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摘 要：水稻种子DNA的提取质量直接影响水稻种子真实性检验的效果。选取市面上常见的8种植物基因组DNA提取试剂盒（K1～K8）进行水稻种子DNA提取效果比较研究，结果表明，试剂盒K2提取得到的水稻种子DNA在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测中，条带最明亮、整齐且无拖尾，质量最高，试剂盒K8、K3的提取质量次之;试剂盒K1、K6提取的水稻种子DNA纯度最佳，试剂盒K2、K3、K5、K7、K8的提取产物纯度次之。因此，试剂盒K2的提取效果最好，K8、K3次之，8种试剂盒均适用于基于SSR片段分析的水稻品种真实性检测。
关键词：水稻;DNA提取试剂盒;品种真实性
文章编号：1005-2690（2021）18-0005-02 中国图书分类号：S511 文献标志码：B
种子真实性检测是加强知识产权保护、促进种业健康发展的保障[1]。目前，我国水稻、玉米等大宗农作物已普遍开展种子真实性检测，无论是目前主流第二代分子标记即SSR（简单重复序列）的检测方法，还是新一代SNP分子标记的检测方法，都需要高质量的基因组DNA作为基础。因此，确保植物DNA提取的质量是种子真实性检测能否保质保量完成的关键因素。
在种子真实性检测中，选取的材料大多为水稻新鲜叶片、幼苗或水稻幼嫩茎 [2-7]。但将水稻的种子播种，发苗之后再进行核酸抽提耗时太久，如能直接用水稻种子抽提核酸，将大大提升试验效率，但是在水稻的各部位组织中，种子稻米的成分最为复杂，含更多的淀粉等物质，所以提取水稻种子基因组DNA 难度更大。通过比较不同DNA试剂盒水稻种子DNA的提取效果，旨在为今后种子真实性检测提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 试验材料
以10个杂交水稻品种的干种子为试验材料，材料均来自于2020年广东省种子监督抽查的备份样品。试验样品编号如下，A：深优9516，B：野香优莉丝，C：恒丰优778，D：荃优丝苗，E：创优华占，F：隆优3206，G：广8优金占，H：软华优6100，I：广8优金占，J：恒丰优387。
1.2 单粒种子DNA提取
取 1 粒水稻干种子，用MP FastPrep-24组织匀浆器磨成粉末，再用8种DNA提取试剂盒（见表1）分别提取上述10个水稻品种的DNA，按照每种试剂盒中的使用说明来进行提取，共获得80个水稻基因组DNA。
1.3 DNA产物质量测定
1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
用超纯水将80个DNA模板稀释到50 ng/μL，吸取5 μL DNA 与1 μL 上样缓冲液混匀， 0.8%的琼脂糖凝胶，85 V电压，电泳20 min，用Proteinsimple AlphaImager HP凝胶成像系统上观察和拍照。
1.3.2 DNA 质量浓度和纯度的测定
用Thermo Scientific NanoDrop One超微量分光光度计检测80个DNA 模板的质量浓度和纯度。其中A260/A280的大小代表DNA 纯度;DNA 模板在260 nm 的吸光度代表DNA 质量浓度，A260=1代表DNA 质量浓度为50 ng/μL[8]。
1.4 水稻SSR的PCR扩增与毛细管电泳检测
引物来自于2014 年原农业部水稻品种鉴定标准《水稻品种鉴定技术规程：SSR 标记法NY/T 1433—2014》。选用5 對引物进行PCR 扩增，见表2。
20 μL 反应体系：10×buffer 2μL，dNTP0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10 μmol/L的正向荧光引物1 μL，1 μL 10 μmol/L的反向普通引物，50 ng/μL 的模板DNA1 μL，加无菌水补齐至20 μL。
扩增条件：预变性94 ℃ 4 min;变性94 ℃ 45 s，退火50～67 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，30 个循环;72 ℃延伸8 min。
上机准备：PCR 结束以后，取一块96 孔板加入70%乙醇至总体积为50 μL，震荡充分混匀。3 700 r/min，4 ℃离心30 min。静置15 min 后加入内标LIZ500 和HiDi，振荡充分混匀，离心10 s。放入PCR 仪，95 ℃ 条件下4 min 变性。放到Thermo Scientific ABI 3500中进行毛细管电泳。
2 结果与分析
2.1 DNA 提取物琼脂糖凝胶电泳检测结果
由图1可见，试剂盒K2呈现出整齐清晰的条带，无拖尾现象;试剂盒K3和K8条带亮度较弱，也无拖尾现象;试剂盒K7条带明亮，但拖尾现象严重;试剂盒K1、K4、K5、K6条带亮度很弱，有明显拖尾现象。
2.2 DNA提取物浓度和纯度检验结果
由表3可知，8种试剂盒提取方法的DNA质量浓度中，试剂盒K7的浓度为25.4～266.3 ng/μL，浓度最高;试剂盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA质量浓度在18.4～137.4 ng/μL，浓度适中;试剂盒K4、K6的DNA质量浓度低于20 ng/μL，浓度较低。
8种试剂盒提取方法的A260/A280比值情况如下：纯DNA 的A260/A280 约为1.8，>1.8 表明有RNA污染，<1.8 表明有蛋白质污染[9-10]。试剂盒K2、K3、K8的A260/A280为1.74～2.06，纯度最高;试剂盒K1、K5、K6、K7的A260/A280在1.42～2.29，纯度次之;试剂盒K4的A260/A280为1.04～1.74，纯度最低。 2.3 毛细管电泳结果
在ABI3700 基因分析仪器上利用荧光标记的PCR 产物进行毛细管电泳，8个样品在5个位点上扩增片段带型清晰，8个试剂盒的表现一致。
3 讨论
试剂盒K2、K3、K8提取质量和产量都比较高。采用试剂盒K2、K3、K8提取得到的DNA纯度较高，DNA 带清晰; PCR扩增结果较好，每个引物均可扩增出清晰的波峰，但操作比较烦琐，耗时耗力，提取10个基因组DNA需2.5 h，所用试剂对人体有毒。与试剂盒K2、K3、K8相比，试剂盒K6步骤简单，用时少，扩增效果也较好，但DNA 纯度较低，也用到了一些对人体有害的试剂，安全性不高。试剂盒K1、K4、K5、K7步骤较复杂，提取得到的DNA纯度较低;试剂盒K7的DNA质量浓度太高，需要稀释才能使用;试剂盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA质量浓度适中;试剂盒K4、K6的DNA质量浓度低于20 ng/μL，浓度较低。
在进行SSR-PCR 反应中，模板DNA 如果含有多糖、酚类、蛋白质等杂质[10]， 会影响DNA 聚合酶活性，干扰引物与模板的结合。试剂盒K2提取的数量多，PCR 结果稳定，重复性也好， 在进行水稻干种子DNA 抽提时，试剂盒K2是实验室提取水稻基因组DNA 的一种好方法。
通过对8种DNA提取试剂盒提取10个水稻品种的DNA进行DNA提取试剂盒筛选，结果表明，试验筛选出最优DNA提取试剂盒具有稳定、高效和可重复性的特点，可应用于水稻真实性检测工作。
参考文献：
[ 1 ] OECD.Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice（Oryza sativa）：key food and feed nutrients and antinutrients[R].Paris：OECD，2004.
[ 2 ] 李炫丽，王世才，许双全.水稻单粒种子DNA提取及SSR-PCR反应体系的正交设计优化[J].中国种业，2011（8）：46-49.
[ 3 ] IKEDA N，BAUTISTA N S，YAMADA T.Ultra-Simple DNA extraction method for marker-assisted selection usingmicro-
satellite markers in rice[J].Plant Molecular Biology Reporter，2001（19）：27-32.
[ 4 ] WU Gang，WU Yuhua，NIE Shujing，et al.Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J].Food Chemistry，2010（119）：417-422.
[ 5 ] 朱世楊，罗天宽，张小玲，等.8种水稻基因组DNA提取方法的比较[J].安徽农业科学，2009（5）：1929-1931.
[ 6 ] 赵红霞，谢攀，黄志坚，等.一种改良的水稻总DNA提取方法[J].湖北大学学报（自然科学版），2006（4）：389-392.
[ 7 ] COLLARD B C Y，DAS A，VIRK P S，et al.Evaluation of quick and dirty DNA extraction methods for marker-assisted selec-
tion in rice（Oryza sativa L.）[J].Plant Breeding，2007（126）：47-50.
[ 8 ] CHAPELA M J，SOTELO C G，PEREZ-MARTIN R I，et al.Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned
tuna for species identification[J].Food Control，2007（18）：1211-1215.
[ 9 ] SHARMA A D，GILL P K，SINGH P.DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants[J].Plant Mol Biol Rep，2002（20）：415.
[ 10 ] 李娟，文建成，谭学林.从水稻单粒糙米中快速制备基因组DNA的方法[J].分子植物育种，2007（5）：735-737.
关键词：水稻;DNA提取试剂盒;品种真实性
文章编号：1005-2690（2021）18-0005-02 中国图书分类号：S511 文献标志码：B
种子真实性检测是加强知识产权保护、促进种业健康发展的保障[1]。目前，我国水稻、玉米等大宗农作物已普遍开展种子真实性检测，无论是目前主流第二代分子标记即SSR（简单重复序列）的检测方法，还是新一代SNP分子标记的检测方法，都需要高质量的基因组DNA作为基础。因此，确保植物DNA提取的质量是种子真实性检测能否保质保量完成的关键因素。
在种子真实性检测中，选取的材料大多为水稻新鲜叶片、幼苗或水稻幼嫩茎 [2-7]。但将水稻的种子播种，发苗之后再进行核酸抽提耗时太久，如能直接用水稻种子抽提核酸，将大大提升试验效率，但是在水稻的各部位组织中，种子稻米的成分最为复杂，含更多的淀粉等物质，所以提取水稻种子基因组DNA 难度更大。通过比较不同DNA试剂盒水稻种子DNA的提取效果，旨在为今后种子真实性检测提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 试验材料
以10个杂交水稻品种的干种子为试验材料，材料均来自于2020年广东省种子监督抽查的备份样品。试验样品编号如下，A：深优9516，B：野香优莉丝，C：恒丰优778，D：荃优丝苗，E：创优华占，F：隆优3206，G：广8优金占，H：软华优6100，I：广8优金占，J：恒丰优387。
1.2 单粒种子DNA提取
取 1 粒水稻干种子，用MP FastPrep-24组织匀浆器磨成粉末，再用8种DNA提取试剂盒（见表1）分别提取上述10个水稻品种的DNA，按照每种试剂盒中的使用说明来进行提取，共获得80个水稻基因组DNA。
1.3 DNA产物质量测定
1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
用超纯水将80个DNA模板稀释到50 ng/μL，吸取5 μL DNA 与1 μL 上样缓冲液混匀， 0.8%的琼脂糖凝胶，85 V电压，电泳20 min，用Proteinsimple AlphaImager HP凝胶成像系统上观察和拍照。
1.3.2 DNA 质量浓度和纯度的测定
用Thermo Scientific NanoDrop One超微量分光光度计检测80个DNA 模板的质量浓度和纯度。其中A260/A280的大小代表DNA 纯度;DNA 模板在260 nm 的吸光度代表DNA 质量浓度，A260=1代表DNA 质量浓度为50 ng/μL[8]。
1.4 水稻SSR的PCR扩增与毛细管电泳检测
引物来自于2014 年原农业部水稻品种鉴定标准《水稻品种鉴定技术规程：SSR 标记法NY/T 1433—2014》。选用5 對引物进行PCR 扩增，见表2。
20 μL 反应体系：10×buffer 2μL，dNTP0.5 μL，Taq酶0.5 μL，10 μmol/L的正向荧光引物1 μL，1 μL 10 μmol/L的反向普通引物，50 ng/μL 的模板DNA1 μL，加无菌水补齐至20 μL。
扩增条件：预变性94 ℃ 4 min;变性94 ℃ 45 s，退火50～67 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，30 个循环;72 ℃延伸8 min。
上机准备：PCR 结束以后，取一块96 孔板加入70%乙醇至总体积为50 μL，震荡充分混匀。3 700 r/min，4 ℃离心30 min。静置15 min 后加入内标LIZ500 和HiDi，振荡充分混匀，离心10 s。放入PCR 仪，95 ℃ 条件下4 min 变性。放到Thermo Scientific ABI 3500中进行毛细管电泳。
2 结果与分析
2.1 DNA 提取物琼脂糖凝胶电泳检测结果
由图1可见，试剂盒K2呈现出整齐清晰的条带，无拖尾现象;试剂盒K3和K8条带亮度较弱，也无拖尾现象;试剂盒K7条带明亮，但拖尾现象严重;试剂盒K1、K4、K5、K6条带亮度很弱，有明显拖尾现象。
2.2 DNA提取物浓度和纯度检验结果
由表3可知，8种试剂盒提取方法的DNA质量浓度中，试剂盒K7的浓度为25.4～266.3 ng/μL，浓度最高;试剂盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA质量浓度在18.4～137.4 ng/μL，浓度适中;试剂盒K4、K6的DNA质量浓度低于20 ng/μL，浓度较低。
8种试剂盒提取方法的A260/A280比值情况如下：纯DNA 的A260/A280 约为1.8，>1.8 表明有RNA污染，<1.8 表明有蛋白质污染[9-10]。试剂盒K2、K3、K8的A260/A280为1.74～2.06，纯度最高;试剂盒K1、K5、K6、K7的A260/A280在1.42～2.29，纯度次之;试剂盒K4的A260/A280为1.04～1.74，纯度最低。 2.3 毛细管电泳结果
在ABI3700 基因分析仪器上利用荧光标记的PCR 产物进行毛细管电泳，8个样品在5个位点上扩增片段带型清晰，8个试剂盒的表现一致。
3 讨论
试剂盒K2、K3、K8提取质量和产量都比较高。采用试剂盒K2、K3、K8提取得到的DNA纯度较高，DNA 带清晰; PCR扩增结果较好，每个引物均可扩增出清晰的波峰，但操作比较烦琐，耗时耗力，提取10个基因组DNA需2.5 h，所用试剂对人体有毒。与试剂盒K2、K3、K8相比，试剂盒K6步骤简单，用时少，扩增效果也较好，但DNA 纯度较低，也用到了一些对人体有害的试剂，安全性不高。试剂盒K1、K4、K5、K7步骤较复杂，提取得到的DNA纯度较低;试剂盒K7的DNA质量浓度太高，需要稀释才能使用;试剂盒K1、K2、K3、K5、K8的DNA质量浓度适中;试剂盒K4、K6的DNA质量浓度低于20 ng/μL，浓度较低。
在进行SSR-PCR 反应中，模板DNA 如果含有多糖、酚类、蛋白质等杂质[10]， 会影响DNA 聚合酶活性，干扰引物与模板的结合。试剂盒K2提取的数量多，PCR 结果稳定，重复性也好， 在进行水稻干种子DNA 抽提时，试剂盒K2是实验室提取水稻基因组DNA 的一种好方法。
通过对8种DNA提取试剂盒提取10个水稻品种的DNA进行DNA提取试剂盒筛选，结果表明，试验筛选出最优DNA提取试剂盒具有稳定、高效和可重复性的特点，可应用于水稻真实性检测工作。
参考文献：
[ 1 ] OECD.Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice（Oryza sativa）：key food and feed nutrients and antinutrients[R].Paris：OECD，2004.
[ 2 ] 李炫丽，王世才，许双全.水稻单粒种子DNA提取及SSR-PCR反应体系的正交设计优化[J].中国种业，2011（8）：46-49.
[ 3 ] IKEDA N，BAUTISTA N S，YAMADA T.Ultra-Simple DNA extraction method for marker-assisted selection usingmicro-
satellite markers in rice[J].Plant Molecular Biology Reporter，2001（19）：27-32.
[ 4 ] WU Gang，WU Yuhua，NIE Shujing，et al.Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J].Food Chemistry，2010（119）：417-422.
[ 5 ] 朱世楊，罗天宽，张小玲，等.8种水稻基因组DNA提取方法的比较[J].安徽农业科学，2009（5）：1929-1931.
[ 6 ] 赵红霞，谢攀，黄志坚，等.一种改良的水稻总DNA提取方法[J].湖北大学学报（自然科学版），2006（4）：389-392.
[ 7 ] COLLARD B C Y，DAS A，VIRK P S，et al.Evaluation of quick and dirty DNA extraction methods for marker-assisted selec-
tion in rice（Oryza sativa L.）[J].Plant Breeding，2007（126）：47-50.
[ 8 ] CHAPELA M J，SOTELO C G，PEREZ-MARTIN R I，et al.Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned
tuna for species identification[J].Food Control，2007（18）：1211-1215.
[ 9 ] SHARMA A D，GILL P K，SINGH P.DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants[J].Plant Mol Biol Rep，2002（20）：415.
[ 10 ] 李娟，文建成，谭学林.从水稻单粒糙米中快速制备基因组DNA的方法[J].分子植物育种，2007（5）：735-737.