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摘要：采用菌丝拮抗试验、菌丝生长速度测定、主要农艺性状对比、分子标记等分析方法，比较黑木耳新品种南耳1号與当地主栽品种新科1号、新科5号和Au139的主要性状和遗传特性。结果表明：南耳1号与当地主栽品种的菌丝间均存在明显拮抗现象;南耳1号菌丝生长速度较慢，但产量分别比新科1号、新科5号和Au139高12.7%、13.3%和19.6%;南耳1号鲜耳及干耳的背面颜色分别为红褐色和青褐色，明显区别于3个当地主栽品种（黑褐色和灰黑色）;南耳1号与新科1号、新科5号和Au139的遗传相似系数分别为0.303、0.409和0.197。
关键词：黑木耳;拮抗;农艺性状;分子标记
中图分类号：S 646文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）12-1264-06
黑木耳Auricularia auricula–judae又称黑耳子、云耳、光木耳、细木耳[1]，隶属木耳目Auriculariales木耳科Auricu1ariaceae木耳属Auricularia，是一种味道鲜美的胶质真菌，有“菌中瑰宝”、“素中之王”等美誉，在国际上称其为“中餐中的黑色瑰宝”[2-3]，具有降血脂[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、抗氧化和延缓衰老[8]等多种功效。黑木耳已成为我国第二大食用菌栽培品种。据统计，2016年全国黑木耳鲜耳产量679.54万t，占全年全国食用菌总产量的18.9%。黑木耳主产地在我国东北地区，随着“北耳南扩”产业的发展，浙江、福建等南方地区袋栽黑木耳“全日光间歇喷雾栽培模式”得到了快速发展，形成了一定的产业基础[9]。南方市场上黑木耳菌株很多都是由东北引进，如雪梅黑碗、雪梅1号、吉黑3号、黑威单片、黑威15和丰收2号等[10-11]，但由于南北气候差异大，并不一定都能很好地适应南方栽培环境条件，具体表现在产量降低、抗性变差、易发生“流耳”现象。因此，选育适合南方栽培的黑木耳菌株，直接关系到南方黑木耳产业的快速、健康、持续发展。南耳1号是在福建省南平市野外采集、分离、驯化、筛选出的优良黑木耳菌株，是经福建省农作物品种审定委员会认定的新品种（闽认菌2013004）。由于生产上黑木耳栽培菌株来源广泛、数量众多，加上各地相互引种频繁，容易出现“同种异名”或“同名异种”的现象。因此，简便、快速、稳定、准确地鉴别菌株，已成为科研工作者的一项重要研究内容。本研究在前期研究的基础上[12]，采用菌丝拮抗试验、菌丝生长速度测定、主要农艺性状对比、分子标记等分析方法，研究南耳1号的主要性状和遗传特性，为黑木耳种质资源评价分析提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试菌株
南耳1号由南平市农业科学研究所选育。新科1号、新科5号和Au139为当地主栽品种，来源于福建省三明市真菌研究所。
1.2试剂与仪器
1.2.1培养基与试剂试管斜面PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g、水1 000 mL，自然pH值;PDA液体培养基：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，自然pH值;栽培料培养基：杂木屑78.5%、麸皮12%、棉籽壳8%、轻质碳酸钙1%、石灰0.5%，含水量52%，自然pH值。RAPD、ISSR和SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.2仪器冷冻离心机（Sigma 3K30）、PCR扩增仪（Eppendorf AG22331 Hamburg）、凝胶成像系统（TANON2008）、掌型离心机（江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx100手掌型离心机）、灭菌锅（上海三申YX600W）、超净工作台（苏州净化设备有限公司SWCJ1FB型）。
1.3拮抗试验
取连续活化转接2次的菌株，接种到直径9 cm、含PDA培养基的培养皿上，每个培养皿接2个菌株，相距约2 cm，两两一组，共6组，每组3个重复。置于25℃下培养，观察记录培养皿内2个株菌丝间是否产生拮抗现象。
1.4菌丝生长速度测定
采用规格17.5 cm×40.0 cm×0.005 cm的聚乙烯塑料袋，装料高度约15 cm，料面平整（未打孔），上下松紧一致，塞上棉花塞，及时高压灭菌（0.14 MPa）2.5 h后，冷却备用。在接种箱内，采用“两点”接种法接种，每支试管母种接两袋，每个菌株接10袋，放置于25℃培养室发菌。当菌丝吃料2～3 cm时，用记号笔沿菌丝端统一画一条初始线。然后20 d划一次线，40 d划一次线，60 d再划一次线，每个菌株5个重复。量取相邻两条线的距离，计算每隔20 d菌丝生长速度。
1.5DNA提取
采用CTAB （十六烷基三乙基溴化铵）沉淀法提取DNA[13]。
1.6RAPD、ISSR和SRAP扩增及扩增产物检测
1.6.1RAPD扩增扩增体系：1 μL模板（含30 ng DNA），2.5 μL10×buffer缓冲液（含Mg2+），2.5 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），1 μL Primer（10 μmol·L-1），0.25 μL TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1），最后用ddH2O将总体积补至25 μL。扩增程序：94℃预变性7 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min， 35个循环;最后72℃延伸10 min。
1.6.2ISSR扩增体系：参照RAPD 扩增体系。扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性1 min、48℃退火1 min、72℃延伸1 min， 35个循环，最后72℃延伸10 min。
1.6.3SRAP扩增体系：参照RAPD 扩增体系，其中引物为1 μL Primer me（10 μmol·L-1）和1 μL Primer em（10 μmol·L-1）。扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min， 5个循环;94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min， 35个循环;最后72℃延伸10 min。 1.6.4扩增产物检测取6 μL PCR扩增产物，加上1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀。混合液在1.0%琼脂糖凝胶（含GoldviewTMDNA染料）上进行电泳，160 V电压电泳55 min后于紫外凝胶成像系统上观察、拍照。
1.7供试菌株出耳
栽培试验点设在南平市农业科学研究所南山路口食用菌试验基地。2016年8月开始制袋，其菌袋规格为15 cm×55 cm×0.004 5 cm聚乙烯塑料袋，每袋湿料重1.4 kg，装料长度约40 cm。采用常压灭菌，冷却后在接种箱内接种，每个菌株接300袋、3次重复，共接3 600袋。接种后立即套袋，套袋规格为17 cm×55 cm×0.001 cm聚乙烯塑料袋，“井”字形摆放，勿压住接种口，每层3袋，摆5层，培菌温度控制在24～26℃。菌丝满袋后5 d，脱去套袋，选用黑木耳专用刺孔机刺孔，孔形为三角形，其孔宽（三角形底边）约8 mm，孔深（三角形高）约10 mm，每袋孔数约180个。刺孔后，“井”字形堆放，每层2袋，层高不超过8层。刺孔后養菌恢复5～7 d后下地排场。出菇管理按黑木耳“干干湿湿”交替管理的常规方法进行[14]。
1.7.1主要农艺性状测定观察记录出耳时鲜耳背面与腹面的颜色、绒毛、皱褶，以及晒干后耳片背面与腹面的颜色。然后以第1潮采收的干耳为对象，称取各个菌株干耳15 g，放入水中常温浸泡8 h，取出后沥干称重，计算其泡发率（泡发率用1∶x表示，x=泡发后重量/干耳重）;并随机抽取各个菌株12朵，测定耳片中心厚度[15]。
1.7.2产量测定测定记录各个菌株每潮次的干耳重量。
1.8统计分析
利用DPS6.5软件的多重比较LSD法分析菌丝生长速度和干耳产量的数据。利用NTSYSpc 2.1软件，采用Jaccard聚类平均法（UPGMA）对3种分子标记综合进行聚类分析，构建各菌株的遗传聚类分析图谱和遗传相似系数表。
2结果与分析
2.1拮抗试验
接种6 d后，不同菌株的菌丝开始接触，15 d后观察拮抗情况。从表1可以看出，南耳1号与其他菌株间都产生了明显的拮抗线（拮抗反应强），其拮抗类型为隔离型，菌丝交接处后期可见黄色分泌物，说明体细胞不亲和，亲缘关系较远;新科1号与新科5号两个菌株间未出现拮抗线（无拮抗反应），表明两者间亲缘关系较近。
2.2菌丝生长速度测定
从表2中可以看出，4个供试菌株菌丝萌发快，菌丝都表现洁白、粗壮、浓密。在菌丝培养的前两个时段（1～40 d）4个菌株中除新科1号外的菌株菌丝生长速度有缓慢增加的趋势，菌株间无显著性差异;在菌丝培养的第三个时段（41～60 d）4个菌株中除Au139外的菌株菌丝生长速度开始下降，其中南耳1号下降速度最快。从菌丝的这三个时段（1～60 d）的平均生长速度来看，南耳1号菌丝生长速度较慢，为0.176 cm·d-1，与其他3个菌株有显著性差异;新科5号、Au139和新科1号菌丝生长速度较快，分别为0.191、0.186、0.186 cm·d-1，这3个菌株间的生长速度没有显著性差异。
2.3主要农艺性状比较
4个供试菌株的产量及主要农艺性状见表3，从表中可看出，南耳1号产量最高，平均单袋干耳产量108.5 g，与其他3个菌株存在显著性差异，比新科1号增产12.7%、比新科5号增产13.3%、比Au139增产19.6%。从子实体的主要农艺性状来看，南耳1号鲜耳耳片较薄、泡发率较高、鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色，与其他3个菌株有明显区别;新科1号和新科5号的耳片形态特征一致，其鲜耳耳片厚度中等，鲜耳背面黑褐色、短绒毛、皱褶深，干耳背面颜色灰黑色;Au139鲜耳耳片较厚，鲜耳颜色比新科1号和新科5号略黑。
2.43种分子标记综合分析
经引物筛选，得到扩增条带清晰，稳定性、重复性和多态性较好的3种分子标记引物，其中RAPD引物有5条，即S33、S42、S118、S361和S1006;ISSR引物有6条，即ISSR1、ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR5和ISSR8;SRAP有4对引物，即me5em10、me6em6、me1em10和me4em9。引物序列见表4。
利用筛选出的5条RAPD、6条ISSR和4对SRAP多态性引物对供试菌株扩增，分别得到26、23、17条多态性条带，其中多态性比例分别为90.5%、82.1%和86.7%。综合RAPD、ISSR和SRAP图谱获得的多态性条带，构建遗传聚类分析图谱（图2）和遗传相似系数表（表5），结果显示，南耳1号与新科1号、新科5号和Au139的遗传差异较大，其遗传相似系数分别为0.303、0.409和0.197。新科1号和新科5号亲缘关系较近，遗传相似系数为0.894。
3讨论与结论
优良菌株是食用菌生产快速、稳定发展的重要前提。随着国家对食用菌新品种重视程度的不断提高，借助传统的选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等方法[16]，加上20世纪80年代开始兴起的基因工程育种，食用菌新菌株不断被选育出来。食用菌菌株间的差异可体现在菌丝的体细胞不亲和性、子实体的形态学特征及DNA的序列分析等[17-19]。体细胞不亲和性的直观反映是拮抗试验，这是传统鉴定食用菌菌株间遗传差异的方法，可从拮抗反应类型、拮抗反应程度、菌丝间交接处色素3个方面区分[20]。王玉玲对4个香菇菌株和2个金针菇菌株之间的拮抗反应进行试验后认为，亲缘关系较近的菌株，其拮抗较弱或无拮抗现象，而亲缘关系较远的菌株则有明显拮抗现象[21]。本研究中南耳1号与其他3个对照菌株间都有明显拮抗现象，说明它与这3个菌株亲缘关系较远;新科1号和新科5号菌丝间没有产生拮抗线，说明这2个菌株间亲缘关系较近。 黑木耳的子实体形态学特征，包括子实体朵形（簇生型或菊花型）、耳片背面及腹面的颜色、耳片的厚度、耳片背面的皱褶程度、耳片大小、泡发率等。本研究中南耳1号鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色，与其他3个菌株有明显的区别。在实践上，子实体形态特征很容易受环境因素、栽培条件和观察者的辨别经验等因素影响，具有一定的局限性。
分子标记技术是从DNA序列水平上反映其遗传关系，与形态学和生理生化指标相比更客观、更准确，在黑木耳种质资源研究上有着广泛的应用前景。张介驰利用筛选的10个RAPD引物对8个黑木耳生产菌株进行鉴别分类，相似系数在0.70时，将其分为3个组群，其中一个组群的2个菌株的遗传相似系数为0.97，说明其亲缘关系较近[22];利用筛选的10个ISSR引物对东北地区27个黑木耳生产菌株进行鉴别分类，相似系数在0.75时，将其分为3个组群，其中一个组群的9个菌株的遗传相似系数高于0.97，可确认这些菌株间的亲缘关系较近或者是同一菌株[23]。本研究中从RAPD、ISSR和SRAP等3种分子标记中共选出66条多态性较明显的条带进行综合聚类分析，4个供试菌株的遗传相似系数在0.197～0.894，表明這些菌株间的遗传差异较大，其中新科1号和新科5号遗传相似系数为0.894，遗传差异小，跟拮抗试验中这2个菌株的亲缘关系较近的结果相吻合。
参考文献：
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[23]张介驰，马庆芳， 张丕奇， 等. 用ISSR分子标记鉴别东北地区黑木耳生产菌株的研究[J].菌物学报，2007，26（4）：534-538.
（责任编辑：杨小萍）
关键词：黑木耳;拮抗;农艺性状;分子标记
中图分类号：S 646文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）12-1264-06
黑木耳Auricularia auricula–judae又称黑耳子、云耳、光木耳、细木耳[1]，隶属木耳目Auriculariales木耳科Auricu1ariaceae木耳属Auricularia，是一种味道鲜美的胶质真菌，有“菌中瑰宝”、“素中之王”等美誉，在国际上称其为“中餐中的黑色瑰宝”[2-3]，具有降血脂[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、抗氧化和延缓衰老[8]等多种功效。黑木耳已成为我国第二大食用菌栽培品种。据统计，2016年全国黑木耳鲜耳产量679.54万t，占全年全国食用菌总产量的18.9%。黑木耳主产地在我国东北地区，随着“北耳南扩”产业的发展，浙江、福建等南方地区袋栽黑木耳“全日光间歇喷雾栽培模式”得到了快速发展，形成了一定的产业基础[9]。南方市场上黑木耳菌株很多都是由东北引进，如雪梅黑碗、雪梅1号、吉黑3号、黑威单片、黑威15和丰收2号等[10-11]，但由于南北气候差异大，并不一定都能很好地适应南方栽培环境条件，具体表现在产量降低、抗性变差、易发生“流耳”现象。因此，选育适合南方栽培的黑木耳菌株，直接关系到南方黑木耳产业的快速、健康、持续发展。南耳1号是在福建省南平市野外采集、分离、驯化、筛选出的优良黑木耳菌株，是经福建省农作物品种审定委员会认定的新品种（闽认菌2013004）。由于生产上黑木耳栽培菌株来源广泛、数量众多，加上各地相互引种频繁，容易出现“同种异名”或“同名异种”的现象。因此，简便、快速、稳定、准确地鉴别菌株，已成为科研工作者的一项重要研究内容。本研究在前期研究的基础上[12]，采用菌丝拮抗试验、菌丝生长速度测定、主要农艺性状对比、分子标记等分析方法，研究南耳1号的主要性状和遗传特性，为黑木耳种质资源评价分析提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试菌株
南耳1号由南平市农业科学研究所选育。新科1号、新科5号和Au139为当地主栽品种，来源于福建省三明市真菌研究所。
1.2试剂与仪器
1.2.1培养基与试剂试管斜面PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g、水1 000 mL，自然pH值;PDA液体培养基：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，自然pH值;栽培料培养基：杂木屑78.5%、麸皮12%、棉籽壳8%、轻质碳酸钙1%、石灰0.5%，含水量52%，自然pH值。RAPD、ISSR和SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.2仪器冷冻离心机（Sigma 3K30）、PCR扩增仪（Eppendorf AG22331 Hamburg）、凝胶成像系统（TANON2008）、掌型离心机（江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx100手掌型离心机）、灭菌锅（上海三申YX600W）、超净工作台（苏州净化设备有限公司SWCJ1FB型）。
1.3拮抗试验
取连续活化转接2次的菌株，接种到直径9 cm、含PDA培养基的培养皿上，每个培养皿接2个菌株，相距约2 cm，两两一组，共6组，每组3个重复。置于25℃下培养，观察记录培养皿内2个株菌丝间是否产生拮抗现象。
1.4菌丝生长速度测定
采用规格17.5 cm×40.0 cm×0.005 cm的聚乙烯塑料袋，装料高度约15 cm，料面平整（未打孔），上下松紧一致，塞上棉花塞，及时高压灭菌（0.14 MPa）2.5 h后，冷却备用。在接种箱内，采用“两点”接种法接种，每支试管母种接两袋，每个菌株接10袋，放置于25℃培养室发菌。当菌丝吃料2～3 cm时，用记号笔沿菌丝端统一画一条初始线。然后20 d划一次线，40 d划一次线，60 d再划一次线，每个菌株5个重复。量取相邻两条线的距离，计算每隔20 d菌丝生长速度。
1.5DNA提取
采用CTAB （十六烷基三乙基溴化铵）沉淀法提取DNA[13]。
1.6RAPD、ISSR和SRAP扩增及扩增产物检测
1.6.1RAPD扩增扩增体系：1 μL模板（含30 ng DNA），2.5 μL10×buffer缓冲液（含Mg2+），2.5 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），1 μL Primer（10 μmol·L-1），0.25 μL TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1），最后用ddH2O将总体积补至25 μL。扩增程序：94℃预变性7 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min， 35个循环;最后72℃延伸10 min。
1.6.2ISSR扩增体系：参照RAPD 扩增体系。扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性1 min、48℃退火1 min、72℃延伸1 min， 35个循环，最后72℃延伸10 min。
1.6.3SRAP扩增体系：参照RAPD 扩增体系，其中引物为1 μL Primer me（10 μmol·L-1）和1 μL Primer em（10 μmol·L-1）。扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min， 5个循环;94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min， 35个循环;最后72℃延伸10 min。 1.6.4扩增产物检测取6 μL PCR扩增产物，加上1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀。混合液在1.0%琼脂糖凝胶（含GoldviewTMDNA染料）上进行电泳，160 V电压电泳55 min后于紫外凝胶成像系统上观察、拍照。
1.7供试菌株出耳
栽培试验点设在南平市农业科学研究所南山路口食用菌试验基地。2016年8月开始制袋，其菌袋规格为15 cm×55 cm×0.004 5 cm聚乙烯塑料袋，每袋湿料重1.4 kg，装料长度约40 cm。采用常压灭菌，冷却后在接种箱内接种，每个菌株接300袋、3次重复，共接3 600袋。接种后立即套袋，套袋规格为17 cm×55 cm×0.001 cm聚乙烯塑料袋，“井”字形摆放，勿压住接种口，每层3袋，摆5层，培菌温度控制在24～26℃。菌丝满袋后5 d，脱去套袋，选用黑木耳专用刺孔机刺孔，孔形为三角形，其孔宽（三角形底边）约8 mm，孔深（三角形高）约10 mm，每袋孔数约180个。刺孔后，“井”字形堆放，每层2袋，层高不超过8层。刺孔后養菌恢复5～7 d后下地排场。出菇管理按黑木耳“干干湿湿”交替管理的常规方法进行[14]。
1.7.1主要农艺性状测定观察记录出耳时鲜耳背面与腹面的颜色、绒毛、皱褶，以及晒干后耳片背面与腹面的颜色。然后以第1潮采收的干耳为对象，称取各个菌株干耳15 g，放入水中常温浸泡8 h，取出后沥干称重，计算其泡发率（泡发率用1∶x表示，x=泡发后重量/干耳重）;并随机抽取各个菌株12朵，测定耳片中心厚度[15]。
1.7.2产量测定测定记录各个菌株每潮次的干耳重量。
1.8统计分析
利用DPS6.5软件的多重比较LSD法分析菌丝生长速度和干耳产量的数据。利用NTSYSpc 2.1软件，采用Jaccard聚类平均法（UPGMA）对3种分子标记综合进行聚类分析，构建各菌株的遗传聚类分析图谱和遗传相似系数表。
2结果与分析
2.1拮抗试验
接种6 d后，不同菌株的菌丝开始接触，15 d后观察拮抗情况。从表1可以看出，南耳1号与其他菌株间都产生了明显的拮抗线（拮抗反应强），其拮抗类型为隔离型，菌丝交接处后期可见黄色分泌物，说明体细胞不亲和，亲缘关系较远;新科1号与新科5号两个菌株间未出现拮抗线（无拮抗反应），表明两者间亲缘关系较近。
2.2菌丝生长速度测定
从表2中可以看出，4个供试菌株菌丝萌发快，菌丝都表现洁白、粗壮、浓密。在菌丝培养的前两个时段（1～40 d）4个菌株中除新科1号外的菌株菌丝生长速度有缓慢增加的趋势，菌株间无显著性差异;在菌丝培养的第三个时段（41～60 d）4个菌株中除Au139外的菌株菌丝生长速度开始下降，其中南耳1号下降速度最快。从菌丝的这三个时段（1～60 d）的平均生长速度来看，南耳1号菌丝生长速度较慢，为0.176 cm·d-1，与其他3个菌株有显著性差异;新科5号、Au139和新科1号菌丝生长速度较快，分别为0.191、0.186、0.186 cm·d-1，这3个菌株间的生长速度没有显著性差异。
2.3主要农艺性状比较
4个供试菌株的产量及主要农艺性状见表3，从表中可看出，南耳1号产量最高，平均单袋干耳产量108.5 g，与其他3个菌株存在显著性差异，比新科1号增产12.7%、比新科5号增产13.3%、比Au139增产19.6%。从子实体的主要农艺性状来看，南耳1号鲜耳耳片较薄、泡发率较高、鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色，与其他3个菌株有明显区别;新科1号和新科5号的耳片形态特征一致，其鲜耳耳片厚度中等，鲜耳背面黑褐色、短绒毛、皱褶深，干耳背面颜色灰黑色;Au139鲜耳耳片较厚，鲜耳颜色比新科1号和新科5号略黑。
2.43种分子标记综合分析
经引物筛选，得到扩增条带清晰，稳定性、重复性和多态性较好的3种分子标记引物，其中RAPD引物有5条，即S33、S42、S118、S361和S1006;ISSR引物有6条，即ISSR1、ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR5和ISSR8;SRAP有4对引物，即me5em10、me6em6、me1em10和me4em9。引物序列见表4。
利用筛选出的5条RAPD、6条ISSR和4对SRAP多态性引物对供试菌株扩增，分别得到26、23、17条多态性条带，其中多态性比例分别为90.5%、82.1%和86.7%。综合RAPD、ISSR和SRAP图谱获得的多态性条带，构建遗传聚类分析图谱（图2）和遗传相似系数表（表5），结果显示，南耳1号与新科1号、新科5号和Au139的遗传差异较大，其遗传相似系数分别为0.303、0.409和0.197。新科1号和新科5号亲缘关系较近，遗传相似系数为0.894。
3讨论与结论
优良菌株是食用菌生产快速、稳定发展的重要前提。随着国家对食用菌新品种重视程度的不断提高，借助传统的选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等方法[16]，加上20世纪80年代开始兴起的基因工程育种，食用菌新菌株不断被选育出来。食用菌菌株间的差异可体现在菌丝的体细胞不亲和性、子实体的形态学特征及DNA的序列分析等[17-19]。体细胞不亲和性的直观反映是拮抗试验，这是传统鉴定食用菌菌株间遗传差异的方法，可从拮抗反应类型、拮抗反应程度、菌丝间交接处色素3个方面区分[20]。王玉玲对4个香菇菌株和2个金针菇菌株之间的拮抗反应进行试验后认为，亲缘关系较近的菌株，其拮抗较弱或无拮抗现象，而亲缘关系较远的菌株则有明显拮抗现象[21]。本研究中南耳1号与其他3个对照菌株间都有明显拮抗现象，说明它与这3个菌株亲缘关系较远;新科1号和新科5号菌丝间没有产生拮抗线，说明这2个菌株间亲缘关系较近。 黑木耳的子实体形态学特征，包括子实体朵形（簇生型或菊花型）、耳片背面及腹面的颜色、耳片的厚度、耳片背面的皱褶程度、耳片大小、泡发率等。本研究中南耳1号鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色，与其他3个菌株有明显的区别。在实践上，子实体形态特征很容易受环境因素、栽培条件和观察者的辨别经验等因素影响，具有一定的局限性。
分子标记技术是从DNA序列水平上反映其遗传关系，与形态学和生理生化指标相比更客观、更准确，在黑木耳种质资源研究上有着广泛的应用前景。张介驰利用筛选的10个RAPD引物对8个黑木耳生产菌株进行鉴别分类，相似系数在0.70时，将其分为3个组群，其中一个组群的2个菌株的遗传相似系数为0.97，说明其亲缘关系较近[22];利用筛选的10个ISSR引物对东北地区27个黑木耳生产菌株进行鉴别分类，相似系数在0.75时，将其分为3个组群，其中一个组群的9个菌株的遗传相似系数高于0.97，可确认这些菌株间的亲缘关系较近或者是同一菌株[23]。本研究中从RAPD、ISSR和SRAP等3种分子标记中共选出66条多态性较明显的条带进行综合聚类分析，4个供试菌株的遗传相似系数在0.197～0.894，表明這些菌株间的遗传差异较大，其中新科1号和新科5号遗传相似系数为0.894，遗传差异小，跟拮抗试验中这2个菌株的亲缘关系较近的结果相吻合。
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（责任编辑：杨小萍）