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摘要:采用菌丝拮抗试验、菌丝生长速度测定、主要农艺性状对比、分子标记等分析方法,比较黑木耳新品种南耳1号與当地主栽品种新科1号、新科5号和Au139的主要性状和遗传特性。结果表明:南耳1号与当地主栽品种的菌丝间均存在明显拮抗现象;南耳1号菌丝生长速度较慢,但产量分别比新科1号、新科5号和Au139高12.7%、13.3%和19.6%;南耳1号鲜耳及干耳的背面颜色分别为红褐色和青褐色,明显区别于3个当地主栽品种(黑褐色和灰黑色);南耳1号与新科1号、新科5号和Au139的遗传相似系数分别为0.303、0.409和0.197。
关键词:黑木耳;拮抗;农艺性状;分子标记
中图分类号:S 646文献标识码:A文章编号:1008-0384(2018)12-1264-06
黑木耳Auricularia auricula–judae又称黑耳子、云耳、光木耳、细木耳[1],隶属木耳目Auriculariales木耳科Auricu1ariaceae木耳属Auricularia,是一种味道鲜美的胶质真菌,有“菌中瑰宝”、“素中之王”等美誉,在国际上称其为“中餐中的黑色瑰宝”[2-3],具有降血脂[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、抗氧化和延缓衰老[8]等多种功效。黑木耳已成为我国第二大食用菌栽培品种。据统计,2016年全国黑木耳鲜耳产量679.54万t,占全年全国食用菌总产量的18.9%。黑木耳主产地在我国东北地区,随着“北耳南扩”产业的发展,浙江、福建等南方地区袋栽黑木耳“全日光间歇喷雾栽培模式”得到了快速发展,形成了一定的产业基础[9]。南方市场上黑木耳菌株很多都是由东北引进,如雪梅黑碗、雪梅1号、吉黑3号、黑威单片、黑威15和丰收2号等[10-11],但由于南北气候差异大,并不一定都能很好地适应南方栽培环境条件,具体表现在产量降低、抗性变差、易发生“流耳”现象。因此,选育适合南方栽培的黑木耳菌株,直接关系到南方黑木耳产业的快速、健康、持续发展。南耳1号是在福建省南平市野外采集、分离、驯化、筛选出的优良黑木耳菌株,是经福建省农作物品种审定委员会认定的新品种(闽认菌2013004)。由于生产上黑木耳栽培菌株来源广泛、数量众多,加上各地相互引种频繁,容易出现“同种异名”或“同名异种”的现象。因此,简便、快速、稳定、准确地鉴别菌株,已成为科研工作者的一项重要研究内容。本研究在前期研究的基础上[12],采用菌丝拮抗试验、菌丝生长速度测定、主要农艺性状对比、分子标记等分析方法,研究南耳1号的主要性状和遗传特性,为黑木耳种质资源评价分析提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试菌株
南耳1号由南平市农业科学研究所选育。新科1号、新科5号和Au139为当地主栽品种,来源于福建省三明市真菌研究所。
1.2试剂与仪器
1.2.1培养基与试剂试管斜面PDA培养基:马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g、水1 000 mL,自然pH值;PDA液体培养基:马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL,自然pH值;栽培料培养基:杂木屑78.5%、麸皮12%、棉籽壳8%、轻质碳酸钙1%、石灰0.5%,含水量52%,自然pH值。RAPD、ISSR和SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.2仪器冷冻离心机(Sigma 3K30)、PCR扩增仪(Eppendorf AG22331 Hamburg)、凝胶成像系统(TANON2008)、掌型离心机(江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx100手掌型离心机)、灭菌锅(上海三申YX600W)、超净工作台(苏州净化设备有限公司SWCJ1FB型)。
1.3拮抗试验
取连续活化转接2次的菌株,接种到直径9 cm、含PDA培养基的培养皿上,每个培养皿接2个菌株,相距约2 cm,两两一组,共6组,每组3个重复。置于25℃下培养,观察记录培养皿内2个株菌丝间是否产生拮抗现象。
1.4菌丝生长速度测定
采用规格17.5 cm×40.0 cm×0.005 cm的聚乙烯塑料袋,装料高度约15 cm,料面平整(未打孔),上下松紧一致,塞上棉花塞,及时高压灭菌(0.14 MPa)2.5 h后,冷却备用。在接种箱内,采用“两点”接种法接种,每支试管母种接两袋,每个菌株接10袋,放置于25℃培养室发菌。当菌丝吃料2~3 cm时,用记号笔沿菌丝端统一画一条初始线。然后20 d划一次线,40 d划一次线,60 d再划一次线,每个菌株5个重复。量取相邻两条线的距离,计算每隔20 d菌丝生长速度。
1.5DNA提取
采用CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)沉淀法提取DNA[13]。
1.6RAPD、ISSR和SRAP扩增及扩增产物检测
1.6.1RAPD扩增扩增体系:1 μL模板(含30 ng DNA),2.5 μL10×buffer缓冲液(含Mg2+),2.5 μL dNTP(2.5 mmol·L-1),1 μL Primer(10 μmol·L-1),0.25 μL TaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1),最后用ddH2O将总体积补至25 μL。扩增程序:94℃预变性7 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环;最后72℃延伸10 min。
1.6.2ISSR扩增体系:参照RAPD 扩增体系。扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、48℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环,最后72℃延伸10 min。
1.6.3SRAP扩增体系:参照RAPD 扩增体系,其中引物为1 μL Primer me(10 μmol·L-1)和1 μL Primer em(10 μmol·L-1)。扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min, 5个循环;94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环;最后72℃延伸10 min。 1.6.4扩增产物检测取6 μL PCR扩增产物,加上1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液,混匀。混合液在1.0%琼脂糖凝胶(含GoldviewTMDNA染料)上进行电泳,160 V电压电泳55 min后于紫外凝胶成像系统上观察、拍照。
1.7供试菌株出耳
栽培试验点设在南平市农业科学研究所南山路口食用菌试验基地。2016年8月开始制袋,其菌袋规格为15 cm×55 cm×0.004 5 cm聚乙烯塑料袋,每袋湿料重1.4 kg,装料长度约40 cm。采用常压灭菌,冷却后在接种箱内接种,每个菌株接300袋、3次重复,共接3 600袋。接种后立即套袋,套袋规格为17 cm×55 cm×0.001 cm聚乙烯塑料袋,“井”字形摆放,勿压住接种口,每层3袋,摆5层,培菌温度控制在24~26℃。菌丝满袋后5 d,脱去套袋,选用黑木耳专用刺孔机刺孔,孔形为三角形,其孔宽(三角形底边)约8 mm,孔深(三角形高)约10 mm,每袋孔数约180个。刺孔后,“井”字形堆放,每层2袋,层高不超过8层。刺孔后養菌恢复5~7 d后下地排场。出菇管理按黑木耳“干干湿湿”交替管理的常规方法进行[14]。
1.7.1主要农艺性状测定观察记录出耳时鲜耳背面与腹面的颜色、绒毛、皱褶,以及晒干后耳片背面与腹面的颜色。然后以第1潮采收的干耳为对象,称取各个菌株干耳15 g,放入水中常温浸泡8 h,取出后沥干称重,计算其泡发率(泡发率用1∶x表示,x=泡发后重量/干耳重);并随机抽取各个菌株12朵,测定耳片中心厚度[15]。
1.7.2产量测定测定记录各个菌株每潮次的干耳重量。
1.8统计分析
利用DPS6.5软件的多重比较LSD法分析菌丝生长速度和干耳产量的数据。利用NTSYSpc 2.1软件,采用Jaccard聚类平均法(UPGMA)对3种分子标记综合进行聚类分析,构建各菌株的遗传聚类分析图谱和遗传相似系数表。
2结果与分析
2.1拮抗试验
接种6 d后,不同菌株的菌丝开始接触,15 d后观察拮抗情况。从表1可以看出,南耳1号与其他菌株间都产生了明显的拮抗线(拮抗反应强),其拮抗类型为隔离型,菌丝交接处后期可见黄色分泌物,说明体细胞不亲和,亲缘关系较远;新科1号与新科5号两个菌株间未出现拮抗线(无拮抗反应),表明两者间亲缘关系较近。
2.2菌丝生长速度测定
从表2中可以看出,4个供试菌株菌丝萌发快,菌丝都表现洁白、粗壮、浓密。在菌丝培养的前两个时段(1~40 d)4个菌株中除新科1号外的菌株菌丝生长速度有缓慢增加的趋势,菌株间无显著性差异;在菌丝培养的第三个时段(41~60 d)4个菌株中除Au139外的菌株菌丝生长速度开始下降,其中南耳1号下降速度最快。从菌丝的这三个时段(1~60 d)的平均生长速度来看,南耳1号菌丝生长速度较慢,为0.176 cm·d-1,与其他3个菌株有显著性差异;新科5号、Au139和新科1号菌丝生长速度较快,分别为0.191、0.186、0.186 cm·d-1,这3个菌株间的生长速度没有显著性差异。
2.3主要农艺性状比较
4个供试菌株的产量及主要农艺性状见表3,从表中可看出,南耳1号产量最高,平均单袋干耳产量108.5 g,与其他3个菌株存在显著性差异,比新科1号增产12.7%、比新科5号增产13.3%、比Au139增产19.6%。从子实体的主要农艺性状来看,南耳1号鲜耳耳片较薄、泡发率较高、鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色,与其他3个菌株有明显区别;新科1号和新科5号的耳片形态特征一致,其鲜耳耳片厚度中等,鲜耳背面黑褐色、短绒毛、皱褶深,干耳背面颜色灰黑色;Au139鲜耳耳片较厚,鲜耳颜色比新科1号和新科5号略黑。
2.43种分子标记综合分析
经引物筛选,得到扩增条带清晰,稳定性、重复性和多态性较好的3种分子标记引物,其中RAPD引物有5条,即S33、S42、S118、S361和S1006;ISSR引物有6条,即ISSR1、ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR5和ISSR8;SRAP有4对引物,即me5em10、me6em6、me1em10和me4em9。引物序列见表4。
利用筛选出的5条RAPD、6条ISSR和4对SRAP多态性引物对供试菌株扩增,分别得到26、23、17条多态性条带,其中多态性比例分别为90.5%、82.1%和86.7%。综合RAPD、ISSR和SRAP图谱获得的多态性条带,构建遗传聚类分析图谱(图2)和遗传相似系数表(表5),结果显示,南耳1号与新科1号、新科5号和Au139的遗传差异较大,其遗传相似系数分别为0.303、0.409和0.197。新科1号和新科5号亲缘关系较近,遗传相似系数为0.894。
3讨论与结论
优良菌株是食用菌生产快速、稳定发展的重要前提。随着国家对食用菌新品种重视程度的不断提高,借助传统的选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等方法[16],加上20世纪80年代开始兴起的基因工程育种,食用菌新菌株不断被选育出来。食用菌菌株间的差异可体现在菌丝的体细胞不亲和性、子实体的形态学特征及DNA的序列分析等[17-19]。体细胞不亲和性的直观反映是拮抗试验,这是传统鉴定食用菌菌株间遗传差异的方法,可从拮抗反应类型、拮抗反应程度、菌丝间交接处色素3个方面区分[20]。王玉玲对4个香菇菌株和2个金针菇菌株之间的拮抗反应进行试验后认为,亲缘关系较近的菌株,其拮抗较弱或无拮抗现象,而亲缘关系较远的菌株则有明显拮抗现象[21]。本研究中南耳1号与其他3个对照菌株间都有明显拮抗现象,说明它与这3个菌株亲缘关系较远;新科1号和新科5号菌丝间没有产生拮抗线,说明这2个菌株间亲缘关系较近。 黑木耳的子实体形态学特征,包括子实体朵形(簇生型或菊花型)、耳片背面及腹面的颜色、耳片的厚度、耳片背面的皱褶程度、耳片大小、泡发率等。本研究中南耳1号鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色,与其他3个菌株有明显的区别。在实践上,子实体形态特征很容易受环境因素、栽培条件和观察者的辨别经验等因素影响,具有一定的局限性。
分子标记技术是从DNA序列水平上反映其遗传关系,与形态学和生理生化指标相比更客观、更准确,在黑木耳种质资源研究上有着广泛的应用前景。张介驰利用筛选的10个RAPD引物对8个黑木耳生产菌株进行鉴别分类,相似系数在0.70时,将其分为3个组群,其中一个组群的2个菌株的遗传相似系数为0.97,说明其亲缘关系较近[22];利用筛选的10个ISSR引物对东北地区27个黑木耳生产菌株进行鉴别分类,相似系数在0.75时,将其分为3个组群,其中一个组群的9个菌株的遗传相似系数高于0.97,可确认这些菌株间的亲缘关系较近或者是同一菌株[23]。本研究中从RAPD、ISSR和SRAP等3种分子标记中共选出66条多态性较明显的条带进行综合聚类分析,4个供试菌株的遗传相似系数在0.197~0.894,表明這些菌株间的遗传差异较大,其中新科1号和新科5号遗传相似系数为0.894,遗传差异小,跟拮抗试验中这2个菌株的亲缘关系较近的结果相吻合。
参考文献:
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[23]张介驰,马庆芳, 张丕奇, 等. 用ISSR分子标记鉴别东北地区黑木耳生产菌株的研究[J].菌物学报,2007,26(4):534-538.
(责任编辑:杨小萍)
关键词:黑木耳;拮抗;农艺性状;分子标记
中图分类号:S 646文献标识码:A文章编号:1008-0384(2018)12-1264-06
黑木耳Auricularia auricula–judae又称黑耳子、云耳、光木耳、细木耳[1],隶属木耳目Auriculariales木耳科Auricu1ariaceae木耳属Auricularia,是一种味道鲜美的胶质真菌,有“菌中瑰宝”、“素中之王”等美誉,在国际上称其为“中餐中的黑色瑰宝”[2-3],具有降血脂[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、抗氧化和延缓衰老[8]等多种功效。黑木耳已成为我国第二大食用菌栽培品种。据统计,2016年全国黑木耳鲜耳产量679.54万t,占全年全国食用菌总产量的18.9%。黑木耳主产地在我国东北地区,随着“北耳南扩”产业的发展,浙江、福建等南方地区袋栽黑木耳“全日光间歇喷雾栽培模式”得到了快速发展,形成了一定的产业基础[9]。南方市场上黑木耳菌株很多都是由东北引进,如雪梅黑碗、雪梅1号、吉黑3号、黑威单片、黑威15和丰收2号等[10-11],但由于南北气候差异大,并不一定都能很好地适应南方栽培环境条件,具体表现在产量降低、抗性变差、易发生“流耳”现象。因此,选育适合南方栽培的黑木耳菌株,直接关系到南方黑木耳产业的快速、健康、持续发展。南耳1号是在福建省南平市野外采集、分离、驯化、筛选出的优良黑木耳菌株,是经福建省农作物品种审定委员会认定的新品种(闽认菌2013004)。由于生产上黑木耳栽培菌株来源广泛、数量众多,加上各地相互引种频繁,容易出现“同种异名”或“同名异种”的现象。因此,简便、快速、稳定、准确地鉴别菌株,已成为科研工作者的一项重要研究内容。本研究在前期研究的基础上[12],采用菌丝拮抗试验、菌丝生长速度测定、主要农艺性状对比、分子标记等分析方法,研究南耳1号的主要性状和遗传特性,为黑木耳种质资源评价分析提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试菌株
南耳1号由南平市农业科学研究所选育。新科1号、新科5号和Au139为当地主栽品种,来源于福建省三明市真菌研究所。
1.2试剂与仪器
1.2.1培养基与试剂试管斜面PDA培养基:马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g、水1 000 mL,自然pH值;PDA液体培养基:马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL,自然pH值;栽培料培养基:杂木屑78.5%、麸皮12%、棉籽壳8%、轻质碳酸钙1%、石灰0.5%,含水量52%,自然pH值。RAPD、ISSR和SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.2仪器冷冻离心机(Sigma 3K30)、PCR扩增仪(Eppendorf AG22331 Hamburg)、凝胶成像系统(TANON2008)、掌型离心机(江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx100手掌型离心机)、灭菌锅(上海三申YX600W)、超净工作台(苏州净化设备有限公司SWCJ1FB型)。
1.3拮抗试验
取连续活化转接2次的菌株,接种到直径9 cm、含PDA培养基的培养皿上,每个培养皿接2个菌株,相距约2 cm,两两一组,共6组,每组3个重复。置于25℃下培养,观察记录培养皿内2个株菌丝间是否产生拮抗现象。
1.4菌丝生长速度测定
采用规格17.5 cm×40.0 cm×0.005 cm的聚乙烯塑料袋,装料高度约15 cm,料面平整(未打孔),上下松紧一致,塞上棉花塞,及时高压灭菌(0.14 MPa)2.5 h后,冷却备用。在接种箱内,采用“两点”接种法接种,每支试管母种接两袋,每个菌株接10袋,放置于25℃培养室发菌。当菌丝吃料2~3 cm时,用记号笔沿菌丝端统一画一条初始线。然后20 d划一次线,40 d划一次线,60 d再划一次线,每个菌株5个重复。量取相邻两条线的距离,计算每隔20 d菌丝生长速度。
1.5DNA提取
采用CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)沉淀法提取DNA[13]。
1.6RAPD、ISSR和SRAP扩增及扩增产物检测
1.6.1RAPD扩增扩增体系:1 μL模板(含30 ng DNA),2.5 μL10×buffer缓冲液(含Mg2+),2.5 μL dNTP(2.5 mmol·L-1),1 μL Primer(10 μmol·L-1),0.25 μL TaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1),最后用ddH2O将总体积补至25 μL。扩增程序:94℃预变性7 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环;最后72℃延伸10 min。
1.6.2ISSR扩增体系:参照RAPD 扩增体系。扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、48℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环,最后72℃延伸10 min。
1.6.3SRAP扩增体系:参照RAPD 扩增体系,其中引物为1 μL Primer me(10 μmol·L-1)和1 μL Primer em(10 μmol·L-1)。扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、34℃退火1 min、72℃延伸1 min, 5个循环;94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环;最后72℃延伸10 min。 1.6.4扩增产物检测取6 μL PCR扩增产物,加上1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液,混匀。混合液在1.0%琼脂糖凝胶(含GoldviewTMDNA染料)上进行电泳,160 V电压电泳55 min后于紫外凝胶成像系统上观察、拍照。
1.7供试菌株出耳
栽培试验点设在南平市农业科学研究所南山路口食用菌试验基地。2016年8月开始制袋,其菌袋规格为15 cm×55 cm×0.004 5 cm聚乙烯塑料袋,每袋湿料重1.4 kg,装料长度约40 cm。采用常压灭菌,冷却后在接种箱内接种,每个菌株接300袋、3次重复,共接3 600袋。接种后立即套袋,套袋规格为17 cm×55 cm×0.001 cm聚乙烯塑料袋,“井”字形摆放,勿压住接种口,每层3袋,摆5层,培菌温度控制在24~26℃。菌丝满袋后5 d,脱去套袋,选用黑木耳专用刺孔机刺孔,孔形为三角形,其孔宽(三角形底边)约8 mm,孔深(三角形高)约10 mm,每袋孔数约180个。刺孔后,“井”字形堆放,每层2袋,层高不超过8层。刺孔后養菌恢复5~7 d后下地排场。出菇管理按黑木耳“干干湿湿”交替管理的常规方法进行[14]。
1.7.1主要农艺性状测定观察记录出耳时鲜耳背面与腹面的颜色、绒毛、皱褶,以及晒干后耳片背面与腹面的颜色。然后以第1潮采收的干耳为对象,称取各个菌株干耳15 g,放入水中常温浸泡8 h,取出后沥干称重,计算其泡发率(泡发率用1∶x表示,x=泡发后重量/干耳重);并随机抽取各个菌株12朵,测定耳片中心厚度[15]。
1.7.2产量测定测定记录各个菌株每潮次的干耳重量。
1.8统计分析
利用DPS6.5软件的多重比较LSD法分析菌丝生长速度和干耳产量的数据。利用NTSYSpc 2.1软件,采用Jaccard聚类平均法(UPGMA)对3种分子标记综合进行聚类分析,构建各菌株的遗传聚类分析图谱和遗传相似系数表。
2结果与分析
2.1拮抗试验
接种6 d后,不同菌株的菌丝开始接触,15 d后观察拮抗情况。从表1可以看出,南耳1号与其他菌株间都产生了明显的拮抗线(拮抗反应强),其拮抗类型为隔离型,菌丝交接处后期可见黄色分泌物,说明体细胞不亲和,亲缘关系较远;新科1号与新科5号两个菌株间未出现拮抗线(无拮抗反应),表明两者间亲缘关系较近。
2.2菌丝生长速度测定
从表2中可以看出,4个供试菌株菌丝萌发快,菌丝都表现洁白、粗壮、浓密。在菌丝培养的前两个时段(1~40 d)4个菌株中除新科1号外的菌株菌丝生长速度有缓慢增加的趋势,菌株间无显著性差异;在菌丝培养的第三个时段(41~60 d)4个菌株中除Au139外的菌株菌丝生长速度开始下降,其中南耳1号下降速度最快。从菌丝的这三个时段(1~60 d)的平均生长速度来看,南耳1号菌丝生长速度较慢,为0.176 cm·d-1,与其他3个菌株有显著性差异;新科5号、Au139和新科1号菌丝生长速度较快,分别为0.191、0.186、0.186 cm·d-1,这3个菌株间的生长速度没有显著性差异。
2.3主要农艺性状比较
4个供试菌株的产量及主要农艺性状见表3,从表中可看出,南耳1号产量最高,平均单袋干耳产量108.5 g,与其他3个菌株存在显著性差异,比新科1号增产12.7%、比新科5号增产13.3%、比Au139增产19.6%。从子实体的主要农艺性状来看,南耳1号鲜耳耳片较薄、泡发率较高、鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色,与其他3个菌株有明显区别;新科1号和新科5号的耳片形态特征一致,其鲜耳耳片厚度中等,鲜耳背面黑褐色、短绒毛、皱褶深,干耳背面颜色灰黑色;Au139鲜耳耳片较厚,鲜耳颜色比新科1号和新科5号略黑。
2.43种分子标记综合分析
经引物筛选,得到扩增条带清晰,稳定性、重复性和多态性较好的3种分子标记引物,其中RAPD引物有5条,即S33、S42、S118、S361和S1006;ISSR引物有6条,即ISSR1、ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR5和ISSR8;SRAP有4对引物,即me5em10、me6em6、me1em10和me4em9。引物序列见表4。
利用筛选出的5条RAPD、6条ISSR和4对SRAP多态性引物对供试菌株扩增,分别得到26、23、17条多态性条带,其中多态性比例分别为90.5%、82.1%和86.7%。综合RAPD、ISSR和SRAP图谱获得的多态性条带,构建遗传聚类分析图谱(图2)和遗传相似系数表(表5),结果显示,南耳1号与新科1号、新科5号和Au139的遗传差异较大,其遗传相似系数分别为0.303、0.409和0.197。新科1号和新科5号亲缘关系较近,遗传相似系数为0.894。
3讨论与结论
优良菌株是食用菌生产快速、稳定发展的重要前提。随着国家对食用菌新品种重视程度的不断提高,借助传统的选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种等方法[16],加上20世纪80年代开始兴起的基因工程育种,食用菌新菌株不断被选育出来。食用菌菌株间的差异可体现在菌丝的体细胞不亲和性、子实体的形态学特征及DNA的序列分析等[17-19]。体细胞不亲和性的直观反映是拮抗试验,这是传统鉴定食用菌菌株间遗传差异的方法,可从拮抗反应类型、拮抗反应程度、菌丝间交接处色素3个方面区分[20]。王玉玲对4个香菇菌株和2个金针菇菌株之间的拮抗反应进行试验后认为,亲缘关系较近的菌株,其拮抗较弱或无拮抗现象,而亲缘关系较远的菌株则有明显拮抗现象[21]。本研究中南耳1号与其他3个对照菌株间都有明显拮抗现象,说明它与这3个菌株亲缘关系较远;新科1号和新科5号菌丝间没有产生拮抗线,说明这2个菌株间亲缘关系较近。 黑木耳的子实体形态学特征,包括子实体朵形(簇生型或菊花型)、耳片背面及腹面的颜色、耳片的厚度、耳片背面的皱褶程度、耳片大小、泡发率等。本研究中南耳1号鲜耳背面颜色红褐色、干耳背面颜色青褐色,与其他3个菌株有明显的区别。在实践上,子实体形态特征很容易受环境因素、栽培条件和观察者的辨别经验等因素影响,具有一定的局限性。
分子标记技术是从DNA序列水平上反映其遗传关系,与形态学和生理生化指标相比更客观、更准确,在黑木耳种质资源研究上有着广泛的应用前景。张介驰利用筛选的10个RAPD引物对8个黑木耳生产菌株进行鉴别分类,相似系数在0.70时,将其分为3个组群,其中一个组群的2个菌株的遗传相似系数为0.97,说明其亲缘关系较近[22];利用筛选的10个ISSR引物对东北地区27个黑木耳生产菌株进行鉴别分类,相似系数在0.75时,将其分为3个组群,其中一个组群的9个菌株的遗传相似系数高于0.97,可确认这些菌株间的亲缘关系较近或者是同一菌株[23]。本研究中从RAPD、ISSR和SRAP等3种分子标记中共选出66条多态性较明显的条带进行综合聚类分析,4个供试菌株的遗传相似系数在0.197~0.894,表明這些菌株间的遗传差异较大,其中新科1号和新科5号遗传相似系数为0.894,遗传差异小,跟拮抗试验中这2个菌株的亲缘关系较近的结果相吻合。
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(责任编辑:杨小萍)