重短缺，市场上仅有的饲料供不应求，而对饲料添加剂的需求也急速扩大[1，2]。蛋氨酸是合成蛋白质的一种非常重要的必需氨基酸，它在植物性蛋白中含量较少，主要存在于动物性蛋白中。蛋氨酸在体内不能直接合成或转化速度不能满足动物的正常生理需要，只能靠外源补充来满足动物对它的需要。甘氨酸作为一种非必需氨基酸，虽然能在动物体内合，但一般动物对其的需求量大，单靠自身合成往往不能满足其正常的生理需求，依靠外界补充甘氨酸对于改善动物饲料营养，促进动物生长发育具有重要意义[3]。
氨基酸二肽类化合物的合成是近年来一个新的研究热点[4-6]。由于氨基酸二肽具有特殊的理化性质，使其在医药、临床、化妆品、农药、食品等方面有着非常广泛的应用。最近研究表明，肽与氨基酸的吸收，存在两种独立的转运机制，与氨基酸相比，小肽吸收具有转运快，耗能低、不易饱和等特点，因此肽营养已成为蛋白质营养研究的新热点。从动植物、微生物等中分离出的各种生物活性肽，具有抗氧化、抗生素、激素、激化以及调节道味等多种功能，可将其认为是一种新型营养性饲料添加剂。本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，制备二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸。通过对反应条件进行优化，获得了合成二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的最佳工艺。
1 实验部分
1.1 主要原料
L-蛋氨酸：分析纯，上海源聚生物科技有限公司；甘氨酸：分析纯，上海源聚生物科技有限公司；N-甲基吗啡啉：分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司；4-氨基苯甲酸乙酯：分析純，国药集团化学试剂有限公司；DCC：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；四氢呋喃（THF）（AR）：湖南汇虹试剂有限公司，在氢化铝锂中加热回流12h，干燥情况下蒸馏备用；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器及测试
Aglient（安捷伦）高效液相色谱仪：色谱柱：C18 250×4.6mm 5μm；流动相：V（0.02M磷酸盐水溶液）：V（乙腈）= 85：15，柱温25℃，流速0.8 mL/min，检测波长220 nm。[7]
1.3 目标产物的合成
首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化剂作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，制备N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸.其合成路线如图1所示。
1.3.1 N-甲酰甘氨酸的合成
将4.50 g（60 mmol）甘氨酸置于250 mL圆底烧瓶中；加入126 mL甲酸，缓慢升温使之溶解；在45～50℃恒温水浴条件下，缓慢恒速滴加醋酸酐42 mL，反应2 h后水浴旋转蒸干溶剂，再加入适量冰水混合，蒸干，冷却后有白色晶状固体物质析出；最后将产物放在40℃真空干燥箱中，真空干燥。所得固体产物质量为5.48 g 。
1.3.2 L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的合成
在250 mL三口烧瓶中，加入90 mL无水甲醇；置于-5 ℃～-10 ℃环境下冷却10 min，恒滴缓慢加入二氯亚砜15 mL；搅拌30 min后，将8.94 g（60 mmol）甘氨酸加入其中；低速搅拌1 h后，缓慢升至室温，常温下搅拌24 h以上；减压旋转蒸干甲醇，得到的产物为白色的粉末状固体，放在40 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，所得固体产物质量为10.57 g 。
1.3.3 二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成
将3.09 g（30 mmol）N-甲酰甘氨酸和3.89 g（31.8 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）置于250 mL圆底烧瓶中；加入150 mL无水THF（四氢呋喃），置于-5 ℃～ -10 ℃环境中；缓慢滴加7.42 g（36 mmol）DCC（二环己基碳二亚胺）的无水四氢呋喃溶液，反应2 h。另取5.99 g（30 mmol）L-蛋氨酸甲酯盐酸盐，置于另一250 mL圆底烧瓶中；向其中加入120 mL四氢呋喃，3.60 g（35.6 mmol）N-甲基吗啡啉（NMM），搅拌1h。
将上述处理的蛋氨酸甲酯盐酸盐转移到装有N-甲酰甘氨酸的三口瓶中，混合搅拌10 min后，转移到常温下搅拌24 h；将反应液过滤，取滤液，蒸干溶剂。加乙酸乙酯300 mL，分别用1.0 mol.L-1的柠檬酸、饱和碳酸钠水溶液洗涤2次，饱和氯化钠洗涤1次，蒸干有机相；加入60 mL甲醇和1.0 mol.L-1的氢氧化钠30.0 mL；反应20分钟后，利用水浴旋转蒸发仪蒸出甲醇，用乙酸乙酯进行萃取，水层用 2.0 mol.L-1的柠檬酸调节pH=2；静置过夜，过滤，水洗至中性，40 ℃下真空干燥，得白色晶状固体物质11.27 g。
2 结果与讨论
2.1 N-甲酰甘氨酸的合成
取7.51g（0.1 mol）甘氨酸，采用乙酸酐做催化剂，在恒温水浴（45℃ ～ 50℃）条件下，反应时间均为8h。控制不同的甲酸用量，考察甲酸用量对反应收率的影响，其结果如下表所示。
由上表可知，N-甲酰甘氨酸的最佳合成条件为：温度50 ℃，甲酸用量为210 mL，乙酸酐用量为70 mL，得产物收率为79.92%，产物熔点测定值为190 ℃～195 ℃。 2.2 L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的合成
取L-蛋氨酸0.10 mol，采用氯化亚砜做催化剂，在冰盐浴（-5℃～ 10℃）条件下，与无水甲醇进行酯化反应，无水甲醇同时做反应物以及溶剂，故在保证反应完全的前提下，以节约成本为最佳选择。调节氯化亚砜的用量，考察氯化亚砜用量对反应收率的影响，其结果如下表所示。
由上表可知：L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的最佳合成条件为：温度-5?～ -10℃，甲醇用量为150 mL，氯化亚砜用量为0.1 mol（甘氨酸用量为0.1 mol），得产物收率为88.32%，产物熔点测定值为：115 ℃～ 118 ℃。
2.3 二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成
在二肽的合成阶段，N-甲酰甘氨酸在4-二甲基氨基吡啶（DMAP）催化条件下活化；L-蛋氨酸甲酯盐酸盐在N-甲基吗啡啉（NMM）催化条件下活化，然后通过DCC缩合反应制备N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸，其实验结果如下表所示：
由上表可知，合成条件：温度在-5 ℃～ -10 ℃条件下，两种原料各自活化，并在该低温条件下混合，然后常温反应；反应物的配比为：N-甲酰甘氨酸与L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1，N-甲酰甘氨酸与DMAP的摩尔比为1：1.1，L-蛋氨酸甲酯盐酸盐用量与NMM的摩尔比为1：1.2，收率80.26%。
2.4 产物的液相色谱数据
液相色譜检测结果表明：目标产物N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的含量为86.85%。
3 结论
本文首先采用甲酸和乙酸酐的混合物对甘氨酸甲酰化，制备N-甲酰甘氨酸；然后将L-蛋氨酸和甲醇在氯化亚砜催化作用下制备L-蛋氨酸甲酯盐酸盐；最后分别采用DMAP和NMM为催化剂，四氢呋喃作溶剂，DCC为缩合剂，成功合成了二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸。实验结果表明：
（1）N-甲酰甘氨酸的最佳合成条件：温度50 ℃，甲酸用量为210 mL，乙酸酐用量为70 mL，收率79.92% 。
（2）L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的最佳合成条件：温度-5?～ -10℃，甲醇用量为150 mL，氯化亚砜用量为0.1 mol（甘氨酸用量为0.1 mol），收率88.32%。
（3）二肽N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的合成条件：温度在-5 ℃～ -10 ℃条件下，N-甲酰甘氨酸与L-蛋氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：1，N-甲酰甘氨酸与DMAP的摩尔比为1：1.1，L-蛋氨酸甲酯盐酸盐用量与NMM的摩尔比为1：1.2。目标产物N-甲酰甘氨酰-L-蛋氨酸的含量为86.85%，收率80.26%。
参考文献：
[1]王文风，徐玲.绿色饲料添加剂的研究与应用[J].中国饲料添加剂，2010，14：6-9.
[2]王莹，万伶俐.绿色饲料添加剂的研究进展及其应用现状[J].现代农业科技，2009，（9）：241-244.
[3]蒋挺大，张春萍著.胶原蛋白[M].北京：化学工业出版社，2001，135-138.
[4]Armido studer.Amino acids and derivatives as stoichiometric auxiliaries in asymmetric synthesis[J]，Synthesis 1996，（7）：793-815.
[5]闫乾顺，张娟.采取二酰氯法合成三肽[J].宁夏医学院学报，2001，23：242-244.
[6]廖一静，杨康辉，王举涛，张瑞环，徐文方.N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸（fMLP）三肽的合成[J].中国药物化学杂志，2007，17：299-301.
[7]于慧娟.反相离子对液相色谱法分析天冬二肽[J].分析测试学报，2003，22：79-81.