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摘 要：本文用MRS培养基，对产酸益生菌分离、纯化，通过溶钙圈和产气性實验，最终确定并分离出12株产酸菌。在不同条件下对菌株产酸能力进行鉴定，结果表明：多数菌在培养初期，pH值不断下降，随着时间延长，下降趋势变缓；6株菌在高温条件下产酸能力明显，1株菌在低温条件产酸能力明显。
关键词：产酸益生菌；分离；鉴定
1 前言
益生菌是一类对宿主有益的细菌的总称，能够帮助人体调整或维持微生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态。产酸益生菌很多，如醋酸杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌等。有些益生菌在特殊的环境中也能产酸，如木糖乳杆菌发酵木糖可产生L（+）-乳酸；又如变异微球菌在半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖中产酸是可变的。
尽管这类菌的作用机理有很多尚不为人们所明白，但已引起越来越多人的关注，并在生产生活得到了应用，如保健行业，食品工业（特别是发酵乳品），饲料加工业，生物化肥制造业。随着欧盟对抗生素的禁用和全球对无药物家禽产品需求的持续增加，致使家禽生产公司重新考虑使用有机酸饲料添加剂。因此，对产酸益生菌的研究开发，拥有极其广阔的前景和指导意义。笔者利用钙遇酸易发生水解的原理，初步筛选产酸菌株，进而通过设计合理的实验，以获得生长速度快、产酸量大等符合生产要求的菌株。
2 材料与方法
2.1 材料
样品1和样品2，由信阳师范学院分子生物学实验室提供。
2.2 培养基
MRS液体培养基；MRS固体培养基；产粘性培养基；葡萄糖产气培养基；抑菌实验检测培养基；V-P反应培养基；溶钙圈检测培养基。
2.3 实验仪器
电热恒温隔水式培养箱；数显恒温水浴锅；可见分光光度计；光学显微镜；pH计。
2.4 实验方法
分离纯化：将样品10倍梯度稀释，涂MRS平板，用石蜡封口，37℃厌氧培养24h，并分离纯化。将菌株用甘油管法-20℃保藏[1]。
溶钙圈实验：在溶钙圈检测培养基上，点种分离，37℃培养72h。以此初步判断菌株是否产酸。
产气性实验：将分离的菌株接种到带有倒置杜氏小管的葡萄糖产气培养基中，37℃培养24h。观察杜氏小管内是否有气泡产生，同时还可以通过观察培养液的颜色变化，确定菌株是否产酸。以此进一步判断是否产酸的标准。
粘性实验：用MRS固体培养基，其中蔗糖代替葡萄糖。接种后于37℃培养24h，用接种针挑取菌落直接观察[2]。
抑菌实验：在不加乙酸钠的MRS固体平板培养基上利用混菌法，接种新培养的指示菌（大肠杆菌和葡萄球菌）后，点种分离，37℃培养24h，观察菌株的抑菌圈。
3 结果与分析
3.1 结果与分析
从样品1和样品2中共分离的21株菌（编号为1-21，其中1-10来源于样品1，11-21来源于样品2）。在分离纯化过程中，对单菌落进行了革兰氏染色、镜检（见表2-1）。其中编号1-3、6、7、9-11、17-21的13株菌能够形成钙溶解圈（以下称“考查菌株”）。
从表2-1中可以看出，革兰氏阴性和阳性的菌株都有溶钙圈形成，在48h内都表现出来溶钙圈，且部分菌株在72h内形成明显溶钙圈。所有考查菌株都能形成抑菌圈，且都不产粘性物质。
在产气性实验中，编号1、2、6、7、9、20、21的7株菌没有产生气泡，3、10、11、17、18、19的6株菌有气泡产生，且向其培养液中加入过量NaOH，轻摇试管，静置一段时间，气泡都不消失，证明所产气体不是CO2，并观察培养液颜色发生变化，只有17号菌株，培养液颜色没有变化，无色，证明其不产酸。因此，确定编号1、2、3、6、7、9、10、11、18、19、20、21的12株菌为产酸益生菌。
3.2 菌株的生长和产酸能力鉴定
将考查菌株接种于MRS液体培养基，37℃培养24h，以MRS液体培养基为空、白对照，每4h用722分光光度计于650 nm测定菌液的OD值[3]，用酸度计测定pH值[4]。记录数据见表2-2。
通过表2-2数据，我们可以看出：①所有菌株在培养8h-12h时，OD值达到最大，编号6、7、10、11、19、20的6株菌生长迅速，1号菌株生长最慢，在12-20h时达到最大值。②pH值数据显示，除1号菌株外都能降低1-2个点；6、11、19、20、21的5菌株变化最快，4h后能降低2个点，在培养初期pH值不断下降，随着时间的延长，这种下降趋势逐渐变缓，所有菌株在20h以后趋于平缓。
3.3 温度对菌株的生长和产酸能力的影响
用MRS液体培养基，在27-28℃培养24h，以空白MRS液体培养基为对照，用722分光光度计于650nm测定菌液的OD值[5]，用酸度计测定pH值。各菌株的最终产酸量和pH的数据见表2-3。
表2-3可以看出，编号2、3、9、10、20、21的6株菌在高温条件下生长较好，低温条件下明显受到抑制。1号菌株表现出更适合低温条件生长，其菌体浓度高于高温条件下培养的，pH值显示在低温条件下酸度更大。编号6、7、11、18、19的5株菌的OD值和pH值受温度变化影响不明显。
4 结论与讨论
本文通过实验，最终获得12株产酸菌，多数菌在培养初期，pH值不断下降，随着时间延长，下降趋势变缓。按理论分析，菌产生有机酸的强度度应该与时间成正比，但实验中却发现有时成反比，这可能跟细胞自溶、仪器老旧等因素有关。实验获得了6株菌在高温条件下产酸能力强，1株菌在低温条件产酸能力强，这些优势菌株将会继续筛选，选出生长更好，产酸能力更强的菌株后，但是如何利用它们在解决人们生活中的问题，需要深入研究和探索。
参考文献
[1] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社， 1986：214-256.
[2] 李阜椂，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京：中国农业出版社，1996： 364- 428.
[3] 王蔚淼，潘玲，朱玮等. 10株乳酸菌产酸性能的研究[J].中国生态农业学报，2007，15（3）：67-72.
[4] 马春丽，张兰威.高产酸性能乳酸菌的筛选及产酸机理研究[J] .食品工业科技，2010，45（1）：64-78.
[5] 李孝辉，叶琪明，李艳丽.不同培养温度对嗜酸乳杆菌BL-A1生物学特性的影响[J]. 2008，14（20）：52-67.
关键词：产酸益生菌；分离；鉴定
1 前言
益生菌是一类对宿主有益的细菌的总称，能够帮助人体调整或维持微生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态。产酸益生菌很多，如醋酸杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌等。有些益生菌在特殊的环境中也能产酸，如木糖乳杆菌发酵木糖可产生L（+）-乳酸；又如变异微球菌在半乳糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖中产酸是可变的。
尽管这类菌的作用机理有很多尚不为人们所明白，但已引起越来越多人的关注，并在生产生活得到了应用，如保健行业，食品工业（特别是发酵乳品），饲料加工业，生物化肥制造业。随着欧盟对抗生素的禁用和全球对无药物家禽产品需求的持续增加，致使家禽生产公司重新考虑使用有机酸饲料添加剂。因此，对产酸益生菌的研究开发，拥有极其广阔的前景和指导意义。笔者利用钙遇酸易发生水解的原理，初步筛选产酸菌株，进而通过设计合理的实验，以获得生长速度快、产酸量大等符合生产要求的菌株。
2 材料与方法
2.1 材料
样品1和样品2，由信阳师范学院分子生物学实验室提供。
2.2 培养基
MRS液体培养基；MRS固体培养基；产粘性培养基；葡萄糖产气培养基；抑菌实验检测培养基；V-P反应培养基；溶钙圈检测培养基。
2.3 实验仪器
电热恒温隔水式培养箱；数显恒温水浴锅；可见分光光度计；光学显微镜；pH计。
2.4 实验方法
分离纯化：将样品10倍梯度稀释，涂MRS平板，用石蜡封口，37℃厌氧培养24h，并分离纯化。将菌株用甘油管法-20℃保藏[1]。
溶钙圈实验：在溶钙圈检测培养基上，点种分离，37℃培养72h。以此初步判断菌株是否产酸。
产气性实验：将分离的菌株接种到带有倒置杜氏小管的葡萄糖产气培养基中，37℃培养24h。观察杜氏小管内是否有气泡产生，同时还可以通过观察培养液的颜色变化，确定菌株是否产酸。以此进一步判断是否产酸的标准。
粘性实验：用MRS固体培养基，其中蔗糖代替葡萄糖。接种后于37℃培养24h，用接种针挑取菌落直接观察[2]。
抑菌实验：在不加乙酸钠的MRS固体平板培养基上利用混菌法，接种新培养的指示菌（大肠杆菌和葡萄球菌）后，点种分离，37℃培养24h，观察菌株的抑菌圈。
3 结果与分析
3.1 结果与分析
从样品1和样品2中共分离的21株菌（编号为1-21，其中1-10来源于样品1，11-21来源于样品2）。在分离纯化过程中，对单菌落进行了革兰氏染色、镜检（见表2-1）。其中编号1-3、6、7、9-11、17-21的13株菌能够形成钙溶解圈（以下称“考查菌株”）。
从表2-1中可以看出，革兰氏阴性和阳性的菌株都有溶钙圈形成，在48h内都表现出来溶钙圈，且部分菌株在72h内形成明显溶钙圈。所有考查菌株都能形成抑菌圈，且都不产粘性物质。
在产气性实验中，编号1、2、6、7、9、20、21的7株菌没有产生气泡，3、10、11、17、18、19的6株菌有气泡产生，且向其培养液中加入过量NaOH，轻摇试管，静置一段时间，气泡都不消失，证明所产气体不是CO2，并观察培养液颜色发生变化，只有17号菌株，培养液颜色没有变化，无色，证明其不产酸。因此，确定编号1、2、3、6、7、9、10、11、18、19、20、21的12株菌为产酸益生菌。
3.2 菌株的生长和产酸能力鉴定
将考查菌株接种于MRS液体培养基，37℃培养24h，以MRS液体培养基为空、白对照，每4h用722分光光度计于650 nm测定菌液的OD值[3]，用酸度计测定pH值[4]。记录数据见表2-2。
通过表2-2数据，我们可以看出：①所有菌株在培养8h-12h时，OD值达到最大，编号6、7、10、11、19、20的6株菌生长迅速，1号菌株生长最慢，在12-20h时达到最大值。②pH值数据显示，除1号菌株外都能降低1-2个点；6、11、19、20、21的5菌株变化最快，4h后能降低2个点，在培养初期pH值不断下降，随着时间的延长，这种下降趋势逐渐变缓，所有菌株在20h以后趋于平缓。
3.3 温度对菌株的生长和产酸能力的影响
用MRS液体培养基，在27-28℃培养24h，以空白MRS液体培养基为对照，用722分光光度计于650nm测定菌液的OD值[5]，用酸度计测定pH值。各菌株的最终产酸量和pH的数据见表2-3。
表2-3可以看出，编号2、3、9、10、20、21的6株菌在高温条件下生长较好，低温条件下明显受到抑制。1号菌株表现出更适合低温条件生长，其菌体浓度高于高温条件下培养的，pH值显示在低温条件下酸度更大。编号6、7、11、18、19的5株菌的OD值和pH值受温度变化影响不明显。
4 结论与讨论
本文通过实验，最终获得12株产酸菌，多数菌在培养初期，pH值不断下降，随着时间延长，下降趋势变缓。按理论分析，菌产生有机酸的强度度应该与时间成正比，但实验中却发现有时成反比，这可能跟细胞自溶、仪器老旧等因素有关。实验获得了6株菌在高温条件下产酸能力强，1株菌在低温条件产酸能力强，这些优势菌株将会继续筛选，选出生长更好，产酸能力更强的菌株后，但是如何利用它们在解决人们生活中的问题，需要深入研究和探索。
参考文献
[1] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社， 1986：214-256.
[2] 李阜椂，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京：中国农业出版社，1996： 364- 428.
[3] 王蔚淼，潘玲，朱玮等. 10株乳酸菌产酸性能的研究[J].中国生态农业学报，2007，15（3）：67-72.
[4] 马春丽，张兰威.高产酸性能乳酸菌的筛选及产酸机理研究[J] .食品工业科技，2010，45（1）：64-78.
[5] 李孝辉，叶琪明，李艳丽.不同培养温度对嗜酸乳杆菌BL-A1生物学特性的影响[J]. 2008，14（20）：52-67.