【摘 要】
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目的优化小鼠胚胎整体原位杂交及数据分析方法. 方法小鼠胚胎用4%多聚甲醛4℃固定过夜,10mg/L蛋白酶K(PK)室温消化30min,预杂交2h后,加入探针63℃反应16～18h,用盐溶液高温洗涤
【机 构】
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军事医学科学院基础医学研究所脑保护与可塑性研究实验室,北京,100850
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划(863计划)
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目的优化小鼠胚胎整体原位杂交及数据分析方法. 方法小鼠胚胎用4%多聚甲醛4℃固定过夜,10mg/L蛋白酶K(PK)室温消化30min,预杂交2h后,加入探针63℃反应16～18h,用盐溶液高温洗涤多次,RNA酶37℃消化1h,封闭4h后加入地高辛抗体4℃过夜.抗体反应后反复洗涤并在水平摇床上振摇,NBT和BCIP显色系统避光显色.提取图像灰度值,扣除背景、对照等假阳性信号. 结果 KIAA1708探针在脑、脊髓等8个区域有杂交信号,对图像数据分析结果表明,只有1个区域的信号在95%可信限范围内,为阳性信号. 结论通过控制蛋白酶K消化时间、探针和地高辛抗体浓度,以及洗涤、显色过程,得到了低本底、着色清晰的杂交结果,结合图像的数据分析步骤,消除假阳性结果.建立了一套实用的小鼠胚胎整体原位杂交方法.
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