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[摘要]目的：研究病理性瘢痕组织中P27kipl和ki-67蛋白的表达情况及其相互关系，探讨他们在瘢痕形成中的作用及机制。方法：应用免疫组化SP法检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中P27kipl、ki-67蛋白的表达并进行统计学分析。结果：病理性瘢痕组织中P27kipl蛋白表达显著低于正常皮肤、成熟瘢痕（P=0.036）; ki-67蛋白在病理性瘢痕组织中的表达显著高于正常皮肤、成熟瘢痕（P＜0.000）；病理性瘢痕组织中P27kipl的表达与ki-67蛋白表达呈负相关（P＜0.000）。结论：P27kipl蛋白表达的下降及ki-67的表达升高可能与病理性瘢痕的形成有关。
[关键词]P27kipl蛋白；ki-67蛋白；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩
[中图分类号]Q813 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）10-1477-03
Expression and significance of P27kipl and ki-67 protein in pathological scar
WU Wen-yi,ZHU Shi-ze,WU Rui-lan,ZOU Cheng-hao,WANG Zhao-yang,HUANG Zhong-xin
(Departent ofPlastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou362000,Fujian,China)
Abstract:ObjectiveTo study the expression of P27kipl and ki-67 in the pathological scars and their reaction-ship and to investigate its role and its possible mechanism in the pathogenesis of abnormal scars.MethodsImmunohistochemiscal technique was performered to detect the expression and distribution of P27kipl and ki-67 protein in hypertrophic scar (42cases), keloid (18cases), normal scar (40 cases) and normal skin (50cases),statistics was used to analyze the data.ResultsThe positive rate of P27kipl and ki-67 protein expression were remarkably significant in comparison between normal scar and abnormal scar(P<0.05). In pathological scar the protein of P27kipl and ki-67 showed a strong inverse correlation (P<0.000). ConclusionLow expression of P27kipl and high expression of ki-67 may play an important role in the proliferation of fibroblasts and in the pathogenesis of pathological scar.
Key words: P27kipl protein；ki-67 protein；hypertrophic scar；keloid
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是临床上最常见的病理性瘢痕，其形成机制仍不十分清楚。近年来研究表明，病理性瘢痕的形成是以细胞的增生和凋亡失衡为基础的[1-2]。深入研究细胞增殖和凋亡在病理性瘢痕形成中的作用，将有利于揭示其发病机制。P27kipl 是一种广谱的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，是G1/S期限制的重要调控分子。ki-67是被公认的反映细胞增殖活性的标志物。我们应用免疫组化方法，检测了增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中P27kipl、 ki-67蛋白的表达情况，并与成熟瘢痕；正常皮肤作了比较，初步探讨P27kipl、ki-67的表达与病理性瘢痕形成的关系，为瘢痕的防治提拱一定实验依据。
1材料和方法
1.1 组织标本：瘢痕疙瘩标本18例，其中男性11例，女性7例，年龄4～37岁，平均21岁。部位：胸骨前10例，面颈肩部4例，耳垂部和臀部4例。术前均未做化疗和放疗，1年内无局部注射、外用药物，瘢痕局部无治疗；增生性瘢痕42例，男26例，女16例，年龄3～47岁，所取部位与瘢痕疙瘩基本相近；同时于手术时取瘢痕周围正常皮肤50例；另取成熟瘢痕组织40例，瘢痕病程均为6个月以上，最长123个月，平均16个月，均经临床和病理确诊，无恶性变。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，贴于涂有0.05%多聚赖氨酸的载玻片备用。
1.2 主要试剂：鼠抗人P27kipl 单克隆抗体（ZM-03040）、鼠抗人ki-67单克隆抗体（ZM-0165）、SP免疫组化超敏染色试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自福州迈新生物技术公司）。
1.3 方法：标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，作SP法免疫组化染色。用已知的上述抗体染色阳性的组织作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。SP法参试剂盒的说明进行。
1.4 结果判定：①P27kipl 阳性细胞为细胞核、细胞质都有着色，胞质染色稍深，有时可见胞质中成云团状的深染区。ki-67阳性细胞呈棕褐色定位于细胞核。每例随机计数10个高位视野（×400），确定每一个视野的阳性率（每个视野计数500个成纤维细胞或皮肤基底细胞，取平均数，即为阳性细胞数）；②P27kipl 染色判断标准参照文献[3]：阳性表达细胞数≤10%为0分，10%～30%为1分，30%～60%为2分，>60%为3分；阳性细胞表达的着色深度：基本不差色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分，两者得分相乘，少于1分的病例判定为表达阴性，其余的病例判定为表达阳性。ki-67： 根据阳性细胞数所占百分率,得出标记指数(labeling index,LI)。
1.5 统计学处理：P27kipl染色差异采用χ2 检验, 不同组别ki-67及P27kipl与ki-67相互关系采用t检验，应用SPS11.5的软件包对数握进行统计和分析。
2结果
2.1 P27kipl、ki-67蛋白在瘢痕和正常皮肤组织中的表达情况：见表1、表2。
2.2 免疫细胞化学染色结果发现，P27kipl蛋白在瘢痕组织、正常细胞细胞核、细胞质都有着色，胞质染色稍深，有时可见胞质中成云团状的深染区（如图1、图2），P27kipl蛋白在病理性瘢痕组织中表达与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异（P=0.036）。
2.3 ki-67阳性表达于细胞核，呈颗粒状的棕黄色（如图3、图4），ki-67在成熟瘢痕、正常皮肤几乎不表达，在病理性瘢痕组织中的表达与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异(P<0.000)，增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中P27kipl和ki-67蛋白表达有显著性差异（P<0.000）,根据实验结果，可推断 P27kipl蛋白与ki-67蛋白表达水平呈负相关。
3讨论
真核细胞周期的进程由许多因子调控，其中最令人注目的是细胞周期蛋白（cyclins）、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和CDKs抑制剂（CKIs）构成的复杂的调控体系。CKIs根据结构和功能的不同可分为两大家族：特异性地与CDK4和CDK6结合并发挥抑制作用的INK4（inhibitors of CDK4）家族和具有更加广谱的抑制活性的CIP/KIP（cdk-interacting protein/kinase inhibitor protein）家族[4]。P27kipl 是CIP/KIP家族的重要成员，1994年由Polyak等[5]在转化生长因子β(TGF-β)和细胞接触抑制导致的静止细胞抽提物中发现。大量的体内和体外实验表明，P27kipl是一种广谱的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，它能够与多种Cyclin-CDKs复合物结合并抑制其活性,是细胞G1/S期限制点（restriction point）的重要效应分子，对细胞周期具有负调控作用，P27kipl低表达必然导致对细胞周期进展抑制不力[6]。ki-67是在细胞G1、S、G2、M期出现的核抗原，表达的高低直接反映了细胞增殖状态[7]。本实验结果显示，P27kipl蛋白在病理性瘢痕组织中的表达降低，与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异；ki-67蛋白在病理性瘢痕组织中表达较高，与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异，在瘢痕组织中P27kipl 蛋白表达与ki-67蛋白呈负相关。综上所述，病理性瘢痕组织中P27kipl蛋白表达水平的下降或功能性失活可能导致了细胞周期的负性调控机制出现异常，Cyclin-CDKs等正性调控因子的作用不能被充分拮抗，细胞周期不断循环，从而导致包括成纤维细胞在内的组织修复细胞异常增殖分化，形成病理性瘢痕。
由于P27kipl很少发生基因突变，其mRNA的水平在整个细胞周期也基本恒定，导致P27kipl蛋白水平下降的原因主要是翻译后机制：①P27kipl蛋白的降解增加。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,SKP2）依赖性的泛素-蛋白酶体途径是P27kipl蛋白降解的主要途径，这个途径由cyclin E-cdk2对P27kipl适当位点的磷酸化启动[8]。我们已实验证实，SKP2在病理性瘢痕组织中表达升高，与P27kipl呈负相关，并发表于2005年第6期《中华整形外科杂志》；②P27kipl的亚细胞定位发生变化。P27kipl只有在细胞核中才能发挥其对CDK的抑制作用，参与P27kipl胞内转运的机制至今尚未明确，有研究[9]提示Jabl、Ser10的磷酸化状态以及D类周期蛋白的“扣留”作用都与此有关。以上机制均有待于进一步深入探讨。
病理性瘢痕的发生与肿瘤一样是多步骤、多阶段的演进过程，本研究结果显示P27kipl 蛋白在病理性瘢痕组织中表达水平较正常皮肤、成熟瘢痕组织高，与ki-67蛋白呈负相关，提示P27kipl可能参与了成纤维细胞的分化，增生或表型转化，在瘢痕形成过程中起着重要作用。深入探讨P27kipl蛋白表达水平下降的原因及其与其他癌基因和抑癌基因在瘢痕形成中的确切激活机制和相互作用，不仅有助于认识其成因和发展规律，而且有可能为瘢痕治疗提供一个新思路。
[参考文献]
[1]Haverstock BD. Hypertrophic scars and keloids[J]. Clin Pediatr Med Surg,2001,18(1):147.
[2]陈 伟，付小兵，孙同柱，等. 增生性瘢痕组织中转化因子-B异构体与受体与受体含量变化及对瘢痕形成的影响[J]. 中国修复重建外科杂志，2002,16(4):252.
[3]Yang G,Ayala G ,Marzo AD, et al. Elevated Skp2 protein expression in human prostate cancer: association with loss of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 and PTEN and with reduced recurrence-freesurviveal[J]. Clin Res,2002,8:3419-3426.
[4]张玉霞.细胞周期调控研究进展[J].国外医学遗传学分册，2001，24(5):262.
[5]Polyak K,Kato J ,Solomon M, et al. P27kipl, a cyclin-CDK inhibitor; links transforming growth factor-B and contact inhibition to cell cycle arrest[J]. Genes Dev,1994,8:9.
[6]Fero ML,Randel E, Gurley KE, et al .The murine gene P27kipl is haplo insufficient for tumour suppression[J]. Nature,1998,396:177-180.
[7]Slaven HB, Iversen OE, Akslen LA. Prognostic significance of an-giognesis and ki-67, p53 and p21 expression: a population-based endometrial carcinoma study[J]. J Clin Oncol, 1999,17:1382.
[8]Vlach J, Hennecke S, Amati B. Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor P27kipl[J]. EMBO J,1997,16(17)：5334.
[9]LloyaRV, EncksonLA,JinL,et al.P27kipl :AMultifunctional Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor with Prognostic Significance in Hu-man Cancers[J]. Am J Pathol,1999,154(2):313.
[收稿日期]2006-12-12[修回日期]2008-09-25
编辑/张惠娟
[关键词]P27kipl蛋白；ki-67蛋白；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩
[中图分类号]Q813 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）10-1477-03
Expression and significance of P27kipl and ki-67 protein in pathological scar
WU Wen-yi,ZHU Shi-ze,WU Rui-lan,ZOU Cheng-hao,WANG Zhao-yang,HUANG Zhong-xin
(Departent ofPlastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou362000,Fujian,China)
Abstract:ObjectiveTo study the expression of P27kipl and ki-67 in the pathological scars and their reaction-ship and to investigate its role and its possible mechanism in the pathogenesis of abnormal scars.MethodsImmunohistochemiscal technique was performered to detect the expression and distribution of P27kipl and ki-67 protein in hypertrophic scar (42cases), keloid (18cases), normal scar (40 cases) and normal skin (50cases),statistics was used to analyze the data.ResultsThe positive rate of P27kipl and ki-67 protein expression were remarkably significant in comparison between normal scar and abnormal scar(P<0.05). In pathological scar the protein of P27kipl and ki-67 showed a strong inverse correlation (P<0.000). ConclusionLow expression of P27kipl and high expression of ki-67 may play an important role in the proliferation of fibroblasts and in the pathogenesis of pathological scar.
Key words: P27kipl protein；ki-67 protein；hypertrophic scar；keloid
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是临床上最常见的病理性瘢痕，其形成机制仍不十分清楚。近年来研究表明，病理性瘢痕的形成是以细胞的增生和凋亡失衡为基础的[1-2]。深入研究细胞增殖和凋亡在病理性瘢痕形成中的作用，将有利于揭示其发病机制。P27kipl 是一种广谱的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，是G1/S期限制的重要调控分子。ki-67是被公认的反映细胞增殖活性的标志物。我们应用免疫组化方法，检测了增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中P27kipl、 ki-67蛋白的表达情况，并与成熟瘢痕；正常皮肤作了比较，初步探讨P27kipl、ki-67的表达与病理性瘢痕形成的关系，为瘢痕的防治提拱一定实验依据。
1材料和方法
1.1 组织标本：瘢痕疙瘩标本18例，其中男性11例，女性7例，年龄4～37岁，平均21岁。部位：胸骨前10例，面颈肩部4例，耳垂部和臀部4例。术前均未做化疗和放疗，1年内无局部注射、外用药物，瘢痕局部无治疗；增生性瘢痕42例，男26例，女16例，年龄3～47岁，所取部位与瘢痕疙瘩基本相近；同时于手术时取瘢痕周围正常皮肤50例；另取成熟瘢痕组织40例，瘢痕病程均为6个月以上，最长123个月，平均16个月，均经临床和病理确诊，无恶性变。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，贴于涂有0.05%多聚赖氨酸的载玻片备用。
1.2 主要试剂：鼠抗人P27kipl 单克隆抗体（ZM-03040）、鼠抗人ki-67单克隆抗体（ZM-0165）、SP免疫组化超敏染色试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自福州迈新生物技术公司）。
1.3 方法：标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，作SP法免疫组化染色。用已知的上述抗体染色阳性的组织作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。SP法参试剂盒的说明进行。
1.4 结果判定：①P27kipl 阳性细胞为细胞核、细胞质都有着色，胞质染色稍深，有时可见胞质中成云团状的深染区。ki-67阳性细胞呈棕褐色定位于细胞核。每例随机计数10个高位视野（×400），确定每一个视野的阳性率（每个视野计数500个成纤维细胞或皮肤基底细胞，取平均数，即为阳性细胞数）；②P27kipl 染色判断标准参照文献[3]：阳性表达细胞数≤10%为0分，10%～30%为1分，30%～60%为2分，>60%为3分；阳性细胞表达的着色深度：基本不差色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分，两者得分相乘，少于1分的病例判定为表达阴性，其余的病例判定为表达阳性。ki-67： 根据阳性细胞数所占百分率,得出标记指数(labeling index,LI)。
1.5 统计学处理：P27kipl染色差异采用χ2 检验, 不同组别ki-67及P27kipl与ki-67相互关系采用t检验，应用SPS11.5的软件包对数握进行统计和分析。
2结果
2.1 P27kipl、ki-67蛋白在瘢痕和正常皮肤组织中的表达情况：见表1、表2。
2.2 免疫细胞化学染色结果发现，P27kipl蛋白在瘢痕组织、正常细胞细胞核、细胞质都有着色，胞质染色稍深，有时可见胞质中成云团状的深染区（如图1、图2），P27kipl蛋白在病理性瘢痕组织中表达与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异（P=0.036）。
2.3 ki-67阳性表达于细胞核，呈颗粒状的棕黄色（如图3、图4），ki-67在成熟瘢痕、正常皮肤几乎不表达，在病理性瘢痕组织中的表达与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异(P<0.000)，增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中P27kipl和ki-67蛋白表达有显著性差异（P<0.000）,根据实验结果，可推断 P27kipl蛋白与ki-67蛋白表达水平呈负相关。
3讨论
真核细胞周期的进程由许多因子调控，其中最令人注目的是细胞周期蛋白（cyclins）、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和CDKs抑制剂（CKIs）构成的复杂的调控体系。CKIs根据结构和功能的不同可分为两大家族：特异性地与CDK4和CDK6结合并发挥抑制作用的INK4（inhibitors of CDK4）家族和具有更加广谱的抑制活性的CIP/KIP（cdk-interacting protein/kinase inhibitor protein）家族[4]。P27kipl 是CIP/KIP家族的重要成员，1994年由Polyak等[5]在转化生长因子β(TGF-β)和细胞接触抑制导致的静止细胞抽提物中发现。大量的体内和体外实验表明，P27kipl是一种广谱的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，它能够与多种Cyclin-CDKs复合物结合并抑制其活性,是细胞G1/S期限制点（restriction point）的重要效应分子，对细胞周期具有负调控作用，P27kipl低表达必然导致对细胞周期进展抑制不力[6]。ki-67是在细胞G1、S、G2、M期出现的核抗原，表达的高低直接反映了细胞增殖状态[7]。本实验结果显示，P27kipl蛋白在病理性瘢痕组织中的表达降低，与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异；ki-67蛋白在病理性瘢痕组织中表达较高，与其在正常皮肤、成熟瘢痕中的表达有显著性差异，在瘢痕组织中P27kipl 蛋白表达与ki-67蛋白呈负相关。综上所述，病理性瘢痕组织中P27kipl蛋白表达水平的下降或功能性失活可能导致了细胞周期的负性调控机制出现异常，Cyclin-CDKs等正性调控因子的作用不能被充分拮抗，细胞周期不断循环，从而导致包括成纤维细胞在内的组织修复细胞异常增殖分化，形成病理性瘢痕。
由于P27kipl很少发生基因突变，其mRNA的水平在整个细胞周期也基本恒定，导致P27kipl蛋白水平下降的原因主要是翻译后机制：①P27kipl蛋白的降解增加。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,SKP2）依赖性的泛素-蛋白酶体途径是P27kipl蛋白降解的主要途径，这个途径由cyclin E-cdk2对P27kipl适当位点的磷酸化启动[8]。我们已实验证实，SKP2在病理性瘢痕组织中表达升高，与P27kipl呈负相关，并发表于2005年第6期《中华整形外科杂志》；②P27kipl的亚细胞定位发生变化。P27kipl只有在细胞核中才能发挥其对CDK的抑制作用，参与P27kipl胞内转运的机制至今尚未明确，有研究[9]提示Jabl、Ser10的磷酸化状态以及D类周期蛋白的“扣留”作用都与此有关。以上机制均有待于进一步深入探讨。
病理性瘢痕的发生与肿瘤一样是多步骤、多阶段的演进过程，本研究结果显示P27kipl 蛋白在病理性瘢痕组织中表达水平较正常皮肤、成熟瘢痕组织高，与ki-67蛋白呈负相关，提示P27kipl可能参与了成纤维细胞的分化，增生或表型转化，在瘢痕形成过程中起着重要作用。深入探讨P27kipl蛋白表达水平下降的原因及其与其他癌基因和抑癌基因在瘢痕形成中的确切激活机制和相互作用，不仅有助于认识其成因和发展规律，而且有可能为瘢痕治疗提供一个新思路。
[参考文献]
[1]Haverstock BD. Hypertrophic scars and keloids[J]. Clin Pediatr Med Surg,2001,18(1):147.
[2]陈 伟，付小兵，孙同柱，等. 增生性瘢痕组织中转化因子-B异构体与受体与受体含量变化及对瘢痕形成的影响[J]. 中国修复重建外科杂志，2002,16(4):252.
[3]Yang G,Ayala G ,Marzo AD, et al. Elevated Skp2 protein expression in human prostate cancer: association with loss of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 and PTEN and with reduced recurrence-freesurviveal[J]. Clin Res,2002,8:3419-3426.
[4]张玉霞.细胞周期调控研究进展[J].国外医学遗传学分册，2001，24(5):262.
[5]Polyak K,Kato J ,Solomon M, et al. P27kipl, a cyclin-CDK inhibitor; links transforming growth factor-B and contact inhibition to cell cycle arrest[J]. Genes Dev,1994,8:9.
[6]Fero ML,Randel E, Gurley KE, et al .The murine gene P27kipl is haplo insufficient for tumour suppression[J]. Nature,1998,396:177-180.
[7]Slaven HB, Iversen OE, Akslen LA. Prognostic significance of an-giognesis and ki-67, p53 and p21 expression: a population-based endometrial carcinoma study[J]. J Clin Oncol, 1999,17:1382.
[8]Vlach J, Hennecke S, Amati B. Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor P27kipl[J]. EMBO J,1997,16(17)：5334.
[9]LloyaRV, EncksonLA,JinL,et al.P27kipl :AMultifunctional Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor with Prognostic Significance in Hu-man Cancers[J]. Am J Pathol,1999,154(2):313.
[收稿日期]2006-12-12[修回日期]2008-09-25
编辑/张惠娟